鱈魚皮ACE抑制肽的制備工藝研究

中圖分類號：TS254.1 文獻標志碼：A 文章編號：1000-9973（2025）08-0142-11

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2025.08.020

引文格式：，等.鱈魚皮ACE抑制肽的制備工藝研究[J].中國調味品，2025，50（8）：142-152. LI S，CAI YT，HUAIJ，et al.Studyon preparationprocessof ACE inhibitory peptides fromcodskinJ].China Condiment， 2025，50（8）：142-152.

Abstract： With the gelatin of cod （Gadus morhua）skin prepared by water extraction method as the raw material，single factor test and response surface method are used to optimize the double-enzyme stepwise enzymatic hydrolysis process conditions of cod skin ACE inhibitory peptides. Combined with membrane separation method，the preparation process of cod skin ACE inhibitory peptides is established. The first step of enzymatic hydrolysis： enzyme type is hydrolase，enzyme addition amount is 4% ， solid-liquid ratio is 1：20 ， pH is 9，enzymatic hydrolysis temperature is 50^°C ，and enzymatic hydrolysis time is 4.5h ；the second step of enzymatic hydrolysis： enzyme type is flavourzyme，enzyme addition amount is 3% ，solid-liquid ratio is 1：20 ， ΔpH is 6，enzymatic hydrolysis temperature is 40^°C ，and enzymatic hydrolysis time is membrane separation method：1o，3，1 kDa ultrafiltration membranes are used respectively for the separation of obtained enzymatic hydrolysates to obtain the target components. The IC₅₀ value of ACE inhibitory rate of the product prepared under double-enzyme stepwise enzymatic hydrolysis process conditions is 1.46mg/mL ， the total content of free amino acids is 71.04mg/100g ，and the polypeptides with the molecular weight below 1 ooo Da account for 99.5% ； the ACE inhibitory rate of collagen peptides from cod skin produced after 1 kDa membrane separation increases by 4.25 times. In this study，the preparation method of cod skin collagen peptides with high ACE inhibitory activity is established，and the prepared product can layamaterial foundation for the development of functional antihypertensive condiments and foods.

Key words： cod skin; double-enzyme stepwise enzymatic hydrolysis method; membrane separation; ACE inhibitory peptides;free amino acids

高血壓是引發心血管疾病的主要因素，目前主要使用含血管緊張素轉換酶抑制劑（angiotensinconvertingenzymeinhibitor，ACED的藥物來治療高血壓。常規的高血壓藥物藥效短、斷藥后極易復發，長期使用可能會引發頭暈、惡心和高鉀血癥等副作用[1]。食品中的天然ACE抑制劑一直是研究熱點，而從魚類膠原蛋白中分離出的生物活性肽有顯著的ACE抑制活性，近年來，從馬面魚皮[2]、鱈魚皮[3]、羅非魚皮[4]等海洋膠原蛋白中提取的多肽均表現出良好的ACE抑制活性。

鱈魚（Gadusmorhua）是全球捕撈量最高的魚類之一，我國每年鱈魚加工量超過50萬噸，其中鱈魚皮約占加工廢棄物的 7%～8%^[5] ，這些廢棄物大部分被廢棄，少量用于養殖飼料的生產。鱈魚副產物可作為ACE抑制劑來源，因此，建立一種高ACE抑制活性肽的制備工藝尤為重要。與化學水解相比，酶解法具有條件溫和、反應可控、效率高、選擇性好等優點，是多肽可持續生產的策略。目前大多數研究只針對單酶來優化工藝，單酶酶解對酶解產物的作用位點和分子結構作用有限，雙酶分步酶解可以更有效地針對不同的作用位點，利用酶的選擇性、特異性差異，最終產生不同的感官特性[]，通過優化雙酶分步酶解工藝，根據酶解產物的電荷和分子量，使用超濾膜來分離組分，可以得到穩定、高活性的小分子ACE抑制肽[8]

