BMSCs在功能化自組裝多肽水凝膠中定向分化神經細胞研究*

李鵬斌， 車 彪， 張振興， 王 凱

(長江航運總醫院骨科， 湖北 武漢 430010)

BMSCs在功能化自組裝多肽水凝膠中定向分化神經細胞研究*

李鵬斌， 車 彪， 張振興， 王 凱＊＊

(長江航運總醫院骨科， 湖北 武漢 430010)

目的:探討骨髓基質干細胞(BMSCs)在功能化自組裝多肽水凝膠中定向分化為神經細胞及分化后細胞的功能特征。方法:制備功能化自組裝多肽水凝膠，分別將BMSCs接種于RADA16自組裝多肽水凝膠(對照組)與功能化自組裝多肽水凝膠(實驗組)表面，觀察細胞遷移情況。用預誘導劑bFGF和EGF及定向誘導劑(SHH+RA)時序誘導，應用Nestin、MAP2、GFAP、ChAT和VAT染色，比較分化后神經樣細胞的形態和功能標志的差異。結果:BMSCs在功能化自組裝多肽水凝膠中共培養及誘導劑的特定組合和時序的誘導下增殖分化呈現神經元細胞樣改變，MAP2陽性細胞百分率較對照組顯著提高(P＜0.05)，GFAP陽性細胞百分率較對照組顯著降低(P＜0.05)，且功能標志ChAT和VAT只在實驗組表達。結論:BMSCs在功能化自組裝多肽水凝膠中能定向誘導分化為具有功能的神經細胞。

水凝膠; 骨髓基質干細胞; 自組裝多肽; 神經細胞

IKVAV(異亮氨酸－賴氨酸－纈氨酸－丙氨酸－纈氨酸)是層粘連蛋白的核心五肽活性片段，能促進神經元分化、黏附和軸突生長，抑制膠質細胞分化和黏附［1～3］。RADAl6(精氨酸－丙氨酸－天冬氨酸－丙氨酸－16)是自我互補的兩親性多肽，在水溶液中能自組裝成含水量超過99%的水納米凝膠纖維，可運輸營養物質和氧氣至其定植的細胞內。本研究在RADAl6的羧基末端鏈接 IKVAV模體合成 RADAl6－IKVAV，將RADAl6與多肽RADAl6－IKVAV混合制備自組裝多肽水凝膠，并檢測骨髓基質干細胞(BMSCs)在自組裝多肽水凝膠中定向分化為神經細胞的潛能及功能特征。

1 材料與方法

1.1 動物與主要試劑:4周齡SD大鼠，體重約100g; BMSCs購自Cyagen公司;BMSCs培養試劑購于Gibco公司;堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)、維甲酸(RA)、SHH購自Sigma公司;兔抗大鼠nestin抗體、兔抗大鼠ChAT抗體、AT抗體、GFAP抗體、MAP－2抗體購自武漢博士德公司。

1.2 材料:多肽RADA16的序列為:AcN－RADARADARADARADA－CONH2，多肽RADA16－IKVAV的序列為:can－RADARADARADARADA－GG－IKVAVCONH2。將0.5%RADA16溶液與0.5%RADA16－IKVAV溶液以4∶1的體積比混合制備功能化自組裝多肽溶液。

1.3 原子力顯微鏡檢測:將0.5%功能化自組裝多肽溶液超聲波破碎30min，然后稀釋到0.01%的工作濃度，吸取溶液10μL滴到新剝離的云母片表面，置于室溫下自然干燥，用NanoscopeIV原子力顯微鏡進行檢測。

1.4 BMSCs與水凝膠復合培養:將0.5%RADA16溶液與0.5%功能化自組裝多肽溶液超聲波破碎30min，然后將濃度稀釋為0.25%，100uL/孔加至Transwell小室上室的聚碳酸脂膜，加入BMSCs培養基觸發多肽溶液自組裝，37℃孵育30min產生水凝膠。取第六代BMSCs，以200uL/孔種植于RADA16自組裝多肽水凝膠(對照組)與功能化自組裝多肽水凝膠(實驗組)表面。(預誘導劑)各5ng/mL的bFGF和EGF、(譜系定向誘導劑)2μmoL/mL RA和15ng/mL Shh。開始每組加預誘導液，6d后改為混合誘導，每3d換一次液，18d停止誘導。

