濕地松細(xì)胞系內(nèi)源激素及生理生化特性與成胚能力相關(guān)性研究

中圖分類號：Q945 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1000-3142（2025）08-1484-12

Abstract：Tostudy the corrlation between endogenous hormone content and physiological and biochemical characteristicsandsomatic embryogeniccapacityfordifferentcellinesofPinus eliotii，sevencellines inducedby immature seeds of P . eliotti were used as materials. The phenotype and cellular structure were observed，and the contents of endogenous hormones，soluble protein，soluble sugar，starch and antioxidant enzymeactivitieswere determined，followed bythematurationcultureoffiveselectedcellines.Inorder to explore the characteristicindex values that affecttheembryogeniccapacityofcellines，soastoidentifytheembryogeniccapacityofcellines with strong embryogeniccapacityin theearly stage，and provide technical reference foroptimizing the somatic embryogenesis and improving the somatic embryo induction rate of P .elliottii.Data analysis involved analysis of variance（ANOVA）， Duncan multiple range test，and pearson corelation analysis.The results were as follows：（1）Different cellines diffred in cytological observation，among which theV3O celline hadobviousand moreembryonal-suspensormass （ESM），indicating the V3O line was astrong embryonic line.（2）The endogenous hormone content was significantlyand differentamong cellines，withasignificant positive corelation among abscisic acid（ABA），trans-eatinriboside （ZR）and cellines，a significant negative correlationamong indoleaceticacid（IAA）content andcell lines，no significant difference among gibberellic acid （ GA₃ ） and no significant correlation among GA₃ and cell lines.（3）The soluble protein content，soluble sugar content，starch content，peroxidase （POD），superoxide dismutase（SOD），and catalase（CAT）activity were significantlydifferentamong cell lines，butshowedno obvious correlationwiththe embryogenicabilityofcellines.（4）Basedontheembryogenesis ofthecellineand the numberof matureembryos，the V30 celline hadahigh somaticembryogenesispotential.Inconclusion，thesomaticembryogeniccapacityof the P.eliotti cellineissignificantlycorrelated with theendogenoushormonecontent，whichcanprovidereference for improving theembryogeniccapacityofcell linesandoptimizing thematurationconditionsofsomaticembryosby regulating hormone levels，and also offers technical reference foroptimizing somaticembryogenesis and improving the somatic embryo induction rate in P .elliottii.

Key words：Pinus eliotii，cell line，physiological and biochemical，endogenous hormones，embryogenic capacit

濕地松（Pinuselliottii）為松科（Pinaceae）松屬（Pinus）喬木，原產(chǎn)于美國東南部，中國于20世紀(jì)30年代引種，因其表現(xiàn)出適應(yīng)性強(qiáng)、生長迅速和松脂產(chǎn)量高等特點(diǎn)而成為中國南方主要的造林樹種之一（田大倫等，2004）。濕地松苗木繁育主要采用傳統(tǒng)有性繁殖的方式，但種子園存在建設(shè)周期長、種子產(chǎn)量不穩(wěn)定和子代變異大等問題，而無性繁殖具有繁殖系數(shù)大、周期短和遺傳穩(wěn)定的特點(diǎn)，克服了有性繁殖的缺陷。體細(xì)胞胚胎發(fā)生（somaticembryogenesis，SE）是近年來無性繁殖技術(shù)的研究熱點(diǎn)，SE指的是利用離體的植物細(xì)胞，經(jīng)過一系列適宜的培養(yǎng)，誘導(dǎo)均勻的細(xì)胞系，經(jīng)過類似合子胚的發(fā)育途徑，發(fā)育成體細(xì)胞胚胎的苗木培育技術(shù)，充分體現(xiàn)了植物細(xì)胞的全能性（王詩憶等，2022）。SE在植物品種改良、人工種子制作和苗木繁殖等方面具有重大應(yīng)用價值（Garcia-Mendiguren etal.，2016;Jainamp;Gupta，2018），是基因工程和植物細(xì)胞生物學(xué)研究的理想系統(tǒng)（Maruymatamp;Hosoi，2019）。