本研究通過單因素試驗和響應面法建立了從鱈魚皮中分離ACE抑制肽的最優雙酶分步酶解工藝，分析了游離氨基酸含量和分子量分布，采用膜分離方法進一步分離純化，獲得具有高ACE抑制活性的鱈魚皮膠原蛋白肽，為研發降壓調味品和飲品、提高副產物的附加值提供了理論基礎。

1材料與方法

1.1 材料與試劑

鱈魚皮：；水解蛋白酶（400 000U/g） 、風味蛋白酶 （200 000U/g） 、堿性蛋白酶（200 000U/g） ：隆科特酶制劑有限公司；復合蛋白酶號 （150 000U/g） 、中性蛋白酶 ?100 000U/g? ：丹麥諾維信公司；ACE：上海穎心實驗室設備有限公司；馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（HHL）、馬尿酸（HA）、鄰苯二甲醛（OPA）：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-1800紫外可見分光光度計翱藝儀器（上海）有限公司；GL-21M高速離心機上海盧湘儀離心機儀器有限公司；VELPRX3渦旋儀蘇州拜瑞斯儀器有限公司；HH-B8數顯恒溫水浴鍋常州金壇良友儀器有限公司;SHA-B雙功能水浴恒溫振蕩器金壇市億通電子有限公司；VQ-CORE-QUAT-01高效液相色譜儀美國賽默飛世爾科技公司;AS-LGJ-1OFG 真空冷凍干燥機鄭州宏朗儀器設備有限公司；DMJ60-3膜分離設備博納生物科技集團有限公司。

1.3方法

1. 3.1 原料預處理

將鱈魚皮去鱗并剪成 2cm×2cm 的碎片，使用0.05mol/LNaOH （料液比為 1：6 浸泡 ^12h ，清洗至中性；用 10% 的正丁醇以 1：10 的料液比浸泡 24h 后清洗至中性；將處理后的魚皮與蒸餾水按 1：10 的比例混合[9]，在 50^°C 下熱水抽提過夜，抽提液以 9000r/min 離心 20min ，取上清液，濃縮后將其凍干，將制備的明膠置于- -80°C 冰箱中備用。

1.3.2雙酶分步酶解法蛋白酶種類篩選

將制備得到的鱈魚皮明膠以料液比為 1：20 溶于蒸餾水中，分別加入5種不同類型的酶，加酶量為 2% 根據說明書的最適溫度和pH進行酶解（見表1），酶解4h后，沸水加熱 20min 滅酶，再以 9000r/min 離心 20min ，重復3次，取上清液分別測定其水解度和ACE抑制率，篩選出兩種效果較好的酶。

表1不同蛋白酶的酶解條件

Table1 Enzymatic hydrolysis conditions of different proteases

1.3.3 單因素試驗設計

以水解度和ACE抑制率為指標，采用單因素試驗考察加酶量、酶解溫度、pH、酶解時間和料液比對鱈魚皮酶解效果的影響。具體條件：水解蛋白酶和風味蛋白酶分別在溫度40，45，50，55，60℃和35，40，45，50，55°C ·pH7，8，9，10，11 和5，6，7，8，9；酶解時間2，4，6，8，10h 和 2，4，6，8，10h ;加酶量 1%.2%.3% 、4%.5% 和 1%.2%.3%.4%.5% ;料液比 1：10.1：20 1：30.1：40.1：50 和 1：10，1：20，1：30，1：40，1：50 下對酶解工藝進行優化。

1.3.4 響應面試驗設計

根據單因素試驗結果設計響應面試驗，水解蛋白酶和風味蛋白酶均選取對ACE抑制率有顯著影響的3個因素（酶解時間、酶解溫度、pH）計算ACE抑制活性。響應面試驗因素與水平設計見表2和表3。

