轉谷氨酰胺酶交聯改性小米蛋白質的溶解特性

王旭成，梁亞萍，王美玉，王曉聞，陳振家

1. 山西農業大學食品科學與工程學院（太谷 030801）；2. 山西農業大學校醫院（太谷 030801）

近幾年來酶交聯技術已逐步成熟，雖是一種比較新型的技術，但作為一種生產新型蛋白食品的技術，被廣泛應用于雜糧制品、面制品、豆制品、肉制品、乳制品和魚類制品等食品加工領域，應用較為廣泛，成本較低，對原材料的要求不高，是一種適宜廣泛推廣的新型食品加工技術[1-3]。

小米的營養價值較高，有著較為豐富的蛋白質、脂肪和維生素，其不僅有食用價值，還有一定藥用價值，小米有滋陰、補脾臟和溫養腸胃的功效。小米蛋白質中氨基酸種類較為齊全，其中共含有17種氨基酸。主要組分為谷氨酸、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸和天冬氨酸，主要組分約占小米蛋白總量的58.95%，小米蛋白氨基酸組成中還包含8種必需氨基酸。這17種氨基酸除賴氨酸含量較為偏低外，其他氨基酸的比例構成均符合世界衛生組織的推薦模式[4-8]。因此，以小米酶改性蛋白作為試驗對象，探究轉谷氨酰胺酶催化蛋白質交聯過程中，小米蛋白的功能特性與小米蛋白亞基分子發生哪些變化，確定交聯過程為小米蛋白帶來改變，為轉谷氨酰胺酶交聯酶改性小米蛋白質功能特性工藝化提供理論依據和實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料

小米（品種為晉谷21）。

1.1.2 主要試劑

石油醚、無水乙醇、氫氧化鈉、氯化鈉、三氯乙酸、鹽酸、濃硫酸（均為分析純，天津市凱通化學試劑有限公司）；考馬斯亮藍、G250、SDS、β-巰基乙醇、溴酚藍、甲叉雙丙烯酰胺、四甲基乙二胺、過硫酸銨、氫氧化鉀、甘油、低分子量蛋白質Marker（北京索萊寶科技有限公司）。

1.1.3 試驗儀器

DYY-7C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；723可見分光光度計（上海菁華科技有限儀器公司）；HH系列數顯恒溫水浴鍋（金壇市科析儀器有限公司）；RE-52AA旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-III循環水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；TS-2000 A Decoloring Shaker（Kylin-Bell Lab Instrument公司）；HC-2064高速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 脫脂小米粉制備

小米磨制成粉后，按料液比1∶5（g/mL），加入石油醚，攪拌脫脂8 h，抽濾去除油脂石油醚混合溶液，沉淀置于通風處晾干收集即脫脂小米粉。

1.2.2 酶改性小米蛋白粉的制備

按料液比1∶10（g/mL），將小米脫脂粉與去離子水混合，溶液調至pH 9，攪拌2 h后，以4 000 r/min離心15 min后取上清液，按酶與蛋白質的0.5%的比例，添加TG酶，50 ℃酶攪拌1 h。沸水浴滅酶5 min。調節至pH 4.5，以4 000 r/min離心10 min，水洗2次，將沉淀復溶至中性，冷凍干燥后備用[10]。

1.2.3 pH對小米改性蛋白溶解度的影響試驗

按料液比1∶100（g/mL），將小米改性蛋白粉與去離子水混合，磁力攪拌1 h，依次調pH為2.0，3.0，4.0，4.5，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0和12.0，以10 000 r/min離心10 min，測定上清液蛋白質量濃度。

1.2.4 離子強度對小米改性蛋白溶解度的影響試驗

按料液比1∶100（g/mL），將小米改性蛋白粉與去離子水混合，調節不同離子強度后磁力攪拌1 h，以10 000 r/min離心10 min，測定上清液蛋白質量濃度。

1.2.5 溫度對小米改性蛋白溶解度的影響試驗

按料液比1∶100（g/mL），將小米改性蛋白粉與去離子水混合，混勻后均分為6部分，用恒溫水浴鍋將試樣按50，60，70，80，90和100 ℃，恒溫攪拌1 h，以10 000 r/min離心10 min，測定上清液蛋白質量濃度。

