基于線粒體自噬-NLRP3炎癥體探討鐵皮石斛抗動脈粥樣硬化的分子機制

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種慢性且進行性的動脈炎癥性疾病，由負責促進修飾低密度脂蛋白（low-densitylipoproteins，LDL）在內皮下滯留的內皮層的功能和結構改變引起，LDL可產生活性促炎因子、細胞因子，與單核細胞-巨噬細胞和平滑肌細胞協同作用以促進斑塊的形成。目前，盡管在AS的預防、診斷和治療方面取得了重大進展，但AS仍然是全球死亡的主要原因[1]，2019年約導致1860萬人死亡[2]。現階段，藥物治療主要延緩斑塊的發展，改善癥狀并防止血栓的形成[3]。因此，迫切需要挖掘新的藥物并進一步闡明AS的形成、進展和并發癥的分子機制。鐵皮石斛是一種中藥材，因具有抗炎、抗氧化等功效成為研究熱點。研究表明，鐵皮石斛對高血壓、糖尿病性心肌病等心血管疾病具有改善作用[45]。目前，已有研究顯示鐵皮石斛可聯合西藥治療冠心病心絞痛[。線粒體自噬一個亞細胞過程，在蛋白質和受損細胞器的降解中起著重要作用，線粒體自噬異常加重線粒體功能障礙與心肌梗死、心肌病和心力衰竭多種疾病的發病機制密切相關7。線粒體自噬在AS的病理生理學中起著至關重要的作用[89]。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥體是人體先天免疫系統的重要組成部分，其激活可介導炎癥反應并參與AS的發生和發展。因此，深入探究NLRP3炎癥體伴隨的可能分子機制將成為臨床治療AS的新方向。本研究通過建立AS小鼠模型，基于線粒體自噬與NLRP3炎癥體之間的潛在聯系，探討鐵皮石斛抗AS的分子機制。

1材料與方法

1.1試劑與儀器

NLRP3購自上海艾博抗貿易有限公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體、Beclin1抗體、自噬微管相關蛋白輕鏈3Ⅱ（LC3Ⅱ）抗體均購自美國Affinity公司；免疫組化試劑盒購自上海艾博抗貿易有限公司；腫瘤壞死因子 -α（TNF-α） 、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-18（IL-18）、白細胞介素-1β（IL-1β）試劑盒均購自上海酶聯生物科技；總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、LDL、油紅O染色試劑盒均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；線粒體分裂抑制劑-1（Mdiv-1）購自美國MCE公司；酶聯免疫檢測儀購自南京德鐵實驗設備有限公司；病理組織切片機購自上海徠卡顯微系統貿易有限公司。本研究獲得張家口市第一醫院醫學倫理委員會批準（倫理審批號：2023-044）。

1.2實驗分組與AS小鼠模型的建立

根據實驗設計取6只C57BL/6J小鼠（北京貝優生物科技有限公司）為對照組，將18只載脂蛋白E基因敲除（ApoE）小鼠（北京貝優生物科技有限公司）隨機分為AS組、鐵皮石斛組、鐵皮石斛十Mdivi-1組，每組6只。AS組、鐵皮石斛組、鐵皮石斛 + Mdivi-1組喂養高脂飼料；鐵皮石斛組、鐵皮石斛 + Mdivi-1組于每日相同時間灌胃鐵皮石斛（前期篩選出的鐵皮石斛最佳干預濃度 3g/kg） ，持續12周，鐵皮石斛 + Mdivi-1在灌胃至第11周時腹腔注射線粒體自噬抑制劑Mdivi-10.5mg/kg ，持續1周；對照組喂養普通飼料，使用等體積生理鹽水進行灌胃。

