HPLC法同時測定大籽獐牙菜中10種化學成分

　　摘 要：建立反相高效液相色譜法同時測定大籽獐牙菜中10種成分的含量。方法：采用反相高效液相色譜，色譜條件為：Agilent XDB C18柱（Φ4.6×150 mm，5 μm）；流動相A：甲醇，B：水；洗脫方法：0～20 min，A為10%～30%，20～45 min A為30%～80%梯度洗脫；體積流量1.0 mL/min，檢測波長254 nm，230 nm，柱溫28 ℃。結果：10種成分均達到基線分離，各化合物的線性關系良好，r>0.999 5；各待測物的精密度RSD值均小于1.1%；重復性良好（RSD<3.7%）；回收率范圍在97.8%～104.2%，RSD<4.2%。結論：該方法測定成分多，結果準確、可靠。
　　關鍵詞：反相高效液相色譜；大籽獐牙菜；酮；環烯醚萜
　　中圖分類號：R286.0 文獻標識碼：A 文章編號：1007-2349（2011）04-0064-02
　　大籽獐牙菜（Swertia macrosperm a C. B.Clark）系龍膽科（Gentianaceae）獐牙菜屬（Swertia）植物，主要產于西藏、貴州、云南等省^［1］，獐牙菜屬植物多具有清肝利膽、清熱除濕等功效，在民間不少地方用該屬植物治療黃疸型肝炎。張媛媛等^［2］對大籽獐牙菜化學成分進行了研究，該植物中酮類、環烯醚萜類成分具有廣泛的生理活性。酮類化合物具有很好的保肝、降血糖、抗氧化等作用^［3~6］，裂環烯醚萜苷中的龍膽苦苷可明顯降低血清轉氨酶、促進肝臟的蛋白質合成，還能促進膽汁及胃液的分泌，興奮中樞神經系統，獐芽菜苦苷具有解痙、鎮痛、鎮靜的活性，能促進毛發生長。此外，龍膽苦苷和獐芽菜苦苷均可促進細胞膠原質的產生以及有絲分裂活動，加快創口愈合速度^［7~9］。對獐牙菜屬植物中齊墩果酸、龍膽苦苷、獐芽菜苦苷及酮含量的HPLC測定報道較多，楊慧玲等^［10］對大籽獐牙菜中7種有效成分進行了測定。本試驗建立了對大籽獐牙菜中10種成分的高效液相色譜的含量測定方法，為評價藥材質量及合理用藥提供了可靠依據。
　　1 儀器與試藥
　　Agilent1200高效液相色譜儀，配置為自動進樣器、高壓四元梯度泵、DAD檢測器、Agilent1200色譜工作站；Agilent XDB-C18柱（Φ4.6×150 mm d，5 μm）色譜柱；AS20500A超聲波清洗器；超純水儀。流動相用甲醇為色譜純（美國Tedia公司），其他試劑均為分析純，水為超純水。斷馬錢子苷半縮醛內酯（S1）、表斷馬錢子苷半縮醛內酯（S2）、獐芽菜苷（S3）、龍膽苦苷（S4）、芒果苷（S5）、1O葡萄糖基2，3二氫1，4，6，8四羥基酮（S6）、1，3，5，6四羥基酮（S7）、2'O（3羥基苯甲酰基）獐芽菜苦苷（S8）、3，3'雙（3，4二氫4甲氧基6羥基2H1苯并吡喃）（S9）、1甲氧基3，7二羥基酮（S10）10種標準對照品均由本課題組制備，純度均在98%以上。植物樣品于2009年11月采自云南省玉溪市新平縣，經云南中醫學院楊禮攀博士鑒定為龍膽科獐牙菜屬植物大籽獐牙菜。樣品陰干后粉碎過80目篩，室溫下保存，植物標本存于云南民族大學民族藥資源化學重點實驗室標本館。
　　2 方法與結果
　　2.1 色譜條件 Agilent XDB-C18（Φ4.6 mm×150 mm，5 μm），流動相為甲醇和水在0～20 min內由10∶90至30∶70、20～45 min內由30∶70至80∶20梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測波長254 nm，230 nm，柱溫28 ℃。在該色譜條件下10種成分均達到基線分離。
　　2.2 對照品儲備液的配制 精確稱取對照品S1 2.1 mg、S2 2.6 mg、S3 1.5 mg、S4 7.1 mg、S5 9.4 mg、S6 1.1 mg、S7 6.5 mg、S8 5.9 mg、S9 4.3 mg、S10 5.3 mg分別置10 mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容，配制成相應濃度的對照品儲備液。