濕地松SE研究在國外開始較早，如Jain等（1989）在改良WPM培養(yǎng)基中首次誘導(dǎo)出了濕地松胚性愈傷組織，誘導(dǎo)率為 2%～6% 。經(jīng)過30多年的研究，國內(nèi)外研究者先后建立了濕地松體胚發(fā)生與植株再生技術(shù)，獲得了濕地松體胚苗（唐巍等，1997；張彩云等，2016；Yangetal.，2020）。然而，到目前為止，很少看到濕地松體胚苗生產(chǎn)化應(yīng)用的相關(guān)文獻(xiàn)或報道。究其原因，現(xiàn)有的濕地松體胚發(fā)生體系仍存在胚性愈傷組織誘導(dǎo)率低、繼代培養(yǎng)過程中胚性退化、細(xì)胞系間胚性差異較大、體胚誘導(dǎo)率低、體系不穩(wěn)定等問題，其中細(xì)胞系胚性強(qiáng)弱直接影響體胚成熟效率。已有研究表明，細(xì)胞系的胚性受到多種因素的影響，如基因型、胚性愈傷組織狀態(tài)、胚柄細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu)、內(nèi)源激素含量、生理生化指標(biāo)含量和抗氧化酶活性都會影響其胚性的強(qiáng)弱（Wangetal.，2011；甄艷等，2013）。針葉樹種杉木（Cunninghamialanceolata）的體胚在發(fā)育過程中，內(nèi)源激素脫落酸（abscisicacid，ABA）與細(xì)胞系胚性密切相關(guān)，內(nèi)源ABA含量隨胚性的發(fā)育而增加，隨胚成熟而下降（Zhouetal.，2017）。在濕地松體胚發(fā)生研究中僅見不同胚性細(xì)胞系之間激素含量差異，高濃度的ABA有利于胚性愈傷組織的形成和成熟體胚的產(chǎn)生（程子珊等，2021），而關(guān)于濕地松不同胚性細(xì)胞系之間內(nèi)源激素與理化指標(biāo)差異尚未看到系統(tǒng)研究，與成胚能力的研究也尚未查到相關(guān)文獻(xiàn)。

本研究以濕地松7種不同細(xì)胞系的胚性愈傷組織為材料，采用不同細(xì)胞系的體胚誘導(dǎo)率評價體胚發(fā)生潛力，分析理化與激素等各項指標(biāo)與體胚數(shù)量的相關(guān)性，通過對比不同細(xì)胞系在形態(tài)特征、胚柄細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu)與數(shù)量、生理生化特性和內(nèi)源激素含量等方面的差異，探究影響細(xì)胞系胚性強(qiáng)弱的特征指標(biāo)值，早期判別胚性較強(qiáng)的胚性細(xì)胞系，為優(yōu)化濕地松體胚發(fā)生和提高體胚誘導(dǎo)率等方面的研究提供技術(shù)參考。本研究擬探討：（1）濕地松不同胚性細(xì)胞系愈傷組織表型特征、理化指標(biāo)及其激素指標(biāo)的差異；（2）影響濕地松細(xì)胞系胚性強(qiáng)弱的特征指標(biāo)值。

1材料與方法

1.1材料

濕地松未成熟球果采自浙江省余杭長樂林場濕地松高產(chǎn)脂種子園和江西省峽江縣林木良種場1.5代濕地松種子園。參試細(xì)胞系共有7個，其中V30、V342和S401細(xì)胞系是由浙江省余杭長樂林場濕地松高產(chǎn)脂種子園提供的不同家系未成熟種子誘導(dǎo)獲得的細(xì)胞系，S2.1、S16和S7（包括S7-2和S7-5細(xì)胞系，為同一家系不同未成熟種子誘導(dǎo)獲得，為不同基因型）細(xì)胞系是由江西省峽江縣林木良種場提供的不同家系未成熟種子誘導(dǎo)獲得的細(xì)胞系。

1.2方法

1.2.1胚性細(xì)胞系的誘導(dǎo)與增殖于2022年7月中下旬采集濕地松不同家系的健康未成熟球果，取出未成熟種子。首先，用自來水沖洗 30min ；然后，轉(zhuǎn)至操作臺中用體積分?jǐn)?shù)為 75% 的酒精消毒30s ，無菌水清洗3遍，并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.1% 的汞消毒 10min ，無菌水清洗5遍；最后，用無菌濾紙將種子表面多余的水分吸干，備用。將消毒后的種子用無菌手術(shù)刀和鑷子剝除種子的內(nèi)外種皮，并將其接種至胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（ MLP+ NAA+0.048mg?L^-1BR+5.0mg?L^-1 ABA + 450mg?L^-1 L-谷氨酰胺 +500mg?L^-1 肌醇 +500mg ：L^-1 水解酪蛋白 +30g?L^-1 蔗糖 +4.0g?L^-1 結(jié)冷膠）中，每皿10粒，每個家系接種30皿，培養(yǎng)溫度為（204 （23±1）^°C ，暗培養(yǎng)。2周左右胚性愈傷組織開始出現(xiàn)，當(dāng)其胚性愈傷組織團(tuán)（細(xì)胞系）為豌豆粒大小時進(jìn)行繼代增殖，將其接種至同一增殖培養(yǎng)基0 MLP+0.25mg?L^-16-BA+0.25mg?L^-1KT+4.00 mg?L^-1NAA+450mg?L^-1L -谷氨酰胺 +500mg?L^-1 肌醇 +500mg?L^-1 水解酪蛋白 +30g?L^-1 麥芽糖 + 4.0g?L -1結(jié)冷膠）中進(jìn)行繼代增殖，培養(yǎng)溫度為（23±1）^°C ，暗培養(yǎng)，每2周繼代1次。

