煙粉虱感染白僵菌后的組織病理變化

劉　召　雷仲仁　花保禎　王　音　問錦曾　黃　虹

摘要病癥觀察表明，煙粉虱感染白僵菌96h后蟲體顏色變?yōu)樯罴t色。組織切片觀察表明，白僵菌處理后36 h，可在表皮下面觀察到芽生孢子。48 h后可在體內(nèi)觀察到明顯的菌絲段。60 h可以觀察到菌絲入侵到脂肪體中，96 h發(fā)現(xiàn)內(nèi)部組織器官病變，肌肉邊界變得模糊不清，體內(nèi)出現(xiàn)大量菌絲，120 h后菌絲突破體壁向外生長，132 h后形成菌絲層。

關(guān)鍵詞煙粉虱；白僵菌；致病性；組織病理變化

中圖分類號S 476．12

煙粉虱(Bemisia tabaci)屬同翅目粉虱科，小盼虱屬，是源于亞熱帶地區(qū)的一種刺吸性害蟲。在我國最早記錄于1949年，但是并沒有大規(guī)模危害成災(zāi)的報(bào)道。隨著新的生物型——B型煙粉虱的入侵和傳播，煙粉虱在我國許多地方大規(guī)模暴發(fā)并造成了嚴(yán)重危害，尤其對甘藍(lán)、青花菜、番茄、甜瓜、黃瓜等瓜果蔬菜和一些園林花卉作物如一品紅、菩提樹等危害最重。其危害方式主要是直接刺吸植物汁液，傳播植物病毒、分泌蜜露影響植物光合作用引發(fā)其他病害。

傳統(tǒng)的防治方式主要是化學(xué)防治，但是隨著殺蟲劑大規(guī)模頻繁使用，煙粉虱對農(nóng)藥的抗性不斷增加，既增加了防治成本，又污染環(huán)境，影響人們的身體健康，于是尋找可替代的生物殺蟲劑已經(jīng)刻不容緩。蟲生真菌是生物防治的一個(gè)重要組成部分，因其容易繁殖，對環(huán)境無污染，對溫血?jiǎng)游锇踩葍?yōu)點(diǎn)引起了人們的極大興趣。關(guān)于白僵菌對煙粉虱的防治，Wraigh等已經(jīng)進(jìn)行了初步篩選研究，發(fā)現(xiàn)其對煙粉虱有較好的致病性，LC₅₀。在50—150個(gè)／mm₅₀。Vicentini也進(jìn)行了相應(yīng)的研究。在美國、墨西哥和中美的一些國家，已經(jīng)開發(fā)出白僵菌的可濕性粉劑和懸浮劑進(jìn)行粉虱等害蟲的防治。但是關(guān)于白僵菌感染煙粉虱后，蟲體組織病理變化，一直未見有人報(bào)道，本文從本實(shí)驗(yàn)室收藏的白僵菌中篩選了一種毒力較高的菌株一加拿大1號，進(jìn)行了其感染煙粉虱后的組織病理變化研究，為白僵菌對煙粉虱的致病機(jī)理研究提供一些依據(jù)。

1材料與方法

1．1供試菌株

菌株加拿大1號為加拿大同行贈送。用薩氏培養(yǎng)基培養(yǎng)，獲得分生孢子粉，用無菌0．1％吐溫一80溶液配制成孢子懸浮液用于接種。

1．2供試蟲源

挑選4～5片葉的嫩甘藍(lán)苗，置于溫室內(nèi)用甘藍(lán)飼養(yǎng)的煙粉虱種群中，24 h后驅(qū)逐掉所有成蟲后取出放人(25i1)℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)，10 d后選取帶有約15頭／cm₂3齡煙粉虱幼蟲的葉片待用。

1．3試蟲處理

挑選約2 cm2的干凈甘藍(lán)葉片，以保證供試蟲數(shù)目約30頭。在孢子含量為1．2X10₇個(gè)／mL。的白僵菌懸浮液中浸泡30s后，置于吸水紙上自然風(fēng)干后，放人盛有凝固的瓊脂：水＝1：100的培養(yǎng)皿中。此后，每隔12 h取約10頭煙粉虱幼蟲待用。

1．4組織切片的制備

參照王音、黃東如等方法做適當(dāng)?shù)淖儎印悠吩诎?Bouins)固定液(飽和苦味酸水溶液75mL，40％甲醛25mL，冰醋酸25mL)中固定24h后，分別在50％和70％的乙醇溶液中沖洗數(shù)次至蟲體組織中的黃色完全褪去，然后保存于70％的乙醇中。經(jīng)70％～100％的梯度濃度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟后進(jìn)行常規(guī)石蠟切片，厚度為8 pm，在Olympus顯微鏡下觀察照相。

