甜瓜組織培養及遺傳轉化研究進展

摘 要：概述了甜瓜組織培養過程中外植體類型、培養基組成、添加物等主要因素對植株再生的影響，以及甜瓜體細胞胚狀體發生途徑、單倍體、原生質體培養的研究現狀和根癌農桿菌介導甜瓜遺傳轉化的研究進展。

關鍵詞：甜瓜；組織培養；遺傳轉化

1、組織培養技術研究

甜瓜(CucumiS，melo L)是葫蘆科甜瓜屬植物中一種重要的瓜類作物，在我國瓜類作物栽培中占有較大種植面積。隨著基因工程技術在農作物育種中的研究與應用，甜瓜組織培養技術的開展為分子輔助育種奠定了良好的基礎。

1.1 外植體基因型

選擇不同甜瓜品種進行組織培養研究，外植體基因型差異對再生率影響明顯，繁殖系數差異較大。對古拉巴、蜜翠等4個引進雜交種和七寶甜瓜、小麥瓜等4個農家品種進行的子葉培養結果表明：雜交種的不定芽誘導率高于本地品種。厚皮甜瓜狀元、伊麗莎白和薄皮甜瓜新玉、白玉的子葉再生能力不同，薄皮甜瓜較厚皮甜瓜容易再生。Galperin等選用30份材料研究，表明甜瓜器官的再生能力存在著基因型的差異，有2個不完全顯性位點決定著器官發生能力。厚皮甜瓜綠寶石和薄皮甜瓜甘甜1號子葉誘導不定芽和愈傷組織分化上存在較大差異。黃河蜜、綠寶石、黃醉仙等6個厚皮甜瓜品種子葉分化頻率差異顯著，綠寶石分化率高達100％，而白蘭瓜只有6.67％，皇后再生性能各方面都弱于F7－3品種。國內許多研究結果也表明：薄皮甜瓜較厚皮甜瓜再生能力強，雜交品種再生能力較自交系強。

1.2 外植體部位

甜瓜組織培養研究中，不同基因型品種的幼嫩于葉都可得到較高頻率的再生不定芽，而真葉、胚軸、莖尖等部位再生頻率很低，甚至不能再生。鄧向東等研究了S 24和網紋香品種不定芽的誘導率為：子葉柄>子葉>莖尖>真葉。而胚軸和根不能誘導出不定芽。狀元頂芽和側芽經初代培養、增殖培養，可得到300％的試管苗。朱麗亞甜瓜的種子、莖段及彌河銀瓜的莖段可在不同培養基中分化形成小植株。甜瓜DG-1頂芽和帶側芽的莖段在適宜培養基中不定芽的增殖系數為1.5～3.2。

1.3 外植體生理狀態

無菌苗子葉的苗齡是其能否分化誘導成功的決定因素之一，對不同甜瓜品種的子葉進行分化誘導時，選擇的苗齡不完全一致。苗齡5～10d的哈密瓜品種網紋香子葉柄愈傷組織誘導率為100％，而不定芽則是5～8d苗齡的誘導率較高，為38.1％和30.4％，苗齡10d不定芽誘導率為0。河套蜜瓜苗齡5d的無菌苗的子葉經60－70d的誘導分化培養，再生植株誘導率可達55％。伊麗莎白種子在25℃暗培養3d后切取子葉進行培養。芽的誘導率高達90％。將雜種甜瓜西薄洛托10d左右苗齡的無菌苗接種在適宜培養基中，15d后調查不定芽的繁殖系數為1.4～3.8。將日本厚皮甜瓜春豐1號苗齡7－10d的無菌苗單節切段培養，試管苗的繁殖系數為10～13d。馬國斌等研究了紅心脆、皇后、黃旦子、醉仙4個品種2～10d苗齡的子葉再生能力，各品種均以2d苗齡的子葉不定芽分化率最高。取蜜翠F₁代種子5～6d的無菌苗子葉頂芽接種誘導，在適宜培養基上的繁殖系數達3.9～5.1。美麗娜網紋甜瓜種子在暗、光交替條件下培養25d獲得無菌苗，子葉誘導不定芽的增殖系數為5.4。黃旦子5d苗齡的幼苗子葉不定芽平均誘導分化率為44.8％。

1.4 培養基成分和生長調節劑的種類及比例

基本培養基、生長調節劑種類及其配比是影響植物細胞脫分化和再分化的關鍵因素之一，特別是細胞分裂素與生長素的比例搭配，直接影響細胞分化方向及成敗。由于甜瓜的離體分化存在基因型依賴性及外植體差異，不同品種、不同類型、同一品種不同部位、同一品種不同研究者獲得的分化率和適宜培養基不盡相同。