1.2.2細(xì)胞系形態(tài)學(xué)及細(xì)胞學(xué)觀測當(dāng)濕地松每個細(xì)胞系的愈傷組織含量繼代至30～40皿時，采用肉眼和體視顯微鏡下觀測濕地松7個細(xì)胞系的形態(tài)特征。利用醋酸洋紅-伊文思藍(lán)的雙染色法觀測細(xì)胞胚性及其胚性胚柄細(xì)胞團(tuán)（embryonicsuspensormass，ESM）聚集情況，先對不同細(xì)胞系進(jìn)行染色，每個細(xì)胞系取相同質(zhì)量的愈傷組織置于載玻片上，并用醋酸洋紅染色 15min ，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.01% 的伊文思藍(lán)染色 3min ，壓片，在體視顯微鏡（德國奧林帕斯，GRGHT-BDEL）下觀測不同細(xì)胞系的ESM結(jié)構(gòu)與數(shù)量。

1.2.3激素及生理生化指標(biāo)測定方法對每個細(xì)胞系稱取 1g 胚性愈傷組織，3次重復(fù)，液氮速凍，超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?nèi)源激素的測定采用酶聯(lián)免疫法（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）（Yang JCet al.，20O1；YangYM et al.，2001；Zhaoetal.，2006）；可溶性蛋白（solubleprotein，SP）的測定采用考馬斯亮藍(lán)法（王學(xué)奎，1900）；可溶性糖（solublesugar，SS）、淀粉（starch）的測定采用蒽酮比色法（王學(xué)奎，1900）；超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）的測定采用氮藍(lán)四唑光化還原法（王學(xué)奎，1900）；過氧化物酶（peroxidase，POD）的測定采用愈創(chuàng)木酚顯色法（王學(xué)奎，1900）；過氧化氫酶（catalase，CAT）的測定采用紫外線吸收法（王學(xué)奎，1900）。

1.2.4胚性愈傷組織的成熟培養(yǎng)從濕地松7個細(xì)胞系中選取5個細(xì)胞系（V30、V342、S2.1、S16、S7-5）進(jìn)行成熟培養(yǎng)，先取 _lg 胚性愈傷組織在液體培養(yǎng)基 MLP+0.125mg?L^-16-BA+0.125mg?L^-1KT+ 2.00mg?L^-1NAA+450mg?L^-1I -谷氨酰胺 +500 mg?L^-1 肌醇 +500mg?L^-1 水解酪蛋白 +30g?L^-1 麥芽糖）中懸浮培養(yǎng)7d，再抽濾后置于成熟培養(yǎng)基（ MLP+450mg?L^-1L -谷氨酰胺 +500mg?L^-1 肌醇 + 500mg?L^-1 水解酪蛋白 +30g?L^-1 麥芽糖 +120g ·L-11 PEG8000+12mg?L^-1ABA+4.0g?L^-1 結(jié)冷膠）中，每皿 1g ，重復(fù)8次，培養(yǎng)溫度為 （23±1）^°C ，暗培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中使用的培養(yǎng)基、培養(yǎng)方式、培養(yǎng)時間和培養(yǎng)溫度等均一致，保證試驗中細(xì)胞系起始狀態(tài)一致。培養(yǎng)1月后，統(tǒng)計各細(xì)胞系的成熟胚數(shù)量。1.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 使用Excel2007、SPSS26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理和計算，通過單因素ANOVA方差檢驗和Duncan多重比較的方法探究各指標(biāo)在不同細(xì)胞系間的差異性，利用Pearson相關(guān)分析探究細(xì)胞系各指標(biāo)間的相關(guān)性，使用Origin2018軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1不同細(xì)胞系形態(tài)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)差異分析

