基于流式細(xì)胞儀分析的歐洲云杉原胚團(tuán)細(xì)胞核提取液篩選

中圖分類號：Q942 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1000-3142（2025）08-1475-09

Abstract：Nuclearsuspension isan important foundation foravarietyof molecularbiology researches.Toefectively preparethe nuclear suspensions of Norway spruce （Picea abies） proembryogenic masses （PEM），PEMs of Norway spruce embryoniccelines PaVII，PI3，andI5 wereusedas the materialsfornucleus extraction with sixlysis bufrs： （LB01，Otto's，Galbraith's，GPB，WPB and Tris·MgCl₂ ）.Based on detecting DNA content by flow cytometry，the quantityand qualityof the nucleus suspensions were evaluated to screen fortheoptimal extraction buffer.Further，the stability of optimal bufer and the integrity of nucleus were measured.Theresults wereas folows：（1） Compared with the otherlysates，the numberof nuclei obtainedofPaVI linePEMs from LBOlwas the highest，with loweramountof cell debris.（2）In addition，coefficients of variation（ CVs ）of GO/G1 and G2/M nuclei，obtained from LBO1，were not more than 5% . The CVs were relatively low.（3）The nuclei of different lines PEMs were extracted by LBO1.There was no significant diffrenceinthe numberofnuclei extractedandtheproportionofcelldebris among thedifferent lines.（4） The nuclear membrane of most cells maintained in a high integrity when the nuclei of Norway spruce PEMs were extracted via LBOl through morphology investigation.To sumup，compared with otherbuffers，LBOlis theoptimal one for Norway spruce PEMs nucleus extraction，which may provide reference for nucleus extraction from gymnosperms.

Key words： conifer， Picea abies，proembryogenic masses，plant nucleus extraction， flow cytometry

細(xì)胞核是真核生物最重要的細(xì)胞器之一，是親本遺傳信息的主要載體和執(zhí)行者（Gumberetal.，2019）。對植物細(xì)胞開展非對稱融合、基因組文庫構(gòu)建、核DNA、RNA、蛋白質(zhì)含量分析、染色體雜交育種等分子生物育種和單細(xì)胞核測序研究，均要求制備雜質(zhì)少、核數(shù)量多、完整性高的細(xì)胞核懸液（谷曉峰和馮丹，2022）。流式細(xì)胞術(shù)是利用流式細(xì)胞儀對處于流體系統(tǒng)中各種熒光標(biāo)記的微小顆粒進(jìn)行分析和分選的技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于包括但不限于細(xì)胞（核）計(jì)數(shù)、核型分析和基因組大小檢測（Dolezel etal.，2007；賴彪等，2019；黃雄等，2020）。并且，變異系數(shù)（coefficientof variation，CV）被用作評判細(xì)胞核提取效果的重要指標(biāo)。真核細(xì)胞核膜作為分離細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的膜結(jié)構(gòu)，起保障核內(nèi)遺傳物質(zhì)完整性和維持細(xì)胞生命活動機(jī)械特性的關(guān)鍵作用（聶斯，2016）。 4^′ ，6-二基-2-苯基吲哚（ ?4^′ ，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）是一種可穿透細(xì)胞膜的熒光染料，其通過嵌入細(xì)胞核雙鏈DNA，釋放藍(lán)色熒光，可用于熒光顯微鏡下觀測細(xì)胞核完整性（Reapeetal.，2008）。與動物細(xì)胞不同的是，植物細(xì)胞具有排列緊密的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)（Loureiroetal.，2021），特別是林木植物富含多糖、多酚等次生代謝物質(zhì)（鄭斯斯等，2020），細(xì)胞核提取難度大。植物細(xì)胞核懸液的制備通常使用機(jī)械法（Dolezelamp;Bartos，2005）和酶解法（Dolezel，1991），其中機(jī)械法常使用刀片等將浸在細(xì)胞核提取緩沖液的植物材料切碎，孵育數(shù)分鐘，釋放細(xì)胞核，再通過過濾和離心的方法獲得重懸細(xì)胞核懸液。李禎（2015）研究指出，從木本植物裂解制備細(xì)胞核懸液的提取液效果較佳的包括LB01、Otto’s、Galbraith's、GPB、WPB 和 Tris·MgCl₂ 等。其中，LBO1、Galbraith's和WPB分別是杉木（Cunninghamialanceolata）（沈捷等，2015）種子、梨（Pyrussinkiangensis）（劉鳳霞等，2018）和荔枝（Litchichinensis）（賴彪等，2019）的葉片細(xì)胞核最佳提取液。然而每種植物材料的細(xì)胞結(jié)構(gòu)異質(zhì)性大，因此需要對細(xì)胞核提取液進(jìn)行適當(dāng)?shù)膬?yōu)化和修改以適應(yīng)特定的材料（Collingsetal.，2021）。針葉樹是北半球林業(yè)重要的經(jīng)濟(jì)樹種，在生態(tài)環(huán)境中亦處于主導(dǎo)地位（Nystedtetal.，2013），而針葉樹含有更多的多糖類物質(zhì)（Dongamp;Dunstan，1996），其表面具有較厚的角質(zhì)層，胞內(nèi)次生代謝產(chǎn)物多，細(xì)胞核提取難度更大（田新民等，2011；沈捷等，2015）。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)已成為在單個(gè)細(xì)胞分辨率下探索細(xì)胞異質(zhì)性的有力工具（Srivatsanetal.，2019；Alietal.，2024），對針葉樹細(xì)胞核進(jìn)行提取，制備高純度細(xì)胞核有利于單細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用于裸子植物研究。