1．5煙粉虱感染后外部癥狀觀察

分別以孢子含量1．2X10₇、1．2X10₆、1．2X10₅個(gè)／mL接種煙粉虱3齡幼蟲各30頭。以后每天觀察煙粉虱幼蟲存活情況以及感染真菌后蟲體外部特征并將蟲尸保濕培養(yǎng)，直至蟲體長出白色菌絲，將菌絲挑至載玻片上進(jìn)行鏡檢確定其是否為白僵菌感染。

2結(jié)果與分析

2．1煙粉虱感染白僵菌后的外部癥狀觀察

煙粉虱感染白僵菌后，在前3天內(nèi)，蟲體顏色、形狀并無明顯變化。第4天可以觀察到感染的煙粉虱蟲體變?yōu)榭捎萌庋壑苯优c健康蟲體區(qū)分的紅褐色，與Wraight等觀察結(jié)果相吻合，但形狀仍為扁橢圓狀，無明顯變化。在濕度較低的條件下，蟲體慢慢變?yōu)楦稍锏谋馄綘睿瑴\黃色。若將其轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基上保濕，兩天后可見到白色菌絲長出。一般為腹部兩側(cè)最先長出菌絲，而頭部和尾部菌絲較少。若繼續(xù)培養(yǎng)可得到白僵菌的分生孢子。

2．2白僵菌入侵煙粉虱若蟲過程及組織病理變化

白僵菌接種到3齡煙粉虱幼蟲體表10h后就能萌發(fā)(另文發(fā)表)。36 h后，真菌即能人侵到蟲體內(nèi)，并在表皮下產(chǎn)生芽生孢子，體壁與內(nèi)部組織間出現(xiàn)間隙，同時(shí)內(nèi)部組織附近也開始出現(xiàn)芽生孢子(圖1a)。在48 h時(shí)，表皮下的芽生孢子生長為菌絲段并向體內(nèi)各個(gè)組織器官入侵(圖1b)。96 h時(shí)蟲體顏色發(fā)生明顯的變化，菌絲在體內(nèi)大量增加(圖1c)，肌肉等組織器官的邊界已經(jīng)變得模糊不清，脂肪體內(nèi)出現(xiàn)菌絲段(圖1d)，表皮下出現(xiàn)向外生長的菌絲(圖1e)。在120 h時(shí)菌絲就能成功的突破表皮向外生長(圖1f)，隨著量的增大，可能進(jìn)行再次侵染。

通過接菌不同時(shí)間的組織切片觀察表明：若蟲體表附著孢子萌發(fā)后產(chǎn)生定向生長的芽管，然后入侵到表皮內(nèi)部，在表皮下面產(chǎn)生芽生孢子。隨著時(shí)間延長，芽生孢子量增多，芽生孢子萌發(fā)為菌絲。菌絲對寄主組織的侵染通常沒有選擇性，部分菌絲可以沿表皮生長，而進(jìn)入血腔的菌絲通常就在血腔中繁殖，然后逐步入侵到各個(gè)組織器官中，受到侵染的組織逐步發(fā)生病變，使昆蟲解體死亡。

3討論

孢子附著到昆蟲體表后，孢子的萌發(fā)率以及芽管的生長速率在一定程度上決定著真菌入侵成功與否。James研究表明，煙粉虱表皮內(nèi)的脂類物質(zhì)對白僵菌的萌發(fā)有一定的抑制作用。作者觀察到孢子接種后10h就在體表附著并且萌發(fā)，芽管向表皮定向生長，表明白僵菌此時(shí)已經(jīng)打破了表皮脂類物質(zhì)對白僵菌萌發(fā)的抑制作用，成功地附著于體表；并且24h后就能觀察到表皮下面產(chǎn)生芽生孢子，說明白僵菌已經(jīng)成功地突破表皮入侵。而有的白僵菌株系對煙粉虱的毒力非常低，甚至沒有致病性，在接種后沒有看到孢子在蟲體上萌發(fā)，可能與表皮的脂類物質(zhì)對白僵菌孢子萌發(fā)的抑制作用，或者與白僵菌孢子的附著能力及萌發(fā)率有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)白僵菌侵染煙粉虱的主要途徑是表皮侵染，發(fā)生體色改變是由于在侵染過程中真菌產(chǎn)生了卵孢素，但是卵孢素的功能及其作用機(jī)理還需要進(jìn)一步研究。組織病理變化的觀察表明，發(fā)生體色改變時(shí)，菌絲在蟲體內(nèi)部已經(jīng)大量繁殖，蟲體大部分組織(肌肉、脂肪體)已經(jīng)發(fā)生病變，說明蟲體已經(jīng)開始解離死亡。