不同細(xì)胞系的形態(tài)和細(xì)胞聚集情況存在一定差異，其中細(xì)胞系S401（圖1：G1、G2）、V342（圖1：E1、E2）的黏性較大，與其他細(xì)胞系狀態(tài)相比水漬化較嚴(yán)重;細(xì)胞系S16（圖1：F1、F2）的結(jié)構(gòu)蓬松、黏性較小，呈現(xiàn)絲絮狀；細(xì)胞系V30（圖1：D1、D2）、S2.1（圖1：A1、A2）、S7-5（圖1：C1、C2）、S7-2（圖1：B1、B2）的結(jié)構(gòu)緊致細(xì)密、黏性適中，呈現(xiàn)出白色透明銀耳狀。

細(xì)胞染色后，體式顯微鏡下清晰可見原胚團(tuán)結(jié)構(gòu)，但細(xì)胞系間胚柄細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu)差異較大，其中細(xì)胞系V30的ESM聚集成團(tuán)明顯（圖1中箭頭指向），S2.1其次，胚頭較大、胚柄較長。S401、S7-5、S7-2的原胚團(tuán)胚頭分布散亂，有少量聚集，胚柄為細(xì)長狀。細(xì)胞系S16的原胚團(tuán)胚頭有一定的聚集，但其胚柄存在畸形。基于圖1的觀察，細(xì)胞系胚性強(qiáng)弱初步判斷為 V30gt;S2.1gt;S7-2gt;S7-5gt;S401gt; V342gt;S16 。胚性強(qiáng)弱與體胚誘導(dǎo)率密切相關(guān)，一般而言，細(xì)胞系胚性越強(qiáng)，體胚誘導(dǎo)率越高。

2.2不同細(xì)胞系的內(nèi)源激素差異分析

2.2.1不同細(xì)胞系的玉米素核苷含量和吲哚丁酸（IAA）含量差異分析濕地松7個細(xì)胞系的玉米素核苷（trans-zeatinriboside，ZR）含量存在極顯著性差異（ Plt;0.01 ），其中V30中ZR含量 （2.09ng? （20g^-1ΣFW ）極顯著高于[除S16（ 2.00ng?g^-1FW ）和 S7-（204號 2（2.09ng?g^-1FW ）外]其他細(xì)胞系（圖2：A）。與ZR類似，吲哚乙酸（indoleaceticacid，IAA）含量在7個細(xì)胞系間具有極顯著性差異（ Plt;0.01 ），除S7-5外，IAA含量在兩兩細(xì)胞系間具有極顯著性差異。IAA含量與ZR含量在不同細(xì)胞系間表現(xiàn)相反，V30（ 13.94ng?g^-1 FW）和 S7-5（ 14.45ng?g^-1FW ）中IAA含量分別為最低和次低，S2.1（ 25.36ng?g^-1 FW）則極顯著高于其余細(xì)胞系（圖2：B）。

2.2.2不同細(xì)胞系的赤霉素（gibberellicacid， GA₃ ）含量和脫落酸（ABA）含量差異分析 GA₃ 含量在濕地松7個細(xì)胞系間存在顯著性差異（ Plt;0.05 ），其中細(xì)胞系 V342（1.87ng?g^-1FW） 顯著高于細(xì)胞系 V30（1.71ng?g^-1FW 7） .S16（1.72ng?g^-1FW） 、S2.1（1.65ng?g^-1 FW）（圖3：A）。7個細(xì)胞系間ABA含量呈現(xiàn)極顯著性差異（ ），細(xì)胞系V30的ABA含量（ 45.02ng?g^-1F W）極顯著高于其他細(xì)胞系，其次為 S7-5（39.56ng?g^-1FW） 。細(xì)胞系 S401（ 3.25ng?g^-1 FW） FW）、S 7-2（2.78ng?g^-1 FW） S16（3.25ng?g^-1 FW） .52.1（2.68ng?g^-1FW） 的ABA含量相對較低，均低于 4.00ng?g^-1 FW（圖3：B）。

