東北地區高毒力蘇云金芽孢桿菌ＨＢ－３菌株生物學特性研究

徐宜宏　紀明山　楊春喜　張　弘　于敬沂　

摘要從自然死亡的玉米螟幼蟲體內分離獲得一株對玉米螟高毒的蘇云金芽孢桿菌，編號為HB-3。該菌株產生菱形和方形兩種晶體蛋白。純化晶體及孢晶混合物的毒力測定結果表明，該菌株對玉米螟具有較高毒力，LC5。分別為5．82μg／mL和5．94μg／mL，對尖音庫蚊也有一定毒力，LC₅₀分別為16．59μg／mL和17．50／μg／mL。生理生化特性研究結果表明，HB-3與已知的蠟螟亞種(Bacillusthuringiensis subsp．galleriae)基本一致，血清型為H5ab。晶體蛋白的SDS-PAGE分析表明，HB-3菌株晶體蛋白至少由分子量為133kDa、65 kDa、45 kDa和23 kDa的4種多肽組成。

關鍵詞蘇云金芽孢桿菌；晶體蛋白；毒力測定；生物學

中圖分類號S 476．11

蘇云金芽孢桿菌(acillusthuringiensis，Bt)是一種革蘭氏陽性反應細菌，桿狀，能形成內生芽孢。該菌在自然界普遍存在，資源豐富，不同地理生態環境中其群體的分布特點、基因類型、殺蟲譜等具有多樣性。中國地域遼闊，地理、生態與氣候條件復雜，具有豐富的生物多樣性。作者從東北地區自然生態環境中死亡玉米螟幼蟲蟲體分離出一株殺玉米螟幼蟲和尖音庫蚊幼蟲的高毒力菌株，并對其形態、晶體蛋白、血清型分類及殺蟲毒力等生物學特性進行了系統的研究，研究結果如下。

1材料與方法

1．1供試菌株

標準菌株有蘇云金亞種(H₁)、幕蟲亞種(HH₁)以色列亞種(HH₁₄)、HD-l(HH_3ab)、阿萊亞種(HH_3ac)、鲇澤亞種(HH₇)、庫斯塔克亞種(HH_3abc)、猝倒亞種(HH_4ab)、蠟螟亞種(HH_5ab)。用于生理生化特性及H—血清型鑒定，均為本實驗室保存。蘇云金芽孢桿菌HB-3為本實驗室從自然死亡玉米螟幼蟲分離獲得。

1．2供試昆蟲

玉米螟(Ostrinia．furnacalis Guenee)初齡幼蟲、尖音庫蚊(Culexpipiem Linnaeus)3齡幼蟲，均為沈陽化工研究院農藥生物測定中心的室內飼養敏感品系。

1．3培養基和試劑

LB固體培養基：酵母浸膏0．5％、蛋白胨1．0％、瓊脂1．8％、NaCll．0％，pH7．0。LB液體培養基：酵母浸膏0．5％，蛋白胨1．0％，NaCl 1．0％，pH7．0。LB半固體培養基：酵母浸膏0．25％，蛋白胨0．5％，NaCl 0．5％，瓊脂0．2％一0．3％，pH7．0。晶體蛋白裂解液：10g／LSDS，2％p—巰基乙醇(體積分數)，6mol／L尿素，pH 10．0。

1．4培養與觀察

將冰箱保存的斜面菌種活化后接種到LB固體培養基中，30℃培養18—24h，觀察菌落生長情況；取25 mLLB液體培養基于250 mL三角瓶中并接種，置30℃恒溫搖床，230r／min振蕩培養8 h后涂片鏡檢。觀察菌體的運動性及鞭毛情況。

1．5伴胞晶體的分離純化及晶體蛋白濃度的測定

參照王瑛等的液體雙相法，進行伴孢晶體的分離和純化。發酵液中晶體蛋白濃度測定參照顧真榮，彭中允方法，將提純的晶體配成2．0 mg／mL濃度的母液，稀釋成一定梯度濃度后，經過離心處理，制成標準晶體液，用紫外吸收法測定ODH₂₈₀。值，繪制晶體量與光密度值的標準曲線。將發酵液制備成樣品晶孢液后按照標準晶體液的處理方法處理后，用紫外吸收法測定ODH₂₈₀值。

1．6生物測定

將純化晶體和孢晶混合物制成不同濃度的感染液，測定對玉米螟和尖音庫蚊的室內毒力。其中玉米螟的生物測定采用感染飼料法，每組供試幼蟲30頭，每個處理3次重復。于25℃飼養48h，調查死亡頭數，計算LC₂₈₀。尖音庫蚊的生物測定參照陳在餌等的方法進行，每組供試幼蟲30頭，每個處理3次重復。于25℃飼養48h，調查死亡數量，計算LC₅₀。

1．7生理生化試驗及H-血清型鑒定

按高秀梨方法進行。

1．8晶體蛋白SDS-PAGE電泳分析

SDS-PAGE凝膠制備參照F．奧斯伯的方法，濃縮膠和分離膠濃度分別為4％和10％。標準分子量蛋白組成為：116 kDa、66kDa、45kDa、25kDa和14kDa。在晶體樣品中加人等量的樣品緩沖液混勻，沸水煮3～5 min。10 000 r／min離心2 min，取上清液上樣。采用恒壓電泳，濃縮膠中電壓為100V；分離膠中電壓為150V。染色，脫色，根據標準蛋白計算分子量。

