水溶性殼聚糖和殼寡糖的吸濕、保濕性能及對(duì)幾種致病菌的抑制作用研究

生物活性多糖作為功效性化妝品添加劑在化妝品中的應(yīng)用，是生物美容的一個(gè)重要方向。殼聚糖(Chitosan)作為一種自然界貯量豐富的天然活性多糖，是甲殼素（Chitin）脫乙酰后的產(chǎn)物，其分子內(nèi)同時(shí)存在游離的氨基和羥基，具有特殊的生理活性，尤其是在抗菌抑菌方面。然而殼聚糖是一高分子化合物，分子量通常在幾十萬至上百萬，且分子結(jié)構(gòu)緊密，因而不能溶于水等普通溶劑，難以被吸收利用，限制了其應(yīng)用。同殼聚糖大分子相比，殼寡糖具有: (1)較好的水溶性； (2)吸濕保濕性；(3)抗菌、抑菌功能。將殼寡糖和水溶性殼聚糖應(yīng)用于化妝品中，不僅能產(chǎn)生保濕、穩(wěn)定改善膚色、抗衰老和抗菌等功效外，還能祛除皮膚中過剩的重金屬離子。因此，殼寡糖和水溶性殼聚糖作為功效型化妝品添加劑有著廣闊的前景。本文就水溶性殼聚糖和三種不同分子量殼寡糖的吸濕、保濕性能及其對(duì)三種致病性菌銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、糞腸菌（Enterococcus faecalis）和肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia ）的抑制作用做了研究， 以期為殼聚糖在化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用提供依據(jù)。目前該方面的報(bào)道還未見到。

一、實(shí)驗(yàn)儀器和材料

1. 實(shí)驗(yàn)儀器

LDZX 40ＣＩ型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋(上海中安醫(yī)療器械廠)、DHG 9070Ａ型電熱恒溫干燥箱(上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、生化培養(yǎng)箱(國華電器)、SNCJ 1BU無菌操作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司)、DENSIMAT型細(xì)菌電比濁儀（法國生物梅里埃公司）。

2. 實(shí)驗(yàn)材料

（1）水溶性殼聚糖（自制，DD.85.3%，粒度100目，粘度30Mpa.s）；殼寡糖(分子量3000，5000，10000，DD.>95 %，自制。

（2）供試菌種：銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、糞腸菌（Enterococcus faecalis）和肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia ）均為標(biāo)準(zhǔn)菌株。

（3）瓊脂蛋白胨固體培養(yǎng)基（pH 7.3）

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 吸濕性和保濕性測定

室溫下，將殼寡糖樣品在干燥器中用五氧化二磷真空干燥12 小時(shí)。吸濕性試驗(yàn)直接用該干燥樣品。而保濕性試驗(yàn)則在干燥樣品中加入其質(zhì)量10 %的去離子水。

吸濕性測定：精確稱取0.5 g樣品兩份，分別加入直徑3 cm的稱量瓶中，將稱量瓶分別放置在兩個(gè)干燥器中，一個(gè)干燥器內(nèi)放有硫酸銨飽和溶液(相對(duì)濕度RH=81 %)，另一個(gè)干燥器內(nèi)放有飽和碳酸鈉溶液(RH=43 %)，放置時(shí)間為12、24、48小時(shí)，分別稱量樣品放置前質(zhì)量(Wo)和放置后質(zhì)量(Wn)。根據(jù)下式計(jì)算吸濕率:

其結(jié)果見圖1-2。

保濕性測定：室溫下，精確稱取0.5 g樣品兩份，分別加入直徑3 cm的稱量瓶中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為樣品量10 %的水。一個(gè)稱量瓶放置在預(yù)先裝有飽和碳酸鈉溶液(RH=43 %)的干燥器內(nèi)，另一個(gè)放入裝有干硅膠的干燥器內(nèi)。放置時(shí)間為12、24、48小時(shí)，分別稱量樣品放置后水份量Hn和添加水分量Ho。根據(jù)下式計(jì)算水分殘存率:

2. 抑菌實(shí)驗(yàn)

殼聚糖溶液的配制： 以1 %HAc為溶劑，配制濃度為1.2 %、1.0 %、0.8 %、0.6 %、0.4 %、0.2 %的水溶性殼聚糖及殼寡糖溶液，置于4 ℃冰箱中待用。

菌種的活化：受試菌種接種于固體培養(yǎng)基內(nèi)，在37 ℃ 活化24小時(shí)。

菌懸液的制備：將活化后的受試菌種用接種環(huán)挑取菌苔于生理鹽水中，稀釋成含菌數(shù)濁度約為0.5 Mcf左右的菌懸液備用。

抑菌測試方法（瓊脂擴(kuò)散紙片法）：將直徑為6 mm的圓形濾紙片放入濃度各不同的水溶性殼聚糖和殼寡糖溶液中一同高壓蒸汽滅菌（120 ℃、0.12 Mpa）20 分鐘。取各種菌懸液100 μL均勻涂抹在培養(yǎng)基平皿表面，用無菌鑷子將各濾紙片貼在各種含菌平皿上，每皿貼7個(gè)，分別對(duì)應(yīng)于 6個(gè)濃度及對(duì)照。本實(shí)驗(yàn)殼聚糖濃度設(shè)置分別為1.2 %、1.0 %、0.8 %、0.6 %、0.4 %、0.2 %。并以1 %的醋酸為對(duì)照， 對(duì)照樣除不加殼聚糖外，其他條件與加有殼聚糖的培養(yǎng)基一致。每種菌種重復(fù)3次試驗(yàn)，在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)，測定圓濾紙片的抑菌圈直徑。