針葉樹云杉屬樹種是我國東北和西部高山地區(qū)森林的主要建群種（王樹源，2019）。其中，歐洲云杉（Piceaabies）是一種重要的造林樹種，兼具生態(tài)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其種子經(jīng)由體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)誘導(dǎo)產(chǎn)生的胚性細(xì)胞系已成為眾多植物生物學(xué)研究的模型（Nystedtetal.，2013）。相比植物葉片、種子、根系等組織，針葉樹原胚團(tuán)（proembryogenicmasses，PEM）組織松散且含水量高，這使得其細(xì)胞核提取方法和流程與其他植物組織相比可能有所不同。同時(shí)，PEM可分化發(fā)育成完整植株，是研究植物細(xì)胞全能性的重要材料。篩選適合歐洲云杉PEM的細(xì)胞核提取方法對于開展針葉樹細(xì)胞全能性研究具有重要意義。本研究以歐洲云杉PEM為材料，以機(jī)械法為基本方法，提取歐洲云杉PEM細(xì)胞核，基于流式細(xì)胞儀分析、組織化學(xué)染色顯微觀測，比較6種細(xì)胞核提取液（LBO1、Otto's、Galbraith's、GPB、WPB和Tris·MgCl₂ ）的核提取效率，擬探討以下問題：（1）哪種細(xì)胞核提取液提取獲得的細(xì)胞核數(shù)量最多、細(xì)胞碎片最少，該提取液篩選為最適提取液；（2）最適提取液在不同細(xì)胞系細(xì)胞核提取效率穩(wěn)定性如何；（3）最適提取液提取獲得的細(xì)胞核是否保持較高的核膜完整性。本研究以期獲得制備針葉樹PEM組織高純度、高完整性細(xì)胞核懸液的最適提取液，為裸子植物開展單細(xì)胞分辨率核遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)錄分析、組織異質(zhì)性分析、細(xì)胞命運(yùn)決定、發(fā)育軌跡方向等研究及未來在針葉樹基因工程領(lǐng)域中使用細(xì)胞核提供研究基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1植物材料

本研究以歐洲云杉胚性細(xì)胞系 PaV IⅢ、PI3、PI5的原胚團(tuán)（PEM）為研究對象。PEM增殖與保持方法參見Suárez和Bozhkov（2008）。將PEM置于含有植物生長調(diào)節(jié)劑的 1/2LP 固體培養(yǎng)基（添加激素： ；附加： 10g?L^-1 蔗糖 、4g?L^-1 植物凝膠 ?¹g?L^-1 酶解酪蛋白、 .0.5g?L^-1 谷氨酰胺）繼代增殖培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)環(huán)境為 25^°C ，黑暗條件，每兩周將PEM繼代轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基。