甜瓜組織培養中常用的基本培養基為MS培養基，添加的激索是不同比例的6-BA和NAA，部分研究應用了Miller、B₅、Ls等培養基及IAA、IBA、ZT、KT、2，4－D等激素。網紋香和S－24 2個品種應用了6－BA、ZT、KT、2ip、2，4-D 5種激素進行誘導。其中6－BA誘導效果最好，其最適質量濃度為0.5mg／L，低于0.1mg／L和高于1.0 mg／L時均不能產生不定芽。將河套蜜瓜子葉在MS+6－BA0.1mg／L＋NAA 1.0mg／L的培養基中預培養3d后轉入MS＋ZT 6.0mg／L芽誘導培養基中，在MS＋6－BA 0.5mg／L培養基中生根，再生植株誘導率可達55％㈣。伊麗莎白子葉誘導培養基為BM3＋IAA 15mg／L＋KT 6.0mg／L＋CuSO₄·5H₂O 1.0mg／L，而于喜艷等將伊麗莎白子葉接種在MS＋6－BA 2.0 mg／L＋IAA 0.2mg／L培養基中分化率最高。古拉巴等雜交種和七寶甜瓜等地方品種在MS＋6－BA 0.5mg／L＋IAA 0.05mg／L培養基中叢生芽誘導率最高，MS＋IAA0.2m／L＋NAA 0.5 mg／L培養基生根效果最好。彌河銀瓜在MS＋BA 1.0～1.5mg／L＋IBh 0.2mg／L培養基上獲得了最高的不定芽再生率，在1／2 MS＋IAA 0.2 mg／L培養基生根率達100％。翠蜜不定芽分化培養基中6－BA濃度范圍為0～1.0 mg／L，生長素選用0～1.0 m／L的NAA。當6－BA濃度大于10mg／L時幼苗玻璃化現象嚴重：在1／2 MS＋IAA 02mg／L培養基上生根率達100％。古拉巴等8個甜瓜品種的子葉節接種啟動培養基為MS＋BA 2.0 m／L＋IAA 1.0mdL，誘導培養基為MS＋BA 0.5 mL＋+IAA 0.2 m以，伸長和生根培養基為MS＋BA 0.05mg／L＋IAA 0.02mg／L，1／2 MS+IAA 0.02mg／L，每個外植體可獲得7.2-15.2個不定芽，生根率為91％，馴化成活率在90％以上。將皇后等4個品種的未熟子葉塊在MS＋6－BA 0～2.5mg／L的培養基上培養，其叢生芽誘導率可達89％，在MS基本培養基中附加硝酸銀和活性碳有利于根的誘導。美麗娜網紋甜瓜子葉在MS＋BA 0.4 mg／L＋IAA 0.1mg／L培養基上，不定芽增殖系數達5.4，在MS＋NAA 0.1mg／L培養基上生根率達100％。皇后和K7－3的子葉在加入不同濃度6－BA的MS培養基上繼代培養，結果顯示1.0mg／L的6－BA是誘導不定芽／的最佳激素濃度。厚皮甜瓜黃旦子子葉在MS＋6－BA2.0mg/L培養基上培養，其芽誘導率為44.8％，在MS＋6－BA0.05mg／L的芽伸長培養基上生長后，移入1／2 MS＋IAA 0.5mg／L培養基上生根，生根率為99％。厚皮甜瓜綠寶石在6－BA 2.0mg／L幾的分化培養基上培養，不定芽誘導率達93.75％；薄皮甜瓜甘甜1號在6－BA 2.0、1.0 mg／L的分化培養基上培養，不定芽誘導率均為100％：隨6－BA濃度提高，外植體玻璃化、褐化程度加重。由此看來。6－BA對甜瓜不定芽的誘導分化具有重要作用，但由于基因型差異的影響，對不同甜瓜品種進行離體誘導分化時，應設置不同的濃度梯度，篩選適宜的濃度范圍，與生長素進行配比，提高再生率。

1.5 其他添加物

在培養基中添加一些生長調節劑能夠影響外植體的再生。田長恩研究發現，培養基中附加BR會抑制甜瓜子葉離體培養中不定根和不定芽的誘導再生，但對不定根的抑制作用不同于不定芽。鄧向東等研究發現，培養基中附加馬鈴薯提取液不影響S－24的誘導效果：但對網紋香品種有極顯著的效果，附加10／L馬鈴薯的培養基不定芽的誘導率顯著高于含20g／L和不含馬鈴薯的培養基。在十條筋甜瓜子葉分化培養基中添加肉桂酸、香草酸、苯甲酸、阿魏酸、咖啡酸作為抑制劑，分化過程中抑制了系統內木質素合成。不定芽的發生相應受到明顯抑制，它們之間的關系非常密切。田長恩等研究測定了十條筋甜瓜不定芽發生過程中腐胺(Put)、亞精胺(Spd)、精胺(Spm)的含量，并研究了外源Put合成抑制劑D－精氨酸(D-Arg)和Spd、Spm合成抑制劑對不定芽發生和發生過程中可溶性蛋白含量、過氧化物酶活性的影響，結果表明，Put、Sod、Spm都與甜瓜子葉不定芽發生有關。三者含量的改變已影響到可溶性蛋白含量、過氧化物酶活性等生理生化指標的變化。最終影響到形態的發生。

總之。甜瓜離體培養過程影響因素很多，培養條件如溫度、光照，培養過程中的光、暗交替處理，外植體大小、切取放置方向、繼代時間間隔、種子純度等均可影響到誘導分化率，其影響的程度和機理還有待于繼續研究探討。