1.2.6 小米酶改性蛋白質量濃度測定

考馬斯亮藍法進行測定[11]。

1.2.7 SDS-PAGE電泳儀的操作

樣品處理，分別取適量離心分離后試樣的上清液和沉淀，加入電泳液中，振蕩均勻，-4 ℃處理10 h，再次振蕩均勻。依照Laemmli的方法[12]。濃縮膠濃度5%、分離膠濃度12%、樣品上樣量5 μ L。恒壓電泳，電流16 mA，濃縮膠電壓100 V，分離膠電壓150 V。電泳結束后，電泳膠片固定3 h后，染色，脫色結束后，成像儀進行成像。

2 結果與分析

2.1 不同因素對小米酶改性蛋白的溶解度的影響

2.1.1 不同pH對小米酶改性蛋白的溶解度的影響

由圖1可知，小米酶改性蛋白在pH 5處溶解度最小，酶改性蛋白等電點應在pH 5附近。在pH 5兩側，小米酶改性蛋白溶解度均呈上升趨勢。pH是使蛋白質變性最常見的化學因素，大多數蛋白質在pH靠近等電點時，其溶解度會變低，這是由于在等電點時，蛋白質分子凈電荷為零，不存在同種電荷互斥現象，分子間的作用力減弱，其顆粒極易碰撞、凝聚而產生沉淀，故而溶解度最低。溶液pH低于或高于蛋白質的等電點時，加強蛋白質與水分子的相互作用，同時加強蛋白質鏈之間相互排斥作用，使蛋白質發生不可逆性變性，有利于蛋白質水溶性增加，提高蛋白溶解度[13-14]。

圖1 不同pH條件下小米酶改性蛋白的溶解特性

2.1.2 不同離子強度小米酶改性蛋白的溶解度的影響

由圖2可知，蛋白濃度在離子強度為0.01 mol/L時達到最高，之后呈下降趨勢，離子強度為0.05 mol/L時達到最低，隨后呈現上升趨勢直至0.2 mol/L，離子強度0.2～0.8 mol/L時，蛋白溶液濃度又呈現下降趨勢，之后蛋白溶液濃度呈現穩定趨勢。鹽離子以2種不同方式影響蛋白質穩定性，低濃度時，離子通過非特異性的靜電相互作用與蛋白質作用，穩定蛋白質結構；高濃度時，鹽具有影響蛋白質結構穩定性的離子特異效應，低濃度中性鹽會使蛋白質分子表面的電荷增加，使蛋白質的親水作用增強，其溶解性提高，而高濃度中性鹽會破壞蛋白質的膠體性質，其溶解性降低[15]。

2.1.3 不同溫度對小米酶改性蛋白的溶解度的影響

由圖3可知，溫度50～80 ℃時，蛋白溶液濃度呈現上升趨勢；溫度80～100 ℃時，蛋白溶液濃度呈現穩定趨勢。由此可知，在50～100 ℃溫度區間內，小米酶改性蛋白溶解度總體呈現先上升后穩定趨勢，說明小米酶改性蛋白溶解度隨溫度升高而上升，且在50～80 ℃溫度區間對小米酶改性蛋白溶解度影響較顯著。溫度是使蛋白質變性最常見的物理因素，大多數蛋白質在45～50 ℃時會發生變性，到55 ℃時變性速率加快。70 ℃以下時蛋白質變性僅涉及非共價鍵的變化，但在70 ℃以上，會破壞蛋白質二硫鍵，產生不可逆變性[16]。