2.3不同細(xì)胞系的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量與淀粉含量差異分析

對濕地松7個細(xì)胞系的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量和淀粉含量進(jìn)行方差分析（表1）。由表1可知，可溶性糖含量、可溶性蛋白含量與淀粉含量在細(xì)胞系間存在顯著性差異。濕地松7個細(xì)胞系的可溶性糖含量在 0.71%～1.11% 之間，細(xì)胞系V30、S401、V342S7-5的可溶性糖含量較高，均在 1% 以上，其中細(xì)胞系S401可溶性糖含量最高，達(dá) 1.11% 。細(xì)胞系 S7-2，S16，S2.1 中的可溶性糖含量則相對較低，均未達(dá)到 1% 。細(xì)胞系S401可溶性蛋白含量最高，平均為 17.59mg?g^-1 ，而細(xì)胞系 S2.1的可溶性淀粉含量最低，平均僅為 12.20mg?g^-1 。細(xì)胞系S7-2淀粉含量最高，平均含量可達(dá) 1.08% ，其次為細(xì)胞系S401，淀粉含量為 1.04% ，而細(xì)胞系V30的淀粉含量最低，僅為 0.66% 。

2.4不同細(xì)胞系的SOD活性、POD活性和CAT活性差異分析

濕地松不同細(xì)胞系間SOD活性、POD活性和CAT活性存在顯著性差異（表2）。由表2可知，細(xì)胞系V342、V30的SOD活性處于最高水平，均高于 11U?g^-1?min^-1 ，其次是細(xì)胞系 S16，而細(xì)胞系S2.1和S7-5中SOD活性相對較低，相較于細(xì)胞系V342活性降低約 45% 。細(xì)胞系S7-5的POD活性最高，為 566.67U?g^-1?min^-1 ，細(xì)胞系S2.1的POD活性最低，僅為細(xì)胞系S7-5中POD活性的14% 。細(xì)胞系S16的CAT活性最高，達(dá)3.40U·g^-1?min^-1 ，之后依次為 V342、57-5、S2.1、V30 S401、S7-2，細(xì)胞系S7-2的CAT活性最低，僅為S16中CAT活性的 21% 。

圖17個細(xì)胞系的形態(tài)與細(xì)胞結(jié)構(gòu)圖 Fig.1Morphology and cytostructure plots of seven cell lines

2.5不同細(xì)胞系的體胚成熟能力差異分析

由于細(xì)胞系S401在繼代過程中逐漸褐化死亡，細(xì)胞系S7-2和S7-5是從同一個家系誘導(dǎo)出的不同細(xì)胞系，因此從7個濕地松細(xì)胞系中挑選V30、V342、S2.1、S16、S7-5進(jìn)行體胚成熟培養(yǎng)，結(jié)果（表3，圖4）發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞系在體胚成熟能力上存在顯著性差異。體胚成熟能力最強(qiáng)的細(xì)胞系為V30（圖4：A-1、A-2），成熟體胚數(shù)量較多且多為正常胚；細(xì)胞系S2.1（圖4：C）在成熟培養(yǎng)過程中逐漸褐化，有少量成熟體胚出現(xiàn);細(xì)胞系V342、S7-5和S16未能產(chǎn)生成熟體胚，在培養(yǎng)過程中3個細(xì)胞系的狀態(tài)呈現(xiàn)差異化，細(xì)胞系S7-5（圖4：B）褐化，細(xì)胞系V342（圖4：D）也褐化且發(fā)干，而細(xì)胞系S16（圖4：E）則愈傷組織松散呈顆粒狀且發(fā)白。

圖2濕地松不同細(xì)胞系ZR含量和IAA含量的差異分析Fig.2Differenceanalysisof ZRand IAA contents in different cell lines ofPinus elliottii

不同大寫字母代表細(xì)胞系間在0.01水平上差異極顯著，不同小寫字母代表細(xì)胞系間在0.05水平上差異顯著。下同。 DiferentppaseleeseprentsiantfeceecellinatOevelilintlweaselp significant differences among cell lines at the O.O5 level. The same below.

圖3濕地松不同細(xì)胞系中 GA₃ 含量和ABA含量的差異分析

Fig.3Difference analysisof GA₃ and ABA contents in different cell lines of Pinuselliottii

2.6不同細(xì)胞系體胚成熟能力與內(nèi)源激素、生理生化指標(biāo)的相關(guān)性分析

細(xì)胞系體胚成熟能力與其內(nèi)源激素含量具有顯著相關(guān)性，而與生理生化指標(biāo)無顯著相關(guān)性。由圖5可知，細(xì)胞系內(nèi)源ZR含量與體胚成熟能力存在顯著正相關(guān)（ Plt;0.05 ），相關(guān)系數(shù)為

0.625；細(xì)胞系內(nèi)源IAA含量與體胚成熟能力存在極顯著負(fù)相關(guān)（ Plt;0.01 ），相關(guān)系數(shù)為-0.700；細(xì)胞系內(nèi)源ABA含量與體胚成熟能力存在極顯著正相關(guān)（ Plt;0.01 ），相關(guān)系數(shù)為0.973，說明ABA含量可能是影響細(xì)胞系成胚能力的關(guān)鍵內(nèi)源激素。

表1濕地松不同細(xì)胞系的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量及淀粉含量

Table1Soluble sugar，soluble protein and starch contentsin differentcelllinesofPinuselliottii

注：數(shù)據(jù)為均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤；同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示不同細(xì)胞系間差異顯著（ Plt;0.05） 。下同。

Note：The data in the table are ；lowercase lettersindicate significantdifferencesamong different cell lines（ Plt;0.05： .The same below.