　　2.3 樣品溶液的制備 精確稱取粉碎至80目的待測樣品3份，每份1.000 g，分別加入40.00 mL甲醇置80 ℃水浴中索式提取75 min，提取后采取體積補償，過0.45 μm濾膜，在“2.1”色譜條件下測定峰面積。
　　2.4 線性關系的考察 取S1～S10 10種標樣進樣體積分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2、4、6、8、10 μL，以峰面積的積分值定量。S1～S10的回歸方程及相關系數見表1。
　　2.5 精密度試驗 取含S1 0.36 mg/mL、S2 1.07 mg/mL、S3 1.14 mg/mL、S4 0.69 mg/mL、S5 0.53 mg/mL、S6 0.94 mg/mL、S7 0.05 mg/mL、S8 0.93 mg/mL、S9 0.16 mg/mL、S10 0.15 mg/mL混合對照品溶液，在“2.1”色譜條件下測定色譜峰的峰面積，計算得RSD分別為0.82%、0.90%、0.73%、0.79%、1.1%、0.39%、0.95%、0.66%、0.82%、0.96%（n=6），表明儀器精密度良好。
　　2.6 穩定性試驗 精確稱取大籽獐牙菜樣品1.000 g，按“2.3”項下方法操作，分別在0、2、4、6、8、16、24 h時進樣，測定S1～S10的峰面積，計算它們的RSD分別為1.2%、1.5%、1.8%、1.4%、2.1%、1.2%、1.7%、2.8%、2.3%、1.7%（n=7）。表明樣品溶液在24 h內穩定。
　　2.7 重復性試驗 精確稱取3份1.000 g大籽獐芽菜樣品，按“2.3”項下方法操作，在“2.1”色譜條件下測定S1～S10的含量，計算得RSD分別為1.8%、1.4%、2.2%、3.2%、2.2%、1.3%、2.1%、3.5%、2.6%、3.6%（n=3），表明方法重復性良好。
　　2.8 回收率試驗 精確稱取3份大籽獐牙菜樣品各1.000 g，精確量取各對照品溶液2.00 mL，按“2.1”項下方法操作，測得S1～S10的平均回收率（n=3）分別為103.1%、100.8%、98.2%、101.5%、99.6%、103.1%、98.9%、104.2%、97.8%、99.3%；RSD分別為3.7%、2.4%、2.8%、1.3%、3.6%、1.8%、4.1%、2.2%、1.9%、2.0%。
　　2.9 樣品測定 取“2.3”項下制備的樣品溶液按“2.1”色譜條件進行分析，樣品色譜圖與標準品色譜圖比較指認（圖1）后按外標法以峰面積積分值計算，得10種成分的百分含量分別為0.10%、0.02%、0.19%、0.35%、1.36%、0.10%、3.42%、0.17%、2.53%、0.14%（n=3）。
　　3 討論
　　3.1 檢測波長的選擇 對照品溶液進樣后，利用DAD檢測器在200～400 nm掃描其吸收光譜，對照品在254 nm和230nm波長處有較高的吸收峰，選擇該波長為檢測波長。
　　
　　3.2 提取方法確定 比較了超聲、熱回流和索式提取3種不同提取方法；提取時間（30、45、60、75、90 min）對提取率的影響，結果發現，索式提取法略優于熱回流提取法和超聲，且索式提取75 min即可將有效成分提取完全，故該試驗采用索式提取法。
　　3.3 流動相的選擇 實驗按“2.1”色譜條件進行時發現不加磷酸的情況下，10種化合物均達到較好的基線分離且不拖尾，故選擇甲醇和水作流動相。
　　3.4 該試驗建立的高效液相色譜法具有簡便，結果準確、可靠等優點，獐芽菜苦苷、芒果苷的含量較楊慧玲等^［10］測定的有差異，這說明不同地域的大籽獐牙菜在成分含量上是有差別的。這對評價藥材質量、充分利用藥物資源有一定的參考意義。
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　　（收稿日期：2010-12-30）
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