表2水解蛋白酶響應面試驗因素與水平設計

Table 2 Design of factors and levels of response surface test for hydrolase

表3風味蛋白酶響應面試驗因素與水平設計

Table 3 Design of factors and levels of response surface test for flavourzyme

續表

1.3.5雙酶分步酶解法酶組合研究

根據響應面優化的參數分別探討雙酶組合的順序，添加順序見表4。雙酶依次酶解完成后， 100^°C 滅酶 20min ，冷卻至室溫，以 離心 20min ，重復3次，取上清液分別測定其水解度和ACE抑制率。

表4不同蛋白酶組合酶解

Table4 Enzymatic hydrolysis ofdifferent combinations of proteases

1.3.6 水解度（DH）測定

參考劉夢琪等[0]的方法，采用鄰苯二甲醛（OPA）法測定鱈魚皮酶解液的水解度，絲氨酸標準曲線繪制：配制 0.1mg/mL 絲氨酸標準溶液，依次吸取50，100，200，300，400μL 標準溶液于EP管中，加入去離子水補足至 400μL ，加入 3mL 配制好的OPA試劑，在渦旋儀上充分混合 20s ，反應 2min 后測定其在 340nm 處的OD值，得到線性回歸方程 Y=0.9355X+0.00647，R²= 0.9998。

樣品測定：吸取 400μL 酶解液于EP 管中，加入 3mL 配制好的OPA試劑，在渦旋儀上充分混合 20s ，反應2min 后測定其在 340nm 處的OD值，水解度計算公式如下：

式中： ?H_tot 為每克鱈魚皮肽鍵毫摩爾數， 8.6mmol/g^[11] H 為每克鱈魚皮明膠被裂解的肽鍵毫摩爾數，mmol- ?NH₂ 。

1.3.7 ACE抑制率測定

參考李佳伶等[12]的方法并略作修改。將 20μL 樣品溶液與 20μL ACE溶液 100U/L） 于 1.5mL 離心管中混合， 37^°C 水浴 10min 后，將 20μL 底物（含 6.5mmol/L HHL 和 0.3mol/LNaCl 的 0.1mol/L 硼酸鹽緩沖液，pH8.3AA 加入混合物中開始反應， 37^°C 水浴 60min 后加入50μL HCl （ 1mol/L 終止反應，取 20μL 混合溶液用于HPLC分析。

HPLC檢測分析條件：色譜柱：大連依利特E3419812C₁₈（4.6mm×250mm，5.0μm） ，流動相A：水溶液 （1‰ 三氟乙酸），流動相B：乙腈溶液（ 1‰ 三氟乙酸）；洗脫梯度： 0～20min . 40%～40% B;柱溫： 25°C ；洗脫流速：0.8mL/min ;進樣體積： 20μL ;波長： 228nm 。ACE抑制率計算公式如下：

ACE抑制率 0

式中： A₀ 為空白組中生成馬尿酸的峰面積，mAU ? min;A₁ 為加入抑制劑組中生成馬尿酸的峰面積， mAU?min 。

1.3.8 分子量測定

標準曲線的繪制：準確稱取尿昔 （244.2Da） 、假二肽（ （480.55Da） 、五勝肽 （802.054Da） 、抑菌肽 （1422.693Da） 0和細胞色素 C（12384Da） 各 25mg ，定容于 5.0mL 容量瓶中，配制成 5.0mg/mL 的混合標準品溶液。

高效液相色譜（HPLC）測定分子量分布參考李清嵐等[13]的方法：色譜柱：TSKgel G3000 SWXL（ 7.8mm× 300mm，5.0μm） ；流動相A：水溶液 （1‰ 三氟乙酸），流動相B：乙腈溶液（ 1‰ 三氟乙酸）；洗脫比例： 45% B；洗脫流速： 0.5mL/min ；柱溫： 30^°C ；檢測時間： 40min ；進樣體積： 10μL ；波長： 220nm 。

1.3.9 游離氨基酸組成

參考艾媛媛等[14]的方法，取 1.0g 酶解凍干粉，加人 15.0mL0.02mol/L 稀鹽酸， 9000r/min.4^°（ °C 離心10min 后取上清液，再加入 2.0mL 5% 的磺基水楊酸溶液使多肽和蛋白沉淀， 離心 10min 經 0.22μm 濾膜過濾后用于游離氨基酸組成分析。