表2濕地松不同細(xì)胞系抗氧化酶活性的差異Table 2Differences in antioxidant enzyme activitiesindifferentcell linesof Pinus elliottii

表3濕地松不同細(xì)胞系體胚成熟的差異Table3Differences in somatic embryo maturationindifferent cell lines of Pinus elliotii

3討論

3.1內(nèi)源激素對濕地松細(xì)胞系體胚發(fā)生潛力的影響

內(nèi)源激素是植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中的重要信號。賈小霞等（2009）研究表明，不同植物、同一植物的不同培養(yǎng)時期的愈傷組織往往存在差異，而愈傷組織差異與內(nèi)源激素差異和其他內(nèi)源因素有關(guān)。本研究對不同狀態(tài)的7個濕地松細(xì)胞系進(jìn)行了內(nèi)源激素含量測定和分析，結(jié)果表明內(nèi)源激素ABA、IAA、ZR含量在不同細(xì)胞系之間存在極顯著性差異，并且與濕地松細(xì)胞系體胚發(fā)生潛力存在顯著相關(guān)性，內(nèi)源激素 GA₃ 含量在不同細(xì)胞系之間存在顯著性差異，但與體胚發(fā)生潛力無相關(guān)性。

ABA是重要的植物激素，與種子成熟、植物衰老、抗逆性有關(guān)（段娜等，2015）。彭春雪（2023）研究發(fā)現(xiàn)，ABA參與植物發(fā)育的調(diào)節(jié)，促進(jìn)胚性愈傷組織的生長分化和胚狀體發(fā)育。Hazubska-Przybyl等（2008）對歐洲云杉（Piceaabies）和塞爾維亞云杉（P.omorika）的體細(xì)胞胚胎發(fā)生組織結(jié)構(gòu)及貯藏物質(zhì)積累的研究發(fā)現(xiàn)，將胚性愈傷組織放置在添加適量ABA的培養(yǎng)基中，會影響體胚成熟階段滲透壓的增加，從而在加速體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中貯藏物質(zhì)的積累，主要以淀粉粒和脂質(zhì)體的形式積聚在細(xì)胞內(nèi)，用于特定的代謝過程。在體胚發(fā)生過程中常常添加 20～120μmol?L^-1 ABA 促進(jìn)體胚成熟（Carnerose etal.，2017；Jianget al.，2021;Li et al.，2022;Peng et al.，2022），這與合子胚發(fā)育過程中需要通過積累大量ABA促進(jìn)成熟相似。本研究結(jié)果表明，濕地松細(xì)胞系基因型的胚胎成熟能力與細(xì)胞系的內(nèi)源ABA含量呈正相關(guān)，這與火炬松（Pinus taeda）（Pullman etal.，2003）和濕地松（程子珊等，2021）的研究結(jié)果一致，表明了ABA是影響體胚發(fā)生潛力的重要因素。當(dāng)受到外源激素的作用或其他的刺激時，胚性愈傷組織會通過調(diào)節(jié)ABA合成途徑上的關(guān)鍵酶活性或基因表達(dá)來調(diào)節(jié)ABA的積累，以維持合適的ABA水平（Kongamp;Von，2007）。同時，還會通過啟動ABA降解途徑加速ABA的分解，以達(dá)到負(fù)反饋調(diào)節(jié)的作用（吳鑫泉等，2020）。本研究中，為確保不同細(xì)胞系中ABA含量及其他激素的可利用量一致，在成熟實驗中添加相同的外源激素，采用相

A-1.V30整體；A-2.V30局部；B.S7-5；C.S2.1；D.V342；E.S16。

A-1.V30 overall;A-2.V30local;B.S7-5；C.S2.1;D.V342；E.S16.