1.2細(xì)胞核提取方法

1.2.16種核提取試劑 本研究共采用6種細(xì)胞核提取液，具體如下。

（1）Otto's：Otto I與Otto I 按照體積比 2：1 配置。其中， OttoI：100mmol?L^-1 檸檬酸（北京酷來搏科技有限公司，中國）， 0.5% （V/V）Tween 20[生工生物工程（上海）股份有限公司，中國]， ΔpH 為 2.0～3.0，4^°C 保存；OttoI NaH₂PO₄ pH 為 8.0～9.0（Otto，1990）。

（2）LB01：15mmol?L^-1. 三（羥甲基）氨基甲烷[生工生物工程（上海）股份有限公司，中國]，2mmol ·L1 Na₂EDTA （北京酷來搏科技有限公司，中國） 0.5mmol?L^-1 四鹽酸精胺[生工生物工程（上海）股份有限公司，中國]， 80mmol?L^-1 KCl（北京化工廠，中國）， 20mmol?L^-1 NaCl（北京化工廠，中國）， 0.1%（V/V） TritonX-100[生工生物工程（上海）股份有限公司，中國]， 15mmol?L^-1β 巰基乙醇（上海麥克林生化科技股份有限公司，中國）， pH 為 7.0～8.0，-20^°C 保存，使用時(shí)解凍，解凍后 4‰ 保存（Dolezel etal.，2007）。

（羥甲基）氨基甲烷， 4mmol?L^-1 氯化鎂（北京化工廠，中國），0.5% （V/V）TritonX-100， pH 為 7.5，4°C 保存（Pfosser et al.，1995）。

（4）Galbraith's： 45mmol?L^-1MgCl₂ ，30mmol?L^-1 檸檬酸鈉（北京酷來搏科技有限公司，中國）， 20mmol?L^-1 MOPS（北京酷來搏科技有限公司，中國）， 0.1%（V/V）TritonX-100，pH 為7.0，-20C 保存，使用時(shí)解凍，解凍后 4‰ 保存（Galbraith etal.，1983）。

（5）GPB：0.5 mmol·L^-1 四鹽酸精胺，30mmol?L^-1 檸檬酸鈉， 20mmol?L^-1 MOPS，80mmol ·L^-1 KCl，20 mmol ·L^-1 NaCl， 0.5% （ V/V）TritonX-100， pH 為 ^7.0，4‰ 保存（Loureiro et al.，2007）。

（6）WPB：0.2 mmol·L^-1 Tris ?? HCI（北京酷來搏科技有限公司）， 4mmol?L^-1 氯化鎂， 2mmol ·L^-1Na₂EDTA，86mmol?L^-1NaCl，10mmol?L^-1 焦亞硫酸鈉（上海麥克林生化科技股份有限公司，中國）， 1% （V/V）PVP-10（Sigma，美國）， 1%（V/V） TritonX-100， pH 為 ^7.5，4°C 保存（Loureiro etal.，2007）。

1.2.2細(xì)胞核提取取歐洲云杉 PaV Ⅲ細(xì)胞系PEM6份，每份 0.5g ，將其放入直徑為 60mm 培養(yǎng)皿中，依次加入 1.5mL 前述配置的6種細(xì)胞核提取液。（1）破碎細(xì)胞：使用一次性刀片將其切碎，避免將其切得過于碎，無明顯粘連即可。（2）釋放細(xì)胞核：冰上提取 5min ，充分釋放細(xì)胞核。（3）除去未切碎的大塊植物組織：將提取液過濾至300目尼龍網(wǎng)（孔徑約為 40μm ），收集。（4）除去碎片小雜質(zhì)：水平離心機(jī)（Sigma3K15，德國），1000g 轉(zhuǎn)速， 離心約 8min ，除去上清液。（5）制備細(xì)胞核懸液：加人 100μL 的PBS緩沖液，重