1.5 誘導細胞鑒定:不定期對誘導后的細胞分別進行神經干細胞標志物nestin和神經細胞標志物GFAP、MAP2、ChAT和 VAT的免疫組化鑒定。用 Hoechst33342對細胞核進行染色，用激光共聚焦掃描顯微鏡進行觀察，計數抗原陽性細胞數和Hoechst33342染色陽性的正常細胞的胞核數，計算陽性細胞在總細胞數中所占的比例。

1.6 統計學方法:采用SigmaPlot12.0軟件進行統計學分析。實驗組和對照組間比較采用t檢驗。P＜0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 功能化納米水凝膠纖維原子力顯微鏡檢測結果:多肽RADA16與多肽RADA16－IKVAV混合自組裝形成多肽水凝膠(圖1A)，通過原子力顯微鏡下觀察功能化自組裝多肽水凝膠由納米纖維交織形成立體網狀結構，纖維直徑為20～30nm，長度可達數百納米(圖1B)。

圖1 多肽水凝膠和功能化納米水凝膠纖維結構

2.2 BMSCs分化為神經元的形態變化:接種后細胞數量較多，突起較長，并交織成網狀結構，加預誘導液6d細胞增值迅速，6d后加入誘導劑后細胞間隙增寬，可見細胞突起伸長，細胞間可形成連接，10d后實驗組可見神經干細胞球狀形態減少，出現花瓣狀形態(圖2A)，神經細胞數量逐漸增多，細胞的多個突起發出分支，實驗組細胞的變化明顯高于對照組(圖2B)，16d后細胞轉化達到峰值，形態穩定，呈典型的神經細胞形態，對照組表現不明顯。

圖2 神經干細胞和神經細胞形態

2.3 神經元細胞免疫組化鑒定:預誘導4d開始出現nestin表達陽性，中期6～12d加誘導劑后nestin陽性細胞開始減少，實驗組明顯多于對照組，發綠色熒光(13.014±3.124)%(圖3A)，神經細胞標志在實驗組與對照組增多，實驗組為MAP2(59.171±1.839)%(圖3B)和GFAP(22.103±1.034)%(圖3C)，對照組為MAP2(29.354±4.845)%和GFAP(36.354±4.846)%，表明BMSCs向神經細胞分化，ChAT只在實驗組綠色熒光分布以胞核核膜為主的陽性細胞出現，比例為(42.356±3.741)%(圖 3D)。12～18d后，實驗組MAP2(72.536±1.018)%、GFAP(21.536±1.018)%，明顯高于對照組MAP2(31.016±2.371)%和GFAP(23.451±3.735)%，ChAT開始分布在胞核周圍，隨細胞突起增長，向突起中延伸，并實驗組出現VAT紅色熒光的陽性細胞，且細胞陽性率為 ChAT(45.112±3.044)%、VAT(28.223±1.716)%(圖3E)，對照組為陰性。

圖3 神經元細胞免疫熒光

3 討 論

多肽分子源于自然界，其結構簡單、無毒副反應及免疫反應，具有好的生物相容性，張曙光等［4］首次從酵母蛋白中發現了一組可自組裝的離子互補型多肽，開拓了分子自組裝技術的新領域，隨后設計合成了可支持多種細胞三維生長的RADA16自組裝多肽水凝膠［5］，近幾年來許多研究者通過改變多肽的氨基酸序列，已設計出了眾多具有特殊功能的納米自組裝材料應用于不同的科研領域［6，7］，這種多肽可根據細胞的特征改變自身序列和電荷，為細胞量身打造專用生存環境，可以模擬充盈水性液體的機體組織，為細胞的生長提供一個理想的生活環境，在調控細胞行為和功能研究方面取得了令人矚目的研究進展。RADA16是自我互補的兩親性多肽，單元序列為(［COCH3］－RADARADARADARADA－［COCH2］)，由極性氨基酸(精氨酸和天冬氨酸)與非極性氨基酸(丙氨酸)交替排列，分子之間間隔的A形成疏水面，R和D形成親水面。自組裝成納米纖維的過程成形成β折疊結構，在親水面往復形成且補離子鍵組裝為納米纖維，這種多肽水凝膠支架材料在體內不會引起明顯的免疫反應和炎癥反應［8］。