2、其他離體培養技術研究

2.1 體細胞胚胎發生途徑

體細胞胚胎又稱不定胚、胚狀體。與不定芽再生相比，通過胚狀體形成再生植株具有數量多、速度快和再生植株完整等優點，因此人們嘗試通過體細胞胚胎發生的途徑獲得再生植株。尹俊等佇將河套蜜瓜子葉在添加了2，4－D、NAA、6－BA的MS培養基中培養，通過不同階段的轉接培養，獲得了較高頻率的成熟體胚，建立了較完善的河套蜜瓜胚狀體再生體系。徐方秀等剛將甜瓜n代金輝4～7 d苗齡的無菌苗的子葉塊接種在MS附加2，4－D、6－BA的培養基中，胚狀體發生率達到100％。以軟X射線(總輻射量650Gy)照射過Cu-cumis melo var，momordica植株上的雄花花粉與網紋甜瓜Cu－cumls melo var，reticulates Naud，去雄的雌花授粉，經雌核發育誘導形成單倍體胚。適宜培養基培養幼胚和單倍體植株的誘導率為0.6％和0.2％。

一些研究還發現，甜瓜體細胞胚胎發育過程中存在胚狀體畸形現象，如子葉缺失、超大、畸形以及多胚融合等；另外，在不同發育階段胚狀體有提前萌發現象，如只有下胚軸伸長而無葉片、子葉膨大而無根等。何歡樂等選用不同甜瓜品種進行不定胚誘導再生植株，再生過程中會發生染色體數目上的變異，各品種隨著繼代培養次數的增加，其染色體數目的變異率和變異幅度也隨之增加。但不同品種在相同繼代次數培養中的變異情況各不相同，在繼代培養時間不是很長時，其發生的變異株比較少。甜瓜體細胞再生過程中仍存在一些問題有待解決，如胚狀體發生頻率、胚狀體質量、胚狀體早熟、基因型的依賴等。相信隨著研究的深入，這些問題會得到解決。

2.2 單倍體及原生質體培養

與黃瓜、西瓜等葫蘆科植物相比較，對甜瓜單倍體培養的研究較少，且進展也較緩慢。最早的甜瓜花藥培養嘗試研究以失敗告終，利用未授粉子房或胚珠進行離體培養，誘導雌核發育產生單倍體在甜瓜上有成功報道。Gemesne等對甜瓜子房培養條件進行研究，并得到了單倍體植株；Ficcadenti等用相似的培養方法獲得了甜瓜單倍體植株，胚發生率高達36.4％，再生植株中單倍體發生率為15.4％。實踐證明，基因型對單倍體的誘導有顯著影響。陶正南對甜瓜花藥進行培養，經愈傷組織途徑誘導獲得了完整再生植株。但卻無相關再生植株倍性方面的研究。目前，甜瓜花藥培養存在基因型影響較大、花粉愈傷組織誘導率低、綠苗分化率低、染色體加倍技術不過關等問題，通過該途徑獲得甜瓜單倍體植株離實際應用還有一定距離。

孫勇如等用7個新疆甜瓜品系的無菌苗子葉游離原生質體接種在改良的Miller培養基上，得到了再生細胞的高頻率分裂，并比較了液體淺層培養、雙層培養、瓊脂糖看護培養等不同方法，發現由煙草瘤細胞B₆s₃看護的瓊脂糖珠培養，最適于新疆甜瓜子葉的原生質體培養。李仁敬等將新疆甜瓜和西瓜無菌苗子葉葉肉原生質體經PEG介導，在高Ca²+和高pH值條件下融合，得到遠緣屬間的體細胞雜種，用含P₅的瓊脂糖珠培養包埋雜種細胞并培養，獲得融合愈傷組織。林伯年[吲在不同種的西瓜、甜瓜之間應用原生質體電融合技術，獲得了重建細胞，形成了克隆愈傷組織，并采用Southern分子印跡雜交技術，有效檢測出原生質體異源融合克隆愈傷組織，但最終沒有獲得雜種再生植株。這一技術有待于繼續研究和完善。

3、遺傳轉化研究

有關甜瓜遺傳轉化研究較西瓜、黃瓜少，國外成功轉化的報道是將西瓜花葉病毒2號外殼蛋白基因導入甜瓜，我國對甜瓜遺傳轉化的研究多采用根癌農桿菌介導的葉盤法轉化，將黃瓜、西瓜病毒病外殼蛋白基因、番茄ACC合酶反義基因和ACC脫氨酶基因導入甜瓜，并進行了分子方面的檢測，取得了一些轉化成果(表1)。而這些研究多選用了哈密瓜、新疆甜瓜的生產用雜交種，材料范圍較窄。外源基因種類少。因此，甜瓜的轉化研究應擴大試驗材料和優良性狀目的基因，在品質改良，抗白粉病、霜霉病等方面開展研究，促進甜瓜轉基因研究的深入和發展。相信隨著研究者的不懈探索和分子生物學的發展，通過植物基因工程技術改良創新甜瓜種質有巨大的潛力，也為遺傳育種開辟了一條嶄新的途徑。