懸細(xì)胞核。

1.3細(xì)胞核提取質(zhì)量檢驗(yàn)

1.3.1流式細(xì)胞儀分析取1.2.2中使用6種提取液提取 0.5gPaV Ⅱ細(xì)胞系PEM重懸的細(xì)胞核，經(jīng)50μg?mL^-1 碘化丙啶（propidiumiodide，PI）孵育15min ，PBS緩沖液清洗，再使用流式細(xì)胞儀（BDFACScans，德國）上機(jī)檢測經(jīng)PI染色的顆粒。采用 488nm 熒光強(qiáng)度激發(fā)， 580nm 熒光強(qiáng)度開始檢測， 610nm 的熒光強(qiáng)度來確定DNA分布，以檢測細(xì)胞核數(shù)量與質(zhì)量。提取得到細(xì)胞核數(shù)量多、細(xì)胞碎片少的提取液為最優(yōu)提取液。

為檢驗(yàn)最優(yōu)提取液對不同基因型細(xì)胞系的適用性，取 2gPaV ⅢI、PI3和PI5細(xì)胞系的PEM，使用最優(yōu)提取液進(jìn)行提核，上流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，每個(gè)細(xì)胞系重復(fù)3次。

1.3.2數(shù)據(jù)分析使用FlowJoTMv10.3（BDLifeSciences）進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。選定前向散射角信號（FSC） lt;492 000 ，側(cè)向散射角信號（SSC） lt; 560000內(nèi)的熒光信號為總的參與分析的熒光信號P1繪制散點(diǎn)圖。根據(jù)熒光信號光電轉(zhuǎn)換形成的電脈沖信號，圈畫出熒光信號聚集區(qū)域P2，即為參與分析信號（Pfosser etal.，1995；Loureiro et al.，2007）。根據(jù)DNA分布最大峰值前P3為細(xì)胞核碎片，最大峰值至第二峰值P4為處于細(xì)胞周期G0/G1 到G2/M 期的細(xì)胞核（Dolezel et al.，2007），計(jì)算G0/G1和G2/M的細(xì)胞核數(shù)量及變異系數(shù)。每組提取液運(yùn)行參數(shù)設(shè)置一致，比較分析各種細(xì)胞核提取液提取獲得的細(xì)胞核數(shù)量和碎片含量，產(chǎn)生更多單個(gè)細(xì)胞核和較少細(xì)胞核碎片的提取液為最優(yōu)提取液。使用GraphPadPrism8.02單因素方差分析歐洲云杉PEM細(xì)胞核效率基因型間差異。

1.4細(xì)胞核膜完整性檢測

處于增殖階段的歐洲云杉PaVⅢ細(xì)胞系使用體視顯微鏡（LEICAS6E，德國）觀測，PEM在液體培養(yǎng)基的形態(tài)使用光學(xué)顯微鏡（OlympusBX51，日本）觀測。PEM取經(jīng)最優(yōu)提取液進(jìn)行細(xì)胞核提取，重懸于PBS（北京酷來搏科技有限公司，中國），使用DAPI生工生物工程（上海）股份有限公司，中國]染色 5min ，再用PBS清洗掉附著的多余染料，充分稀釋后滴加到載玻片上，使用光學(xué)顯微鏡（OlympusBX51，日本）細(xì)胞核經(jīng)DAPI染色顯清晰的藍(lán)色熒光，由此觀測細(xì)胞核膜完整性。

2 結(jié)果與分析

2.1歐洲云杉胚性細(xì)胞系形態(tài)觀察

歐洲云杉PEM為半透明多細(xì)胞組織（圖1：A），隨增殖時(shí)間延長，細(xì)胞組織開始出現(xiàn)黃褐色。光學(xué)顯微鏡下可以觀測到歐洲云杉PEM中主要包含兩類形態(tài)完全不同的細(xì)胞（圖1：B，C）：小而細(xì)胞質(zhì)致密的細(xì)胞通常稱為分生細(xì)胞（meristemcell），大而高度液泡化的細(xì)胞通常稱為液泡細(xì)胞（vesiculatedcell）。大部分胚性細(xì)胞不具有明顯的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)（圖1：B），但也可以觀察到少量的早期體胚樣結(jié)構(gòu)（圖1：C）。

