灰飛虱體內(nèi)沃爾巴克氏體生物學(xué)特性及其利用展望

仲崇翔　陳　建　喬　靜　楊益眾

摘要灰飛虱既是傳播水稻條紋葉枯病毒的媒介昆蟲，也是我國(guó)水稻上的主要害蟲。Wolbachia是存在于飛虱等多種昆蟲體內(nèi)的一類共生菌，它們能通過多種機(jī)制調(diào)節(jié)寄主的生殖，包括誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)不親和、孤雌生殖和遺傳上的雄性雌性化等。目前對(duì)這類微生物的研究已取得了重要進(jìn)展。本文綜述了Wolbachia在灰飛虱體內(nèi)的分布、傳播方式及其對(duì)灰飛虱種群的影響，并初步探討了利用其生物防治的可能性。

關(guān)鍵詞灰飛虱；Wolbachia；生物學(xué)；生物防治

中圖分類號(hào)S 435．131．49

沃爾巴克氏體(Wolbachia)是存在于節(jié)肢動(dòng)物體內(nèi)的一種立克次氏體細(xì)菌，其分類地位屬原核生物界、細(xì)菌門、變形菌綱的。亞綱、立克次氏體目、立克次氏體科、Wolbachia族、Wolbachia屬，在宿主中通過細(xì)胞質(zhì)遺傳傳給下一代。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前有15％～20％的昆蟲感染了這類細(xì)菌，遍及昆蟲綱的10多個(gè)目。除此外，Wolbachia還普遍寄生于甲殼動(dòng)物、蛛形綱類、螨類、絲狀線蟲體內(nèi)，是分布最廣、豐度最大的共生細(xì)菌類群。這類微生物可以改變宿主的生殖行為，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)不親和(cytoplasmic in—compatibility，CI)、誘導(dǎo)雌性化(feminization)和孤雌生殖(parthenogenesis inducing，PI)、殺雄(malekilling)現(xiàn)象等，這些現(xiàn)象并能通過Wolbachia垂直傳遞。農(nóng)作物上許多重要的、甚至傳播家畜和人類疾病的害蟲都能感染W(wǎng)olbachia)。所以，有學(xué)者提出利用Wolbachia侵染害蟲，導(dǎo)致寄主生殖力變化來(lái)控制甚至消滅對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及人類健康有重要影響的害蟲。

水稻條紋葉枯病是由灰飛虱(Laodelphaxstri—atellus)傳播的一種水稻病毒病害，近些年在長(zhǎng)江中下游稻區(qū)肆虐。進(jìn)入21世紀(jì)后，該病的發(fā)生范圍和損害度逐年擴(kuò)大，已成為江淮稻區(qū)水稻生產(chǎn)上最主要的病害之一。調(diào)查顯示：2000年和2001年江蘇省條紋葉枯病的發(fā)病面積分別為67萬(wàn)hm²和100萬(wàn)hm²，到了2004年，該省220萬(wàn)hm²的水稻有近90％的面積發(fā)病，涉及全省2／3縣(市)。其中偏重發(fā)病(病株率為10％～30％)和重發(fā)成災(zāi)(病株率>30％)的面積分別占17．1％、3．6％，另有近0．5％的水稻面積只好毀苗改種其他作物。據(jù)一些專家的保守估計(jì)，2004年僅灰飛虱引起的條紋葉枯病一項(xiàng)，就給江蘇地區(qū)的經(jīng)濟(jì)造成了近百億元的損失。

對(duì)灰飛虱的防治，目前主要有農(nóng)業(yè)防治、生物防治、化學(xué)防治等。這些方法雖然都有一定的效果，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有達(dá)到人們的期望值，同時(shí)在防治灰飛虱和條紋葉枯病過程中也暴露出亂用濫用化學(xué)農(nóng)藥和環(huán)境污染等問題。而Wolbachia是灰飛虱體內(nèi)普遍存在的一類共生菌，所以有些專家設(shè)想：利用基因工程方法即媒介昆蟲一共生菌技術(shù)轉(zhuǎn)化這些共生菌，讓共生菌攜帶、表達(dá)和釋放對(duì)病原微生物有專性的毒蛋白(對(duì)昆蟲和共生菌沒有副作用)，這樣病原微生物在昆蟲體內(nèi)被殺死，疾病的傳播也就被終止了。因此，探討Wolbachia在灰飛虱體內(nèi)的分布及作用機(jī)制對(duì)防治灰飛虱和控制水稻條紋葉枯病都具有極其重要的意義。