圖2 不同離子強度下小米酶改性蛋白的溶解特性

圖3 不同溫度條件下小米酶改性蛋白溶解度變化

2.2 不同條件對小米酶改性蛋白的蛋白組成亞基組成的影響

2.2.1 不同pH下小米酶改性蛋白的亞基組成

由圖4可知，在等電點附近上清液的電泳條帶幾乎沒有，這與蛋白溶解度數據相對應，說明等電點幾乎所有亞基發生沉淀。小米分離蛋白的亞基組成主要是小米的清蛋白和球蛋白，先前的研究表明，22 kDa的亞基條帶是清蛋白的特征帶，其余條帶為球蛋白特征條帶。還原電泳中，pH 5.0泳道幾乎沒有條帶，pH 4.0和4.5泳道缺失了分子質量和66.2 kDa標樣平行的球蛋白亞基條帶，說明這個亞基的pH敏感性最強，在等電點附近最易沉淀。此外，電泳圖譜中1～13泳道在非還原電泳中分離膠頂端均有條帶，而還原電泳中這些條帶消失，說明上清液中存在部分通過二硫鍵結合的蛋白大分子，在非還原電泳中未能進入分離凝膠，而還原電泳中在66.2 kDa上方出現一些新的條帶，說明大分子亞基是這些新亞基通過二硫鍵結合形成的。圖5中可以看出，等電點附近沉淀的亞基數量最多，進一步印證等電點附近蛋白的溶解度的變化規律[17]。

2.2.2 不同離子強度下小米酶改性蛋白的亞基分布

由圖7可知，電泳圖譜中1～13泳道在非還原電泳中分離膠頂端均有條帶，而還原電泳中這些條帶消失，說明沉淀中存在部分通過二硫鍵結合的蛋白大分子，在非還原電泳中未能進入分離凝膠。對比圖6中的上清液非還原電泳圖譜，分離膠頂端的條帶顏色較淡，說明小米酶交聯蛋白中這部分亞基是沉淀的主要組成。在不同離子強度條件下，沉淀和上清液整體的亞基分布相似，說明小米酶改性蛋白在不同離子強度下的溶解度差異，只是整體亞基的溶解度差異，并無亞基溶解度的特異差別[18]。

圖4 不同pH小米酶改性蛋白上清液非還原（N）和還原（R）電泳圖譜

圖5 不同pH小米酶改性蛋白沉淀非還原（N）和還原（R）電泳圖譜

圖6 不同離子強度條件下小米酶改性蛋白上清液非還原（N）和還原（R）電泳圖譜

圖7 不同離子強度條件下小米酶改性蛋白沉淀非還原（N）和還原（R）電泳圖譜

2.2.3 不同溫度下小米酶改性蛋白的亞基分布

由圖8的非還原電泳圖譜可知，隨著溫度增加，小米酶交聯蛋白上清液的亞基組成略有變化。其中，分子質量43 kDa的亞基條帶在100 ℃消失，31～43 kDa之間的亞基條帶在90 ℃和100 ℃消失。這2個亞基在還原電泳圖譜中的相應位置出現，說明隨溫度升高，2個亞基通過二硫鍵形成可溶性大分子。因此，隨溫度升高會促進分子間二硫鍵形成，并促近低分子亞基締結形成大分子可溶性聚合物。沉淀非還原電泳圖譜中較為明顯的是分子質量22.0 kDa的亞基條帶，沉淀非還原電泳圖譜中其他亞基均出現，說明22.0 kDa亞基在沉淀中是以非二硫鍵的非共價鍵形式形成不溶聚合物，而其他亞基形成不溶聚合物的價鍵中包含二硫鍵。此外，沉淀的還原電泳圖譜中，和分子質量14.4 kDa最接近的亞基條帶顏色很淡，而此亞基在還原電泳中顏色較深，說明此亞基在不同溫度條件下不易聚集形成不溶性聚集體[19]。

圖8 不同溫度條件下小米酶改性蛋白上清液和沉淀非還原（N）和還原（R）電泳圖譜

3 結論

小米酶改性蛋白在pH 5處溶解度最小，故等電點應在pH 5附近；小米酶改性蛋白隨鹽離子濃度升高，蛋白溶解度呈現先下降后上升再下降現象；小米酶改性蛋白隨溫度升高，蛋白溶解度呈現先上升后趨于穩定的現象。

經過酶改性后的小米蛋白大部分亞基組分分子質量大于66.2 kDa，其中含二硫鍵的亞基占大部分。小米酶改性蛋白在不同pH下，等電點附近沉淀的亞基數量最多，進一步印證等電點附近蛋白的溶解度的變化規律；小米酶改性蛋白在不同離子強度下的溶解度差異，只是整體亞基的溶解度差異，并無亞基溶解度的特異差別，小米酶改性蛋白在不同溫度下，分子質量最接近14.4 kDa的亞基條帶顏色很淡，而此亞基在還原電泳中顏色較深，說明此亞基在不同溫度條件下不易聚集形成不溶性聚集體。