1.3 血脂及炎性因子TNF- α 、IL-6、IL-18、IL-1β水平 檢測

提取各組小鼠血清，按照試劑盒說明書檢測各組小鼠血脂（TC、TG、LDL）及炎性因子（TNF- α IL-6、IL-18、IL-1β）水平。

1.4蘇木精-伊紅（HE）染色檢測小鼠胸主動脈病理學改變

將制作結束的各組小鼠胸主動脈切片， 64^°C 烘烤10min ，依次在二甲苯和上行梯度乙醇中進行透明、脫水。將胸主動脈切片水化后先滴加蘇木精染液 3min ，放入水中反藍，然后在細小流水下持續沖洗 15min ，滴加適量伊紅染液 3min ，依次浸入下行梯度乙醇和二甲苯中進行脫水透明，滴加中性樹脂蓋上蓋玻片，此過程避免產生氣泡，最后鏡下觀察拍照

1.5油紅O染色檢測小鼠胸主動脈中脂質浸潤情況

將各組小鼠胸主動脈切片脫蠟，鉻處理后自來水洗滌，Regaud蘇木精滴染 5min ，使用蒸餾水洗滌后將組織切片浸入Mass麗春紅酸性復紅液中 5min ，再浸人 2% 冰醋酸溶液中3min， 1% 鉬酸水 3min ，滴加苯胺藍染色 5min ，浸人 0.2% 冰醋酸溶液中 3min ，再依次浸入梯度乙醇與二甲苯溶液中脫水透明，使用中性樹膠封片后鏡下觀察并拍照。

1.6蛋白免疫印跡法（WestemBlotting）檢測小鼠胸主動脈中Beclin1、LC3ⅡI、NLRP3蛋白水平

將各組小鼠胸主動脈切碎后，根據其重量加入合適的裂解液提取總蛋白，檢測各組蛋白濃度后配制相同濃度的樣品，將配制成一定體系的樣品在金屬浴中高溫變性。向凝膠孔道中加入相同體積的樣品進行電泳，將電泳結束的凝膠與聚偏二氟乙烯（PVDF）膜按照一定順序置于轉膜夾中進行轉膜。將轉膜結束的PVDF膜浸入快速封閉液中封閉 15min ，磷酸鹽緩沖液-吐溫20（PBST）清洗后，在 4^°C 冰箱中孵育對應的抗體孵育，次日清洗后，室溫孵育1h對應的二抗，使用PBST清洗后滴加發光液曝光，最后將結果保存后分析統計。

1.7實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）檢測Beclin1、LC3ⅡI、NLRP3mRNA水平

提取小鼠胸主動脈中總RNA量，逆轉錄Beclin1、LC3ⅡI、NLRP3的RNA為cDNA。將Beclin1、LC3II、NLRP3的cDNA擴增，內參為GAPDH。引物序列見表1。

表1引物序列 （5^′-3^′）

1.8免疫組織化學染色檢測小鼠胸主動脈中NLRP3蛋白水平

將制作結束的各組小鼠胸主動脈切片 64^°C 烘烤10min ，依次浸入二甲苯溶液與梯度乙醇脫水進行脫蠟，高溫高壓抗原修復 5min ，待組織切片自然冷卻后用蒸餾水清洗，滴加過氧化物酶阻斷劑孵育 10min ，清洗后滴加一抗孵育 60min ，清洗后滴加二抗孵育20min，滴加3， 3^′. 二氨基聯苯胺（DAB）孵育 1min ，浸入蒸餾水中終止顯色，滴加蘇木素 3min 染細胞核，鹽酸乙醇分化3s立即流水沖洗，然后脫水、透明、中性樹膠封片、鏡下觀察。

1.9 統計學處理

采用SPSS23.0軟件進行統計分析。符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x士s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。以 Plt; 0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1鐵皮石斛對AS小鼠血脂水平的影響

與對照組相比，AS組血清TC、TG、LDL水平升高1 ?Plt;0.05） ；與AS組相比，鐵皮石斛組血清TC、TG、LDL水平降低（ Plt;0.05 。詳見表2。