1Wolbachia在灰飛虱體內(nèi)的分布與檢測(cè)

探討灰飛虱與Wolbachia之間的關(guān)系是對(duì)灰飛虱傳播水稻條紋葉枯病進(jìn)行媒介昆蟲一共生菌防治技術(shù)研究的基礎(chǔ)。因此，了解Wolbachia在灰飛虱體內(nèi)的分布及如何檢測(cè)對(duì)防治水稻條紋葉枯病有實(shí)際指導(dǎo)意義。

1．1Wolbachia在灰飛虱體內(nèi)的分布

由于Wolbachia經(jīng)卵傳遞，而且它與生殖類型有關(guān)，所以人們最初把對(duì)Wolbachia的研究都集中在宿主生殖組織中，忽視了Wolbachia在非生殖組織中的分布狀況。自從1997年Min等發(fā)現(xiàn)一些果蠅被Wolbachia感染后會(huì)導(dǎo)致宿主生命周期下降，越來(lái)越多的注意力開始集中到Wolbachia在非生殖組織即宿主體細(xì)胞中的分布。研究表明，Wolbachia在節(jié)肢動(dòng)物體內(nèi)的廣泛分布均是在非生殖組織中。

影響Wolbachia在宿主體內(nèi)分布的因素是多方面的。胚胎發(fā)育過程是最主要的影響因素之一，但其影響程度在不同物種之間不盡相同。對(duì)灰飛虱的研究表明，灰飛虱的早期發(fā)育已決定了Wolbachia在其體內(nèi)的分布部位，在灰飛虱的頭、胸、腹、唾液腺、消化道及生殖組織中都存在著Wolbachia，而在脂肪體、腸細(xì)胞、一些腺體及輸精管中沒有觀察到。

1．2 Wolbachia的檢測(cè)技術(shù)

大多數(shù)立克次氏體無(wú)法在寄主體外進(jìn)行培養(yǎng)，所以對(duì)Wolbachia的檢測(cè)很難用傳統(tǒng)的微生物學(xué)方法。目前的檢測(cè)方法主要是以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子檢測(cè)。在此之前人們還運(yùn)用過DAPI染色法(用非特異性的DNA-blinding熒光染料DAPI染色，然后在熒光顯微鏡下觀察)和電鏡分析技術(shù)對(duì)Wolbachia進(jìn)行定性檢測(cè)。電鏡分析技術(shù)中透射電鏡觀察的結(jié)果與超薄切片的質(zhì)量密切相關(guān)。由于許多昆蟲組織制樣的不易操作性，使得切片質(zhì)量不夠理想。分子生物學(xué)方法的快速發(fā)展，尤其是PCR技術(shù)的發(fā)展和分子系統(tǒng)學(xué)方法的應(yīng)用使得這些細(xì)胞內(nèi)微生物的鑒別有了重大突破。

Wolbachia的分子檢測(cè)一般選取wsp基因(外膜蛋白基因)、ftsZ基因(細(xì)胞分裂基因)、16SrDNA和23SrDNA等設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中以wsp基因最為常用。研究表明，wsp基因比f(wàn)txZ基因的進(jìn)化速度快，因而利用wsp基因能揭示W(wǎng)olbachia更為詳細(xì)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。但PCR作為一種檢測(cè)手段也有一定的局限性，采用PCR和Western雜交等方法聯(lián)合檢測(cè)，可以提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2Wolbachia在灰飛虱種群內(nèi)的傳遞

通過對(duì)宿主生殖系統(tǒng)的解剖，發(fā)現(xiàn)Wolbachia能夠有效地侵入宿主群體，而不需要通過感染或其他方式的傳播途徑。在Wolbachia擴(kuò)散的同時(shí)，它能夠帶動(dòng)與之相關(guān)聯(lián)的其他細(xì)胞質(zhì)因子，如線粒體等在宿主群體中傳播。這一遺傳模式導(dǎo)致了感染W(wǎng)olbachia的雌性個(gè)體的增加。但隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)Wolbachia在同種宿主的不同個(gè)體間也有水平傳遞。