如果抑菌劑能殺死或抑制皿中供試菌的生長，則在濾紙片的周圍會(huì)出現(xiàn)一個(gè)無菌生長的透明圈，即抑菌圈。以抑菌圈的直徑作為評(píng)定指標(biāo)，抑菌圈直徑越大，說明該抑菌劑對(duì)此種供試菌的抑制效果越好，反之則抑制效果越差。抑菌圈數(shù)據(jù)見表1-3 所示。

三、結(jié)果與討論

1. 水溶性殼聚糖和殼寡糖的吸濕性和保濕性

圖1、2為水溶性殼聚糖和殼寡糖的吸濕性和保濕性能隨時(shí)間的變化曲線。由圖可以看出，水溶性殼聚糖和殼寡糖都有一定的吸濕、保濕性能，但存在差異。水溶性殼聚糖的吸濕性、保濕性能強(qiáng)于殼寡糖；隨著殼寡糖分子量的降低，其吸濕、保濕性能增強(qiáng)。這可能是因?yàn)闅ぞ厶墙到夂蟮玫降乃苄詺ぞ厶呛蜌す烟堑木w結(jié)構(gòu)受到了破壞，分子狀態(tài)趨于松散，一些可與水分子親和的極性基團(tuán)如-OH、-NH2完全暴露和解離，更易與水分子形成氫鍵而結(jié)合大量水分。同時(shí)，由于大量的氫鍵相互作用，使得殼聚糖分子鏈相互交織成網(wǎng)狀，加之與水的氫鍵結(jié)合，起到很好的保水作用。相對(duì)于殼寡糖，水溶性殼聚糖的結(jié)構(gòu)受到的破壞程度更大，分子間和分子內(nèi)氫鍵的數(shù)量多，故其吸濕、保濕性能要優(yōu)于殼寡糖。其吸濕性和保濕性能稍遜于甘油。

2. 水溶性殼聚糖和殼寡糖的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1－3為水溶性殼聚糖和殼寡糖的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果表明，無論是水溶性殼聚糖還是殼寡糖都對(duì)以上被試菌具有抑制作用。水溶性殼聚糖對(duì)銅綠假單胞的抑制作用較其他兩種強(qiáng)。對(duì)于銅綠假單胞，分子量為5000的殼寡糖對(duì)其抑制作用較為明顯。而對(duì)糞腸菌和肺炎克雷伯菌，分子量為10000的殼寡糖其抑制效果較好。這可能與不同細(xì)菌的特性及組成有關(guān)。我們應(yīng)用透射電鏡研究了經(jīng)殼聚糖作用前后的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的超微結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)作用后的細(xì)菌細(xì)胞明顯變形，細(xì)胞壁破損，并有胞內(nèi)物質(zhì)的泄露，并通過生化分析儀得到了驗(yàn)證。另外還發(fā)現(xiàn)，即使是分子量高達(dá)100萬的殼聚糖，其也有一部分可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，只不過進(jìn)入量較低分子量殼聚糖少。說明殼聚糖對(duì)細(xì)胞壁的破壞是不可逆轉(zhuǎn)的。

水溶性殼聚糖和殼寡糖分子量更小，易于透過細(xì)菌胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，使其細(xì)胞內(nèi)部起生物活性的相關(guān)酶發(fā)生泄露，同時(shí)與帶負(fù)電荷的物質(zhì)如DNA相互作用，干擾DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮其抗微生物活性。水溶性殼聚糖和殼寡糖主要進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，而殼聚糖在細(xì)胞外發(fā)揮作用。所以當(dāng)殼寡糖進(jìn)入細(xì)菌胞膜后，推測可能有一部分被細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的酶降解或細(xì)菌利用，使其抗菌濃度和抗菌活性降低，使得殼寡糖較殼聚糖抗菌活性略低。但如果殼寡糖的分子量小到一定范圍時(shí)，其不僅對(duì)細(xì)菌沒有抑制作用，相反還有促進(jìn)作用，這也與我們以前的研究結(jié)論相一致。

四、 結(jié)論

1. 水溶性殼聚糖和殼寡糖都有一定的吸濕、保濕性能，但存在差異。水溶性殼聚糖的吸濕性、保濕性能強(qiáng)于殼寡糖；隨著殼寡糖分子量的降低，其吸濕、保濕性能增強(qiáng)。其吸濕、保濕性能與其氫鍵有關(guān)。

2. 水溶性殼聚糖和殼寡糖對(duì)銅綠假單胞菌、糞腸菌和肺炎克伯菌都有一定的的抑制作用，其抑菌作用強(qiáng)弱與分子量和濃度有關(guān)。

編輯/王允貞