表23組血脂水平比較 單位：mmol/L

注：AS組與對照組相比， ① Plt;0.05 ；鐵皮石斛組與AS組相比， ② rlt;0.05 。

2.2鐵皮石斛對AS小鼠胸主動脈病理結構的影響

HE染色結果顯示，與對照組相比，AS組小鼠胸主動脈內膜增厚，結構紊亂，可見斑塊形成；與AS組相比，鐵皮石斛組小鼠胸主動脈結構異常改善。油紅O染色結果顯示，與對照組相比，AS組小鼠胸主動脈中可見大量脂質浸潤；與AS組相比，鐵皮石斛組小鼠胸主動脈脂質浸潤改善。詳見圖1。

圖13組小鼠胸主動脈病理結構變化（比例尺： 25μm ）

（A為HE染色觀察胸主動脈病理結構；B為油紅O染色觀察小鼠胸主動脈脂質浸潤情況）

2.3鐵皮石斛對AS大鼠胸主動脈線粒體自噬水平的影響

與對照組相比，AS組小鼠胸主動脈Beclin1、LC3II蛋白表達減少（ Plt;0.05 ；與AS組相比，鐵皮石斛組小鼠胸主動脈Beclin1、LC3I蛋白表達增加（ Plt;0.05 ）。與對照組相比，AS組小鼠胸主動脈Beclin1、LC3ⅡmRNA表達減少（ Plt;0.05 ；與AS組相比，鐵皮石斛組小鼠胸主動脈Beclin1、LC3IImRNA表達增加（ Plt; 0.05）。詳見圖 2～ 圖4。

2.4鐵皮石斛對AS大鼠胸主動脈NLRP3炎癥體及 血清炎性因子水平的影響

與對照組相比，AS組小鼠胸主動脈NLRP3蛋白及mRNA表達增加（ Plt;0.05 ；與AS組相比，鐵皮石斛組小鼠胸主動脈NLRP3蛋白及mRNA表達減少C Plt;0.05） 。詳見圖 5～ 圖6。與對照組相比，AS組小鼠血清TNF- α 、IL-6、IL-18、IL-1β表達增加（ Plt;0.05） ；與AS組相比，鐵皮石斛組小鼠血清TNF- α 、IL-6、IL-18、IL-1β表達減少（ Plt;0.05） 。詳見圖7。

圖23組胸主動脈Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達條帶圖

圖53組胸主動脈NLRP3蛋白及mRNA表達比較

（A為3組胸主動脈NLRP3蛋白表達條帶圖；B為3組胸主動脈NLRP3蛋白表達比較；C為3組胸主動脈NLRP3mRNA表達比較。AS組與對照組相比， ；與AS組相比， #Plt;0.05 ）

（A為3組血清TNF-α水平比較;B為3組血清IL-18水平比較;C為3組血清IL-6水平比較；D為3組血清IL-1β水平比較。AS組與對照組相比， ^*Plt;0.05 ;與AS組相比， #Plt;0.05 ）

2.5Mdivi-1可逆轉鐵皮石斛對AS大鼠血脂、NLRP3及炎性因子水平

與對照組相比，AS組小鼠血清TC、TG、LDL水平升高（ Plt;0.05 ，NLRP3蛋白及mRNA表達增加（ Plt; 0.05），血清TNF- α 、IL-6、IL-18、IL-1β水平升高（ Plt; 0.05）；與AS組相比，鐵皮石斛組小鼠血清TC、TG、

LDL水平降低（ Plt;0.05 ，NLRP3蛋白及mRNA表達減少（ Plt;0.05） ，血清TNF- ?α 、IL-6、IL-18、IL-1β水平升高（ Plt;0.05 ；與鐵皮石斛組相比，鐵皮石斛十Mdivi-1組小鼠血清TC、TG、LDL水平升高（ Plt;0.05 ，NLRP3蛋白及mRNA表達增加（ Plt;0.05） ，血清TNF- ?α 、IL-6、IL-18、IL-1β水平升高（ Plt;0.05 。詳見表3、圖8、圖9。