來自層粘連蛋白的IKVAV序列具有促進神經細胞的粘附、生長及分化等功能［9］，可以與神經干細胞表面的IKVAV受體LBP110發揮作用，本實驗通過直接固相法在RADA16的羧基末端修飾IKVAV模體合成RADA16－IKVAV，將自組裝多肽RADA16與多肽RADA16－IKVAV混合制備功能化自組裝多肽水凝膠，根據各種因子在干細胞定向分化過程中的不同作用，選擇了預誘導劑(bFGF和EGF)及定向誘導劑(SHH+ RA)，將BMSCs與水凝膠混合培養，結果發現功能化自組裝多肽水凝膠能促進BMSCs遷移，提高其向神經元分化的比例，MAP2陽性細胞百分率、功能標志ChAT和VAT陽性表達實驗組明顯優于對照組，表明我們設計構建的自組裝多肽凝膠對骨髓基質干細胞有良好細胞相容性，特定因子合適的配伍及時序應用可以使骨髓基質干細胞在體外向膽堿能神經元分化，為臨床中脊髓損傷的神經修復提供客觀理論依據。

［1］闞瑞，涂來勇，楊明坤，等.神經干細胞聯合體外自組裝IKVAV納米纖維凝膠移植治療大鼠脊髓損傷［J］.中華醫學雜志，2013，93(21):1669～1673.

［2］Cheng TY，Chen MH，Chang WH，et al.Neural stem cells encapsulated in a functionalized self－assembling peptide hydrogel for brain tissue engineering［J］.Biomaterials，2013，34 (8):2005～2016.

［3］王天瑞，馬學曉，于騰波，等.人工合成IKVAV多肽對星形膠質細胞增殖和Neurocan基因表達的影響［J］.脊柱外科雜志，2012，10(2):109～112.

［4］Zhang S，Holmes T，Lockshin C，et al.Spontaneous assembly of a self－complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane［J］.Natl Acad Sci USA，1993，90 (8):3334～3338.

［5］Zhang S.Designer self－assembling peptide nanofiber scaffolds for study of 3－D cell biology and beyond［J］.Adv Cancer Res，2008，99:335～362.

［6］劉茜，王秀梅.自組裝多肽納米纖維水凝膠在細胞三維培養中的應用及特征［J］.中國組織工程研究，2014，(12): 1907～1913.

［7］趙剛，李京玲，王丹等.新型自組裝水凝膠NBD/RADA16可促進前成骨細胞的分化［J］.中國組織工程研究，2014，(21):3329～3333.

［8］郝少飛.新型多肽RADA16－P24－PLGA共聚物體內誘導成骨的研究［D］.華中科技大學，2013.

［9］劉寧，郭海龍，盛偉斌，等.神經干細胞－多肽自組裝凝膠復合體移植治療脊髓損傷［J］.中華實驗外科雜志，2011，28(11):1961～1963.

Directed Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells in the Functional Differentiation of Self－assembling Peptide Hydrogel

LI Pengbin， CHE Biao， ZHANG Zhenxing， et al
(General Hospital of the Yangtze River Shipping，Hubei Wuhan430010，China)

Objective:To investigate the potential and differentiation of bone marrow stromal cells which in functional self－assembling peptide hydrogel after directed differentiation for neural cells functional characteristics.Method:The functionalized self－assembling peptide was produced by mixing the self－assembling peptide RADA16 and peptide RADA16－IKVAV.BMSCs were seeded into RADA16 self－assembling peptide hydrogel(control group)and functionalized self－assembling peptide hydrogel(experimental group)surface.Pre－inducing agents with bFGF and EGF and directed inducers(SHH+RA)induced timing，application Nestin，after MAP2，GFAP，ChAT，VAT immunofluorescence staining to detect morphological and functional differentiation of neural－like cells mark.Result:By inducing BMSCs in functional self－assembling peptide hydrogel culture and inducers communist specific combination and timing of the proliferation and differentiation of neuronal cells exhibit like change，MAP2－positive cells was significantly increased compared with the control group(P＜0.05)，GFAP－positive cells the percentage was significantly lower than the control group(P＜0.05)，and the feature flag ChAT，VAT expressed only in the experimental group.Conclusion:BMSCs in the function of self－assembling peptide hydrogels can be induced into neural cells have certain features.

Hydrogel; Bone marrow stromal cells; Self－assembling peptide; Neural cell

A

10.3969/j.issn.1006－6233.2015.04.004

1006－6233(2015)04－0539－04

交通運輸部長江航務管理局科技項目基金，(編號:201210010)

＊＊ 通訊作者