圖4濕地松的5個細(xì)胞系體胚成熟情況

Fig.4Somatic embryo maturation in five cell linesofPinuselliottii

同的培養(yǎng)方式，探究內(nèi)源激素ABA的消耗能力，結(jié)果表明在相同條件下，細(xì)胞系V30產(chǎn)生的成熟體胚數(shù)量最多，說明其消耗ABA的能力最強(qiáng)，對外源激素ABA的利用率相對最高。

生長素是植物生長發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子，影響植物器官發(fā)育及形態(tài)建成（李哲馨等，2017）。前人在杉木中研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢體胚基因型與頑固基因型相比，表現(xiàn)出較低IAA水平，認(rèn)為IAA運(yùn)輸及積累對于體胚發(fā)育很重要（Zhouetal.，2017）。同樣地，Liao 等（2008）在云杉（Piceaasperata）中研究發(fā)現(xiàn)，體胚潛力較差的細(xì)胞系有較高水平的IAA，通過降低IAA含量，能提高體胚發(fā)生能力。本研究也得出了相同的結(jié)論，優(yōu)勢細(xì)胞系V30具有較低水平IAA，表明在胚性保持及體胚發(fā)育過程中，高水平IAA濃度會抑制濕地松的體胚成熟，低水平IAA濃度會促進(jìn)其體胚發(fā)生。但是，Vondraková等（2011）研究表明，IAA正調(diào)控細(xì)胞系胚性與體胚成熟，冷杉（Abiesnordmanniana）體胚發(fā)生能力強(qiáng)的細(xì)胞系中IAA水平高于胚胎發(fā)生能力弱的細(xì)胞系，IAA含量是影響不同細(xì)胞系胚發(fā)育的關(guān)鍵因素，與本研究結(jié)果相反。因此，IAA在不同物種體胚發(fā)生中的作用不同，可能與物種本身差異有關(guān)。

玉米素核苷（ZR）具有促進(jìn)細(xì)胞分裂和分化的作用，是一種細(xì)胞分裂素。郭宇等（2020）研究表明，在誘導(dǎo)胚性愈傷組織的階段需要添加高含量的外源ZR類激素，而在體胚成熟期中僅需要低水平的ZR，與本研究中濕地松多個細(xì)胞系的ZR含量都較低的結(jié)果相同。程子珊等（2021）在濕地松合子胚發(fā)育過程測定ZR含量時也有相同發(fā)現(xiàn)，V30、S16細(xì)胞系中ZR含量相對較高，ZR含量與各細(xì)胞系愈傷組織的胚性能力存在顯著正相關(guān)，但ZR含量在優(yōu)勢體胚細(xì)胞系V30與頑固體胚細(xì)胞系S16之間無顯著性差異。在相關(guān)性分析中，

表示指標(biāo)間相關(guān)性顯著（ Plt;0.05 ）； ^** 表示指標(biāo)間相關(guān)性極顯著（ Plt;0.01? 。

*indicates significant correlation among different indicators（ Plt;0.05. ； ** indicates extremely significant correlation among different indicators（ （Plt;0.01） 》

圖5濕地松不同類型細(xì)胞系性狀之間的相關(guān)性分析

5Correlation analysis among characteristics of different types of cell lines in Pinus ellioi

ZR含量與各細(xì)胞系體胚成熟能力的相關(guān)性小于內(nèi)源激素ABA、IAA與各細(xì)胞系體胚成熟能力的相關(guān)性，由此可見，ZR含量是影響各細(xì)胞系胚性強(qiáng)弱的因素，但不屬于關(guān)鍵因素。此外，關(guān)于ZR含量如何影響胚性愈傷組織成胚能力的文獻(xiàn)尚未查到，故ZR在濕地松體胚發(fā)生中具體如何發(fā)揮作用還需要相關(guān)研究進(jìn)一步驗證。

3.2可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白對濕地松細(xì)胞系體胚發(fā)生潛力的影響

在植物生長發(fā)育過程中，可溶性糖和淀粉是植物生長代謝所必需的能量供應(yīng)物質(zhì)，可以反映植物整體的碳供應(yīng)狀況（張恒等，2023）。可溶性糖作為直接供能物質(zhì)，為細(xì)胞擴(kuò)繁體胚發(fā)育提供物質(zhì)和能量基礎(chǔ)（江榮翠，2011）。淀粉作為植物的儲備碳水化合物，它能在種子發(fā)育過程中為合成代謝過程提供能量（Zeemanetal.，2010）。Peng等（2020）在研究紅松體胚細(xì)胞系增殖過程中發(fā)現(xiàn)，高體胚發(fā)生細(xì)胞系中的淀粉含量顯著高于無體胚發(fā)生能力細(xì)胞系，認(rèn)為在胚性愈傷中高含量的淀粉是體胚發(fā)生成功的基礎(chǔ)，與本研究得到的結(jié)果相反。本研究中，淀粉含量較低的細(xì)胞系更具有體胚發(fā)生潛力，這可能是與本研究測試的細(xì)胞系來自不同的家系，胚性愈傷組織的起源合子胚的淀粉差異較大所導(dǎo)致，也可能是因物種本身差異而導(dǎo)致。因此，淀粉含量高低與細(xì)胞系的體胚發(fā)生潛力相關(guān)性還有待于進(jìn)一步驗證。