2.2不同細(xì)胞核提取液的效果比較

使用LBO1、Otto's、Galbraith's、GPB、WPB和Tris?MgCl₂6 種細(xì)胞核提取液分別處理 0.5g 歐洲云杉PEM，并使用流式細(xì)胞儀分析6種細(xì)胞核提取液的提取效率。結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)，PEM經(jīng)LB01提取液提取，得到細(xì)胞核數(shù)量最多，參與分析的細(xì)胞核數(shù)量達(dá)6169個(gè)；Otto's提取液次之，為5007個(gè);WPB和Tris·MgCl₂ 提取液提取的細(xì)胞核數(shù)量最少，分別為1290個(gè)和1327個(gè)；GPB和Galbraith's的提取效率中等，分別獲得3670個(gè)和3245個(gè)細(xì)胞核。GPB提取液產(chǎn)生了最多的細(xì)胞核碎片，流式細(xì)胞儀檢測獲得的完整細(xì)胞核不足總細(xì)胞核的 50% ；其他5種提取液獲得的完整細(xì)胞核占比為 65%～75% 。綜合考慮細(xì)胞核提取效率和細(xì)胞核的完整性，LB01提取液在保持細(xì)胞核完整性的基礎(chǔ)上具有最高的細(xì)胞核提取效率。此外，比較6種提取液GO/G1和 G2/M 的細(xì)胞核數(shù)量及其變異系數(shù)，相同質(zhì)量歐洲云杉PEM經(jīng)LB01提取液提取到G0/G1、G2/M的細(xì)胞核數(shù)量較多，CV 分別為 5.0% 和 4.4% ，均為6種提取液中最低（表1）。為驗(yàn)證LB01提取液提取歐洲云杉胚性細(xì)胞系的重復(fù)性及對不同基因型細(xì)胞系的適用性，使用LB01提取液提取 PaV IⅢI、PI5和PI33條不同PEM的細(xì)胞核。基因型間PEM細(xì)胞核的提取效率及細(xì)胞碎片的占比之間無顯著性差異（圖3：A，B），實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定。

2.3歐洲云杉胚性細(xì)胞系細(xì)胞核的完整性觀察

為進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞核膜的完整性，以判斷LB01提取液提取歐洲云杉PEM細(xì)胞核的提取效果，本試驗(yàn)對獲得的細(xì)胞核進(jìn)行了鏡檢。通過明

A.增殖培養(yǎng)基上的歐洲云杉胚性細(xì)胞系，比例尺 Ψ=1Ψcm ;B、C.光學(xué)顯微鏡下的歐洲云杉胚性細(xì)胞系包含細(xì)胞質(zhì)致密的分生細(xì)胞和高度液泡化的液泡細(xì)胞兩種細(xì)胞類型，比例尺 =100μm 。A.Norway spruce embryogenic callus cell line on proliferation medium，bar =1cm B ， C. The Norway spruce embryogenic callus under opticalmicroscope，note thedenselymeristemcelswith dense cytoplasmand highly vacuolated vesiculatedcells in thecallus， ：

圖1歐洲云杉原胚團(tuán)形態(tài)觀察

Fig.1Observations on the morphology of Norway spruce proembryogenic masses

視野/DAPI染色觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核被染上清晰的藍(lán)色熒光，LB01提取液提取獲得的細(xì)胞核大多保持了完整的核膜結(jié)構(gòu)（圖4）。綜上認(rèn)為，LB01提取液為提取歐洲云杉胚性細(xì)胞系細(xì)胞核的最優(yōu)提取液。