2結果

2．1形態與培養特征

HB-3菌株革蘭氏反應陽性，營養細胞桿狀，兩端鈍圓，單生、雙聯體或以雙聯體為單位連成短鏈狀，菌體大小(1．08～1．30)μmX(2．5～3．18)μm，芽孢橢圓形，孢囊微膨大，有的近中生，有的居于菌體一端(較少)，大小為(0．73—1．10)btmX(1．40～1．95)pm，晶體有菱形和方形兩種(圖1)，菱形晶體的大小為(0．72～0．85)pmX(1．02～1．36)μm，方形晶體大小為(1．07～1．19)μmX(1．06一1．23)μm，周生鞭毛，運動活躍。在平板培養基上培養，菌落為圓形，白色，邊緣不光滑，不透明。

2．2晶體蛋白濃度

在紫外分光光度計上測定樣品280 nm下的吸光值為0．748，根據標準曲線計算出其晶體蛋白濃度可達5．84mg／mL。

2．3毒力測定結果

通過生物測定方法考察了HB-3菌株的純化晶體和孢晶混合物對玉米螟、尖音庫蚊的毒力。該菌株對玉米螟有較高的毒力，純化晶體和孢晶混合物的LC₅₀。值分別為5．82μg／mL。和5．94μg／mL。對尖音庫蚊有一定的毒力。純化晶體和孢晶混合物的LC₅₀值分別為16．59μg／mL。和17．50μg／mL。(表1)。

2．4生理生化試驗及H—血清型鑒定結果

按照常規方法對菌株的10項生理生化性狀進行了研究，供試全部標準菌株基本都可重復原始性狀。結果見表2(附后)。

從表2中可以看出，HB-3菌株在其生長代謝過程中產生淀粉酶、蛋白酶、尿酶，不產生卵磷脂酶，可

以利用七葉靈、甘露糖、蔗糖、水楊苷、葡萄糖，并可生成色素。各項反應結果與標準菌株相比較，不難看出HB-3菌株與蠟螟亞種(Haab)的生化反應結果最為接近，僅菌膜的結果不一致。而與其他標準菌株相比則有較大差異。因此，初步斷定該菌株屬于蠟螟亞種。

采用標準菌株H₁—H₁₄與HB-3進行了交叉凝集試驗和交叉吸收試驗(表3)。

通過標準菌株H₁—H₁₄與HB-3的交叉凝集試驗發現，HB-3只與蠟螟亞種(Haab)發生凝聚反應。從而初步斷定HB-3菌株與蠟螟亞種(H_5ab具有相同的鞭毛抗原因子。從表3可以看出，HB-3與蠟螟亞種(H_5ab)發生凝集反應的凝集效價為20 480。從交叉凝集吸收試驗結果(表3)中可以看出標準抗血清H_5ab被HB-3菌株的鞭毛抗原飽和后，不再與標準菌株的鞭毛抗原發生凝集反應；同樣當HB-3菌株的抗血清被相應的標準菌株的鞭毛抗原飽和后，也不再與其本身的鞭毛抗原起反應。說明HB-3菌株與其相對應的標準菌株蠟螟亞種(H_5ab)具有完全相同的鞭毛抗原因子。因此，可以確定菌株HB-3屬蘇云金芽孢桿菌血清型H_5AB。

2．5晶體蛋白SDS—PAGE分析結果

通過與標準蛋白帶比較，可知HB-3菌株晶體蛋白主要由4種多肽組成，其分子量分別為133kDa、65 kDa、45 kDa和23 kDa(圖2)。根據查閱資料”1，產生菱形和方形晶體的Bt菌株，其晶體蛋白成分主要為130～140 kDa、70～80 kDa，因此認為133 kDa、65 kDa為該晶體蛋白的活性成分。

3討論

本研究從自然死亡的玉米螟幼蟲體內分離到的HB-3菌株不僅對鱗翅目昆蟲具有較高毒力，同時還對尖音庫蚊幼蟲也表現出一定的毒力，表明從自然界中的死亡蟲體中分離蘇云金芽孢桿菌是一種行之有效的方法，同時也說明從蟲尸內篩選高毒力菌株并不一定要從目標昆蟲體內分離。

關于晶體蛋白的提純方法普遍采用的主要有3種：液體雙相法、不連續蔗糖密度梯度離心法和堿裂解法。采用液體雙相分離法可以獲得理想純度的晶體，但影響該法提純純度的因素較多；應用不連續蔗糖密度梯度離心法提取晶體蛋白量較少且最適的蔗糖濃度梯度不易控制，孢晶混合物不能完全分離，而且離心時間長；堿裂解法操作簡便，時間短，蛋白提取量大，但蛋白純度較低，不適合晶體蛋白特性的研究，比較適合大量提取。

本試驗中認為133kDa、65kDa為該晶體蛋白的活性成分，主要根據喻子牛的《蘇云金芽孢桿菌制劑的生產和應用》一書中關于Bt伴胞晶體的毒力機理部分的相關說明。書中認為一般分子量為27kDa左右的多肽主要存在于不規則形伴胞晶體中，而該類晶體一般對鱗翅目無毒，對鞘翅目有高毒力，而根據本試驗觀察的晶體形態和毒力測定結果，初步認為譜帶中的23kDa的蛋白并不是該菌的活性成分。45kDa的蛋白多肽未見報道，因此認為分子量為45kDa和23kDa的蛋白可能是由于大分子量的蛋白降解引起的。

毒力測定結果表明，該菌株表明純化晶體的LC₅₀略高于孢晶混合物，說明該菌株的活性成分主要為晶體蛋白，芽孢低毒或無毒。這與很多已發表的研究成果有所不同，可能與菌株間存在的差異有關。