應(yīng)用尖孢鐮刀菌毒素濾液鑒定大豆品種抗病性初探

臺蓮梅　許艷麗　閆鳳云

摘要引起大豆根腐病的尖孢鐮刀菌粗毒素不僅能使大豆根部產(chǎn)生類似病菌侵染引起的癥狀，而且能抑制大豆幼根的生長和對大豆幼苗具有致萎作用；用毒素濾液處理大豆胚根和幼根，測定大豆不同品種抗病性，用盆栽土壤作對照，試驗(yàn)結(jié)果基本一致。利用毒素濾液測定不同品種對大豆根腐病的抗病性，可應(yīng)用于大量的初篩工作。

關(guān)鍵詞尖孢鐮刀菌；毒素；大豆；抗病性

中圖分類號S 432．23

大豆根腐病是大豆的重要病害之一，是一種分布較廣、危害較重、防治困難的土傳病害。我國大豆根腐病主要分布于黃淮地區(qū)的夏大豆和北方春大豆生產(chǎn)區(qū)，其中黑龍江省東北部地區(qū)發(fā)生較重。根腐病使大豆常年減產(chǎn)10％～30％，重病地區(qū)可減產(chǎn)60％。尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)是引起大豆根腐病的主要致病菌，目前對該病的防治主要是通過藥劑拌種，防效期一個月左右，而且只能防幼苗時期，防治效果不是十分理想。應(yīng)用抗病品種控制該病是首選的措施，但常規(guī)的抗性鑒定耗時費(fèi)工，易受環(huán)境條件影響。在研究了尖孢鐮刀菌產(chǎn)毒條件的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究用該毒素鑒定大豆品種抗病性，試圖探索出一種快速、簡便鑒定品種抗性的方法。

1材料與方法

1．1供試菌株

供試菌株從大豆病株上分離，并經(jīng)柯赫氏法則驗(yàn)證。

1．2供試品種

由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆研究所、綏化所、合江所、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所、黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)科研所等提供品種。

1．3大豆不同品種抗性鑒定

1．3．1病原菌擴(kuò)繁

菌株在PSA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)7d左右，再將病原菌接種到玉米砂培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)繁，于25℃培養(yǎng)25d左右，用作接菌。

1．3．2土壤接種

取田間自然土壤經(jīng)過篩后，用50倍的福爾馬林液進(jìn)行土壤消毒，1 m²澆1 000mL。

將三角瓶的玉米砂培養(yǎng)菌倒出，攪碎混勻，然后和無菌土按質(zhì)量比4：30的比例充分混合配成菌土。將接好菌的土裝人口徑15 cm的花盆內(nèi)，每盆土壤的量保持一致，播種前預(yù)先灌水保濕2～3 d，每盆播種10粒大豆種子，每一品種處理3盆。

1．3．3發(fā)病調(diào)查

在幼苗二出復(fù)葉展開時進(jìn)行病害調(diào)查。從土壤中取出苗，將根部沖洗干凈，調(diào)查病情指數(shù)。

病情分級標(biāo)準(zhǔn)為，0：幼苗莖基部和主、須根均無病斑；1：莖基部和主根上有少量病斑；2：莖基及主根上病斑較多，病斑面積占莖和根總面積的1／4—1／2；3：莖基部及主根上病斑多且較大，病斑面積占莖基部和根總面積的1／2～3／4；4：莖基部或主根上病斑連片，形成繞莖現(xiàn)象，但根系并未死亡；5：根系壞死，地上部萎蔫或死亡。

1．4毒素培養(yǎng)濾液制備及提取

菌株移接在PSA平板培養(yǎng)基上，于25℃下培養(yǎng)7d，沿菌落邊緣打出直徑為8cm菌片，接人裝有100mL培養(yǎng)液的250mL三角瓶內(nèi)，每瓶接4片，置25～30℃下光照培養(yǎng)15d。培養(yǎng)液經(jīng)過濾，再高溫滅菌20min，濾液保存在4℃冰箱內(nèi)，供測試用。毒素的提取采用炭吸附法提取。

1．5粗毒素的毒性測定

1．5．1毒素對大豆根部的致病性

挑選大小一致的大豆種子，用漂白粉浸種10min，進(jìn)行表面消毒。用無菌水清洗3遍后，加水置25℃恒溫箱浸泡4—5 h，然后于25℃下催芽，待胚根長4～5cm時，置于加有10mL毒素原液直徑為11 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，皿內(nèi)底部鋪一張濾紙，大豆上蓋一張濾紙，在25℃下恒溫處理48h，進(jìn)行癥狀觀察。另外，用菌絲塊接種于大豆胚根上，觀察發(fā)病情況。

1．5．2毒素對大豆胚根生長的影響

采用抑制胚根生長測定法。將供試的大豆種子用清水洗凈，用漂白粉溶液(1：14)浸種10 min，進(jìn)行表面消毒。用無菌水沖洗3遍后加水置25℃恒溫箱浸泡4—5 h，然后于25℃下催芽(待芽長2—3 mm為宜)，然后將大豆種子胚芽向下置于加有5mL濾液的培養(yǎng)皿內(nèi)，皿內(nèi)鋪一張無菌濾紙。以空白培養(yǎng)液處理為對照。25℃黑暗下培養(yǎng)，48 h后測定并計(jì)算胚根生長抑制率。每處理30粒種子，3次重復(fù)。