3討論與結(jié)論

本研究基于流式細(xì)胞儀比較分析6種細(xì)胞核提取液（LBO1、Otto's、Galbraith's、GPB、WPB和Tris?MgCl₂ ）提取歐洲云杉PEM細(xì)胞核的效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LB01提取歐洲云杉PEM獲得的細(xì)胞核數(shù)量最多，細(xì)胞碎片少，為最適提取液。這與劉倩和魏臻武（2014）發(fā)現(xiàn)的LB01是苜蓿（Medicagosativa）葉片細(xì)胞核最適提取液，陳林等（2020）發(fā)現(xiàn)的LB01是大豆（Glycinemaxcv.Williams82）根細(xì)胞核最適提取液，沈捷等（2015）發(fā)現(xiàn)的LB01是杉木根尖細(xì)胞核最適提取液的研究結(jié)果一致，說明LB01在不同物種間提取細(xì)胞核具有一定的普適性。

流式細(xì)胞儀是一種通過檢測細(xì)胞樣品中的熒光、吸收和散射等物理特性對樣品進(jìn)行快速分析和篩選的常用工具，可監(jiān)測細(xì)胞大小、染色體倍性等特征，從而判斷樣品質(zhì)量（陳林等，2020）。其中， CV 是流式細(xì)胞儀中檢驗(yàn)精準(zhǔn)度的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，

CV越小，說明細(xì)胞核完整性越好，碎片越少（黃雄等，2020）。一般而言，草本植物 CV 需小于 3.0% ，以及木本植物 CV 需小于 5.0% 即可被認(rèn)為合格（Dolezeletal.，2007；賴彪等，2019）。本研究中歐洲云杉屬于大型木本植物，LB01提取歐洲云杉PEM得到的GO/G1和 G2/M 細(xì)胞核CV分別為5.0% 和 4.4% ，均為6種提取液中最低且均不大于5.0% ，說明LB01作為歐洲云杉PEM細(xì)胞核提取液是合格的。

前人使用LB01對 0.1g 苜蓿幼嫩葉片（劉倩和魏臻武，2014）及 2cm 大豆幼嫩根尖（陳林等，2020）進(jìn)行細(xì)胞核提取，可分別獲得超過5000個(gè)、10000個(gè)有效細(xì)胞核。針葉樹中，沈捷等（2015）在使用LB01對杉木發(fā)芽種子細(xì)胞核提取研究中指出，20粒發(fā)芽種子可獲得100000個(gè)有效細(xì)胞核。本研究中，為獲得超過15000個(gè)有效細(xì)胞核，至少需 2g 歐洲云杉PEM，核提取效率較苜蓿、大豆等被子植物明顯低，而與杉木等針葉樹相當(dāng)。這說明相同細(xì)胞核提取液在物種間的提取效率差異明顯，可能是針葉樹含有更多的多糖類物質(zhì)（Dongamp;Dunstan，1996），并且組織表面具有較厚的角質(zhì)層，胞內(nèi)次生代謝產(chǎn)物多等所致（田新民等，2011；沈捷等，2015）。

細(xì)胞核提取液的主要成分及作用機(jī)理各不相同。LB01主要成分包括三（羥甲基）氨基甲烷、

A、B、C、D、E、F分別表示GPB、Galbraith's、LBO1、Otto's、WPB和 Tris?MgCl₂ 6種提取液處理 0.5g 歐洲云杉 PaV III PEM提取細(xì)胞核的上機(jī)檢測結(jié)果，提取液名稱后數(shù)字為每種細(xì)胞核提取液獲得的細(xì)胞核總數(shù)，P3為細(xì)胞核碎片，P4為完整細(xì)胞核，數(shù)字表示各自占總細(xì)胞核數(shù)的百分比 （%） 。 δG0/G1 、 G2/M 分別表示處于GO/G1、 G2/M 細(xì)胞周期的細(xì)胞核。A，B，C，D，E，andFindicates thenucleus analysis resultsof GPB，Galbraith's，LBO1，Oto’s，WPBand Tris ??MgCl₂ extraction bufferstreated with 0.5_gPaV PEMs.Thenumberunder thenameof theextractionbufferisthetotalnumberof nuclei obtainedforeach nucleusextractiontsopdbsateeflei（號 （%） ： G0/G1 and G2/M indicates the nucleus in the GO/G1 and G2/M phases of the cell cycle.