2．1影響Wolbachia在灰飛虱群體內(nèi)擴(kuò)散的因素

影響Wolbachia在昆蟲群體內(nèi)擴(kuò)散的因素有3個(gè)：一是Wolbachia的傳遞率，即宿主將Wobachia傳遞給后代的比率；二是細(xì)胞質(zhì)不親和(CI)的表達(dá)強(qiáng)度，即Wobachia引起的宿主細(xì)胞質(zhì)親和的水平；三是Wolbachia對(duì)宿主生殖力的影響。極端高溫、

抗生素、昆蟲的遷飛和非適齡交配等也會(huì)影響Wol—bachia在昆蟲群體內(nèi)的擴(kuò)散。

研究表明，室內(nèi)飼養(yǎng)感染的灰飛虱種群比室外的更易將Wolbachia傳遞給后代。這說(shuō)明自然界可能存在一些抑制Wolbachia的因素，如高溫和抗生素，它們可消除Wolbachia或降低其密度，而Wolbachia需達(dá)到一定密度后才能穩(wěn)定遺傳給后代。

2．2 Wolbachia的水平傳遞

長(zhǎng)期以來(lái)，人們都認(rèn)為Wolbachia是垂直傳遞的，但最近發(fā)現(xiàn)Wolbachia存在著水平傳遞的可能性。雖然目前對(duì)水平傳遞的機(jī)制還不太清楚，并且還沒有直接證據(jù)證明天然水平傳遞是否存在，但在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)人們已通過跟蹤損傷和暴露的血淋巴或通過Wolbachia的顯微注射發(fā)現(xiàn)了水平傳遞”門。Werren等于1995年首次報(bào)道了Wolbachia在不同昆蟲種間的水平傳遞；Heath等人在實(shí)驗(yàn)室條件下，利用不同種間的寄主昆蟲傳播Wolbachia獲得了成功。甘波誼等以PCR方法檢測(cè)了來(lái)自不同地域稻田的3種稻飛虱，發(fā)現(xiàn)灰飛虱、褐飛虱(Nilapar—ratalugens)、白背飛虱(Sogatellafurci／fre)均被Wolbachia所感染，進(jìn)一步的分析證實(shí)了這些飛虱為同種或極為相近的Wolbachia感染。同時(shí)發(fā)現(xiàn)能寄生于上述3種飛虱的稻虱紅螯蜂(Haplogonalo—pusjaponicus)也受同種Wolbachia感染。這些都暗示了Wolbachia的水平傳播。

3WoJbachia對(duì)灰飛虱生殖的影響

Wolbachia對(duì)灰飛虱生殖的影響主要包括細(xì)胞質(zhì)不親和，誘導(dǎo)孤雌生殖，雌性化以及殺雄性等多個(gè)方面，其中研究最多、最深入的當(dāng)屬細(xì)胞質(zhì)不親和。

3．1細(xì)胞質(zhì)不親和(CI)的作用原理

CI是存在于多種昆蟲種群體內(nèi)的一種胚胎發(fā)育異常現(xiàn)象。研究表明，當(dāng)感染了Wolbachia雄性個(gè)體與非感染的雌性個(gè)體交配時(shí)，通常不產(chǎn)生或者產(chǎn)生極少量的子代。而如果雌性個(gè)體感染了Wol—bachia，與任何雄性個(gè)體交配均能產(chǎn)生正常數(shù)量的子代。這樣，感染了Wolbachia的宿主與非感染的同種昆蟲相比較在生殖量上就明顯不同。進(jìn)一步的研究認(rèn)為，這一現(xiàn)象的產(chǎn)生是由于Wolbachia結(jié)合了宿主的某種生殖細(xì)胞特異染色體蛋白并在隨后的精子發(fā)生過程中將這種蛋白質(zhì)攜至精細(xì)胞外，從而影響了受精后的第1次有絲分裂過程。

3．2CI在灰飛虱體內(nèi)的表達(dá)強(qiáng)度

對(duì)灰飛虱的研究表明，Wolbachia引起的CI現(xiàn)象廣泛存在于灰飛虱體內(nèi)。當(dāng)灰飛虱在室內(nèi)適齡交配的情況下，其CI表達(dá)強(qiáng)度接近100％。自然界中由于存在著隨機(jī)交配，使得CI的表達(dá)強(qiáng)度有所降低，例如已經(jīng)感染W(wǎng)olbachia的雄蟲與沒有感染W(wǎng)olbachia的雌蟲交配是親和的，但可降低CI的表達(dá)強(qiáng)度。Hiroakiet等對(duì)灰飛虱和白背飛虱的研究表明，宿主的CI表達(dá)水平與雄性個(gè)體體內(nèi)Wol—bachia的含量呈正相關(guān)。