胚根生長抑制率＝[(對照胚根生長長度一處理胚根生長長度)／對照胚根生長長度]X100％。

1．5．3毒素對大豆幼苗的致萎性

取一出復(fù)葉剛展開的大豆幼苗，根系洗凈后切去一小段根，浸入裝有毒素溶液的試管中，毒素液內(nèi)含有少許鏈霉素，防止細(xì)菌污染。

觀察萎蔫情況。植株反應(yīng)級別分為無反應(yīng)、輕度反應(yīng)、中度反應(yīng)和重度反應(yīng)。其標(biāo)準(zhǔn)是：無反應(yīng)，植株正常，葉片無萎蔫；輕度反應(yīng)，真葉下垂或卷曲，復(fù)葉正常；中度反應(yīng)：真葉、復(fù)葉卷曲，重度反應(yīng)：整個葉片卷曲至枯死。

1．6培養(yǎng)濾液對大豆不同品種胚根生長的影響

方法同1．5．2。

1．7培養(yǎng)濾液對大豆不同品種幼根細(xì)胞透性的

影響

將大豆種子表面消毒后，浸種4—5 h，擺于鋪有無菌濾紙的磁盤內(nèi)(35cmX25cm)，置于25℃恒溫箱內(nèi)，培養(yǎng)3—4d，取長勢一致的幼根用于試驗(yàn)。

采用電導(dǎo)法測定細(xì)胞膜透性。

2結(jié)果與分析

2．1毒素的毒性測定

2．1．1毒素引起大豆根部的癥狀

用粗毒素接種后，毒素對大豆生長發(fā)育具有抑制作用，經(jīng)毒素液處理后的大豆根未形成側(cè)根，胚根變褐，壞死，產(chǎn)生的癥狀與病原菌接種所引發(fā)的癥狀相似。

2．1．2毒素對大豆胚根生長的影響

對毒素的不同濃度進(jìn)行了測定，當(dāng)毒素體積分?jǐn)?shù)分別為10％、25％、50％、75％、100％時，胚根抑制率分別為26．3％、49．2％、61．0％、64．2％、75．9％，表明毒素對大豆胚根生長有明顯的抑制作用，毒素濃度越高，抑制作用越強(qiáng)，見圖1。

2．1．3毒素對大豆幼苗的致萎性

不同的處理對大豆幼苗的致萎作用不同。結(jié)果見表1，處理24h，毒素液體積分?jǐn)?shù)為100％和50％使大豆植株的真葉下垂，葉緣輕微卷曲，復(fù)葉正常；處理48h后，100％毒素液中大豆真葉、一出復(fù)葉都卷曲；72h后，100％毒素液中的植株枯死，50％毒素液中大豆真葉、復(fù)葉萎蔫。無菌水及10％毒素液處理植株正常。

2．2培養(yǎng)濾液對大豆不同品種胚根生長的抑制

作用

低濃度培養(yǎng)濾液對大豆不同品種胚根抑制率存在著差異。毒素濾液的體積分?jǐn)?shù)為10％時，對抗病品種的胚根抑制率低于感病品種，抗性品種綏農(nóng)10對病原菌的抗性強(qiáng)，病指為20．8，對毒素也不敏感，培養(yǎng)濾液對它的胚根生長抑制率為28．8％。反之，感病品種對病原菌嚴(yán)重感病，病情指數(shù)高，培養(yǎng)濾液對它的胚根抑制率也高；然而隨著濾液體積分?jǐn)?shù)的提高，胚根抑制率相應(yīng)增高，品種間差異有縮小的趨勢。說明抗病品種只能忍耐一定濃度范圍的培養(yǎng)濾液毒素(表2)。

2．3培養(yǎng)濾液對大豆不同品種根細(xì)胞滲透性的

影響

50％毒素濾液處理不同品種大豆幼根后，根細(xì)胞的滲透性有明顯的不同。病菌接種后病情指數(shù)高的品種，用毒素濾液處理后其電導(dǎo)率較大；病情指數(shù)低的品種，毒素濾液處理后其電導(dǎo)率較小。在抗病品種和感病品種之間差異較大時，抗病品種和感病品種根細(xì)胞滲透性差異達(dá)極顯著水平(表3)。

3結(jié)論與討論

許多研究表明，用病原菌的毒素液進(jìn)行品種的抗病性鑒定是可行的。用毒素進(jìn)行品種抗病性鑒定具有快速、簡便、不受季節(jié)限制等特點(diǎn)。大豆根腐病是土傳病害，在田間條件下無法進(jìn)行人工接種，只能靠田間的自然菌量，其鑒定的結(jié)果常受土壤條件所影響，用盆栽土壤接種法，如大量篩選抗源，工作量非常大。采用尖孢鐮刀菌培養(yǎng)濾液處理大豆胚根測定不同品種的抗性，與盆栽土壤接種法結(jié)果基本一致。因此，此方法可用于抗病育種的大量初篩工作中，具有快速、省工等優(yōu)點(diǎn)。用種子胚根抑制法測定不同品種抗性，要注意一個問題：要選好毒素濾液的濃度，否則誤差較大。

劉惕若等用電導(dǎo)法測定小麥品種對赤霉病菌的抗性差異表現(xiàn)十分明顯，并提出鑒定小麥品種抗性的細(xì)胞膜損傷率的合理級別。本試驗(yàn)應(yīng)用電導(dǎo)法測定大豆幼根的細(xì)胞滲透性大小基本上反映了大豆品種對根腐病的抗性強(qiáng)弱，此法的優(yōu)點(diǎn)是快速、簡便，試驗(yàn)可在短期內(nèi)重復(fù)進(jìn)行，但它與毒素濾液處理大豆胚根相比，繁瑣一些。由于電導(dǎo)法非常靈敏，因此必須嚴(yán)格操作，避免或減少人為誤差，提高測定的準(zhǔn)確性。

應(yīng)用毒素進(jìn)行品種抗病性鑒定，抗性指標(biāo)的量化還有待于進(jìn)一步研究。