可溶性蛋白質(zhì)作為重要的儲藏物質(zhì)，在體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中具有重要的研究意義（王慧純等，2018）。Cangahuala-Inocente等（2014）研究表明，蛋白質(zhì)影響胚胎發(fā)育及形態(tài)發(fā)生。李茜（2007）在白皮松（Pinusbungeana）體胚研究中發(fā)現(xiàn)，胚性愈傷組織的可溶性蛋白含量遠(yuǎn)高于非胚性愈傷組織，胚性細(xì)胞的代謝較為旺盛。雒盼妮等（2016）在探究胚性愈傷率誘導(dǎo)效果不同的普通小麥成熟胚之間的差異性時發(fā)現(xiàn)，小麥基因型不同，蛋白質(zhì)的含量也有所不同，小麥成熟胚的可溶性蛋白質(zhì)含量與胚性愈傷率呈顯著負(fù)相關(guān)，這與本研究結(jié)論相同。本研究中，細(xì)胞系S2.1和V30可溶性蛋白含量較低，但其胚性較強(qiáng)。考慮是因其本身細(xì)胞的胚性較強(qiáng)、酶活較強(qiáng)而導(dǎo)致催化效率增強(qiáng)，因消耗蛋白質(zhì)過快而導(dǎo)致可溶性蛋白含量較低，具體原因尚需進(jìn)一步研究。

3.3抗氧化酶對濕地松細(xì)胞系體胚發(fā)生潛力的影響

抗氧化酶常作為植物生理代謝活動的指標(biāo)酶，其活性可以反映出外植體生理代謝水平。辛福梅等（2007）研究表明POD在體胚誘導(dǎo)階段起主要作用，而SOD和CAT在體胚的發(fā)育和成熟中發(fā)揮主要作用。本研究認(rèn)為，不同發(fā)育狀態(tài)的胚性愈傷組織的抗氧化酶活性不同，適宜的POD、SOD和CAT活性有利于濕地松細(xì)胞系的胚性發(fā)育。Gallego等（2014）在苜蓿（Medicagosativa）誘導(dǎo)出胚性愈傷組織時發(fā)現(xiàn)，CAT活性降低且胚性愈傷組織CAT活性低于非胚性愈傷組織。荊茹月等（2020）在對樟樹（Cinnamomumcamphora）愈傷組織研究中發(fā)現(xiàn)，SOD活性增高及CAT活性降低會導(dǎo)致體胚發(fā)生頻率升高，這與本研究的結(jié)果相似。但是，Ma等（2012）在香蕉（Musanana）體胚研究中發(fā)現(xiàn)，CAT活性較高的胚性愈傷組織體胚發(fā)生潛力較高，這與本研究的結(jié)果相反。以上研究說明，抗氧化酶活性的高低在不同植物體胚發(fā)生過程中表現(xiàn)出差異性，不易作為胚性強(qiáng)弱的判斷指標(biāo)。

4結(jié)論

本研究對比濕地松不同細(xì)胞系之間的形態(tài)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、內(nèi)源激素含量及生理生化特性差異，并與體胚誘導(dǎo)能力進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞系之間內(nèi)源激素含量和理化特性均存在顯著性差異，但只有內(nèi)源激素含量與細(xì)胞系成胚能力的相關(guān)性顯著，其中ABA、ZR與細(xì)胞系成胚能力存在顯著正相關(guān)，而IAA含量與細(xì)胞系成胚能力存在顯著負(fù)相關(guān)，表明濕地松胚性細(xì)胞系中內(nèi)源激素可能是影響胚性與體胚成熟的關(guān)鍵因素。因此，在后期胚性提升和體胚成熟試驗中，可以通過降低培養(yǎng)基生長素IAA含量而增加ABA含量和細(xì)胞分裂素含量來實現(xiàn)，為胚性維持和提升、體胚成熟培養(yǎng)條件優(yōu)化等研究提供借鑒。

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（責(zé)任編輯蔣巧媛 王登惠）