3．3Wolbachia對(duì)灰飛虱生殖力的影響

對(duì)灰飛虱生殖力的研究發(fā)現(xiàn)，Wolbachia的存在能提高宿主的生殖力。Wolbachia+灰飛虱能產(chǎn)生更多的子代，且和正常灰飛虱相比差異顯著。雖然此特性對(duì)控制灰飛虱的種群暴發(fā)也許不利，但從另一方面看，Wolbachia灰飛虱所表現(xiàn)出的明顯生殖優(yōu)勢(shì)倒為媒介昆蟲一共生菌技術(shù)的研究提供了新的思路：即將Wolbachia導(dǎo)人一些中性昆蟲或天敵昆蟲體內(nèi)，如果也能表現(xiàn)出生殖優(yōu)勢(shì)，則為媒介昆蟲一共生菌技術(shù)的應(yīng)用提供了材料；如果利用工程技術(shù)讓灰飛虱體內(nèi)的Wolbachia攜帶能控制條紋葉枯病毒的毒蛋白，媒介昆蟲一共生菌技術(shù)也同樣發(fā)揮了應(yīng)有的作用。

4利用Wolbachia控制灰飛虱

4．1CI在灰飛虱生物防治上的可能性

研究指出，Wolbachia既能相對(duì)穩(wěn)定地遺傳，又能通過外界因素去除，這些都有利于對(duì)它的利用。對(duì)于如何利用CI，人們?cè)O(shè)想進(jìn)行抗體基因的轉(zhuǎn)化，再放回到昆蟲體內(nèi)，利用CI的特性使工程昆蟲的種群在自然界中擴(kuò)大，抗體基因得以表達(dá)，介體昆蟲的傳毒能力就被逐漸削弱，最終達(dá)到阻斷這類害蟲傳播病毒的目的。例如，有人就曾設(shè)想利用果蠅特異的Wolbachia超感染灰飛虱，并使之穩(wěn)定地遺傳，在超感染的Wolbachia中轉(zhuǎn)入抗病的目的基因，通過超感染傳播進(jìn)行種群取代，將抗病基因在灰飛虱群體中不斷地?cái)U(kuò)散，從而為水稻蟲媒病毒病害的防治提供新的解決途徑。不過，利用Wolbachia引起的CI防治灰飛虱，必須解決引起CI的生化機(jī)制、Wolbachia的分布范圍及體外培養(yǎng)等問題，這樣才能將抗病的外源基因直接轉(zhuǎn)入Wolbachia中，然后將Wolbachia導(dǎo)人事先用抗生素處理過的灰飛虱體內(nèi)，Wolbachia就可通過CI帶動(dòng)抗病基因在群體中擴(kuò)散并逐漸占優(yōu)勢(shì)。

4．2PI在灰飛虱生物防治上的潛能

Wolbachia所誘導(dǎo)的孤雌生殖也有可能應(yīng)用于生物防治。Stouthamer提出了這種潛在利用的價(jià)值””。因?yàn)楣麓粕硨⒂懈叩姆N群增殖率和更多的產(chǎn)卵量。如果將Wolbachia移植到對(duì)生產(chǎn)上有重要意義的昆蟲天敵體內(nèi)，使其大量繁殖，就能達(dá)到控制害蟲的目的。當(dāng)然，灰飛虱傳毒是一個(gè)復(fù)雜的過程，而且不同地區(qū)的灰飛虱與病毒的親和力、病毒在介體內(nèi)的循回期均不同，灰飛虱種群還存在生物型和生態(tài)型分化等現(xiàn)象，因此，如何利用工程灰飛虱防治水稻條紋葉枯病，還需要不斷探索和實(shí)踐。另外，在釋放轉(zhuǎn)基因昆蟲前，還需要進(jìn)行介體昆蟲的群體遺傳學(xué)試驗(yàn)和安全性測(cè)定，以便釋放的轉(zhuǎn)基因昆蟲對(duì)環(huán)境是安全的。