注：AS組與對照組相比， ① Plt;0.05 ;與AS組相比， ② Plt;0.05 ；與鐵皮石斛組相比， ③ Plt;0.05 。

圖84組小鼠胸主動脈NLRP3蛋白及mRNA表達比較

（A為4組胸主動脈NLRP3蛋白表達條帶圖;B為4組胸主動脈NLRP3蛋白表達比較；C為4組胸主動脈NLRP3mRNA表達比較。AS組與對照組相比， ?Plt;0.05 與AS組相比， #Plt;0.05 ；與鐵皮石斛組相比 ，ΔPlt;0.05 ）

圖94組血清炎性因子水平比較

（A為4組血清TNF-α水平比較;B為4組血清IL-18水平比較;C為4組血清IL-1β水平比較;D為4組血清IL-6水平AS組與對照組相比， *Plt;0.05 ；與AS組相比， #Plt;0.05 ；與鐵皮石斛組相比 ，ΔPlt;0.05 ，

3討論

AS是由于內皮下LDL的滯留和修飾引起的脂質代謝紊亂，可引發炎癥反應并促進斑塊的形成。既往研究顯示，IL-1β、IL-18、TNF- α 、IL-6、IL-9、IL-12等細胞因子參與AS斑塊的形成[1°]。本研究結果顯示，AS小鼠胸主動脈損傷并可見斑塊形成，小鼠血清TC、TG、LDL水平增加，炎性因子IL-1β、IL-18、TNF- α 、IL-6水平明顯升高，與既往研究保持一致。近年來，在AS的預防、診斷和治療方面都取得了重大進展，但其仍是全球主要死亡原因[1]。因此，迫切需要挖掘新的藥物并進一步闡明AS的形成、進展和并發癥的分子機制

鐵皮石斛是一種天然的珍貴中藥，鐵皮石斛作為預防和治療疾病的功能性食品和草藥有著悠久的歷史。實驗研究表明，鐵皮石斛及其生物活性化合物具有抗氧化、抗炎和免疫調節等多種生物學特性，并表現出抗癌、抗糖尿病、心血管保護、胃腸道調節、肝保護、肺保護和神經保護等多種健康益處[\"1]，因此，被人們廣泛關注，成為研究熱點。近年來，研究發現鐵皮石斛對糖尿病心肌病[12]高血壓[13]等心血管疾病具有改善作用。此外，鐵皮石斛可改善肥胖小鼠脂質代謝異常[14]。目前，已有研究顯示，鐵皮石斛可聯合西藥用于治療冠心病心絞痛[，可改善AS損傷。本研究結果顯示，鐵皮石斛可改善AS小鼠的胸主動脈損傷，降低血清血脂水平及炎性因子水平，然而其中的分子機制有待深入研究。

線粒體自噬對心血管疾病發展和進展至關重要，包括AS、冠狀動脈疾病、糖尿病心肌病、心律失常、化療誘導的心臟毒性和心力衰竭[15]。自噬功能障礙可導致高炎癥和NLRP3炎癥體過度激活的疾病[16]。Fei等[17]研究發現，減輕巨噬細胞中自噬-活性氧（ROS）-NLRP3軸介導的炎癥反應可預防缺血性心肌損傷。此外，NLRP3炎癥體激活可介導炎癥反應并參與AS的發生和發展。因此，深人探究NLRP3炎癥體伴隨的可能分子機制將成為臨床治療AS的新方向。本研究結果顯示，AS小鼠胸主動脈中自噬相關蛋白Beclin1、LC3ⅡI表達減少，NLRP3炎癥體表達增加，鐵皮石斛可上調自噬水平并下調NLRP3表達。為了進一步驗證，使用線粒體自噬抑制劑Mdivi-1進行干預，結果顯示，Mdivi-1可逆轉鐵皮石斛對AS小鼠血脂、炎性因子水平及NLRP3炎癥體表達的作用。

綜上所述，線粒體自噬-NLRP3炎癥體在鐵皮石斛抗AS中發揮重要作用。鐵皮石斛可改善AS小鼠胸主動脈的病理損傷、自噬及NLRP3水平，且這種改善可被線粒體抑制劑所逆轉，為臨床AS的治療提供新的研究思路。

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