圖2不同細(xì)胞核提取液細(xì)胞核提取效果檢測

Fig.2Detection of nucleus extraction effect of different nucleus extraction buffers

KCl、NaCl和少量 β 巰基乙醇、 Na₂ EDTA 及TritonX-100等，三（羥甲基）氨基甲烷用于溶解核酸，KCl和NaC1維持電解質(zhì)平衡，有利于維持細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓（李明等，2019）。 β -巰基乙醇則有還原劑的作用，可破壞二硫鍵，有利于蛋白質(zhì)和多糖類物質(zhì)的降解（Yuetal.，2017）。TritonX-100和EDTA可以破壞細(xì)胞膜，使得細(xì)胞核易于釋放出來（李明，2015；徐晶晶，2017）。本研究中，歐洲云杉PEM包含部分早期體細(xì)胞胚胎（Suárezamp;Bozhkov，2008），其細(xì)胞壁包含更多的多糖類物質(zhì)，具更大厚度和更復(fù)雜結(jié)構(gòu)（Dobrowolskaetal.，

2011；Moussu et al.，2O13；González-Valenzuelaetal.，2023）。LB01所含有的化學(xué)成分特點(diǎn)可能與歐洲云杉PEM特性相匹配，但LB01的成分之一（即 β -巰基乙醇）具有毒性，高濃度的 β -巰基乙醇會破壞皮膚、眼睛、黏膜和上呼吸道（Dolezelet al.，2007），尋找低毒甚至無毒的代替品，如二硫蘇糖醇（DL-Dithiothreitol，DDT）（馮婷婷，2017），開發(fā)更快捷無毒的細(xì)胞核提取液將是后續(xù)進(jìn)一步優(yōu)化的方向。

流式細(xì)胞儀檢測具有一定局限性，其對細(xì)胞的檢測和分類是基于細(xì)胞形態(tài)學(xué)和熒光物質(zhì)，無

表1不同細(xì)胞核提取液的細(xì)胞核參數(shù)

Table1 Nucleus parameters of different nucleus extraction buffers

圖3LB01細(xì)胞核提取液提取不同細(xì)胞系細(xì)胞核的結(jié)果分析Fig.3Statistic analysis of the nuclei obtained from different cell lines with LB01 nucleus extraction buffer

相同字母表示不同細(xì)胞系差異不顯著（ Plt;0.05： 。Thesame letter indicatesno significant difference betweendifferentcelllines（ Plt;0.05， .

法準(zhǔn)確識別某些類型的細(xì)胞膜破損情況。本研究在流式細(xì)胞儀分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，通過DAPI染色及顯微觀測對獲得的細(xì)胞核膜完整性進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LB01提取歐洲云杉PEM細(xì)胞核被染上清晰的藍(lán)色熒光，核膜完整。這與陳林等（2020）使用DAPI染色觀測大豆根細(xì)胞核呈飽滿的圓形或者橢圓形懸浮在核提取液結(jié)果較為一致，說明LB01提取獲得的歐洲云杉PEM細(xì)胞核保持了完整的核膜結(jié)構(gòu)。

綜上所述，本研究通過比較分析6種不同提取液的核提取效率發(fā)現(xiàn)，LB01提取云杉PEM得到的細(xì)胞核數(shù)量最多，碎片占比少，其提取效率在不同基因型間穩(wěn)定性高且顯微觀測LB01提取細(xì)胞核膜完整性高。總體而言，LB01為最優(yōu)提取液，可有效提取歐洲云杉PEM細(xì)胞核，為針葉樹細(xì)胞核提取提供參考。

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圖4LB01提取液提取的歐洲云杉PEM細(xì)胞核

Fig.4The nuclei extracted from Norway spruce PEMs using LBO1 buffer

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（責(zé)任編輯 周翠鳴）