1. 3.10 膜分離方法

參考劉華宇等[15]的方法，將所得酶解液依次采用10，3，1kDa 的超濾膜對酶解產物進行分離，獲得 gt;10kDa 、 和 個組分凍干粉，將各部分凍干粉依次采用1.3.7中方法測定其ACE抑制率，基于所得結果確定鱈魚皮ACE抑制肽膜分離參數。

1. 4 數據統計

運用Origin2018和SPSS26.0軟件對數據進行處理和顯著性分析，響應面優化采用Design-Expert8.0軟件進行。

2 結果與分析

2.1雙酶分步酶解法蛋白酶種類篩選結果

選擇合適的蛋白酶可以優化酶解條件，提升水解度和ACE抑制率，因此，本研究首先對酶的種類進行篩選，結果見表5。

表55種不同蛋白酶水解度及其ACE抑制率Table5 Hydrolysis degrees and ACE inhibitionrates of five different proteases

由表5可知，風味蛋白酶和水解蛋白酶的ACE抑制

率較高，分別為 （45.98±0.59） 和 （40，70±0.77）% 。水解蛋白酶可以提升水解效率，風味蛋白酶能減少苦味肽的生成，從而提升ACE抑制肽產品的感官品質，使其具備作為抗高血壓功能性食品成分的開發潛力[16]。因此，風味蛋白酶和水解蛋白酶可作為后續研究用酶。

2.2單因素試驗結果

2.2.1水解蛋白酶單因素試驗結果

A45 40一ACE抑制率+水解度4035寶 T 32525V20 2040 45 50 55 60酶解溫度/℃B45 40-ACE抑制率一水解度402525 %20 7 8 9 10 11 20pHC45 ACE制率48 +水解度403025廣 24202 4 6 8 10酶解時間/hD55 36→ACE抑制率→水解度5032b b ab aT 28度C2430 興25 201 2 3 4 5加酶量/%

圖1水解蛋白酶各因素對ACE抑制率和水解度的影響 Fig.1Effect ofvariousfactors of hydrolase on ACE inhibitoryrate and hydrolysisdegree

注：不同小寫字母表示差異顯著 ?Plt;0. 05 ），相同小寫字母表示差異不顯著（ Pgt;0.05） ，下圖同。

酶解溫度、 pH 、酶解時間、加酶量和料液比是影響酶解過程的關鍵因素，對其考察具有重要意義。由圖1中A可知，在 50^°C 時水解蛋白酶的ACE抑制率最高，達40.72% ，水解度也達到最大值 30.40% ，酶解溫度繼續升高會使酶的活性降低并且對酶與底物結合位點的附著能力產生負面影響[17]，因此酶解溫度選擇 50^°C 。由圖1中B可知，在 pH 為9時水解蛋白酶的水解度最高，達 30.85% ，ACE抑制率也達到最大值 40.33% ，繼續升高 pH 會使酶與底物的結合受阻[18]，因此 pH 選擇9。由圖1中C可知，在酶解 時，ACE抑制率最高，為40.86% ，水解度為 30.01% ，延長酶解時間 （gt;4h） 會導致明膠過度降解，酶活性降低，因此酶解時間選擇 4h 由圖1中D可知，當水解蛋白酶用量為 4% 時，水解度為31.04% ，ACE抑制率為41. 48% ，此時酶與底物的反應趨于飽和，繼續增加加酶量會使ACE抑制率下降，因此加酶量選擇 4% 。由圖1中E可知，當料液比為 1：20 時，水解產物的ACE抑制率達到最大值 42.89% ，水解度也達到最大值 31.06% ，繼續增加料液比會使明膠酶解不充分[19]，因此料液比選擇 1：20 。通過上述分析，確定了水解蛋白酶各因素的最佳條件。

2.2.2 風味蛋白酶單因素試驗結果

圖2風味蛋白酶各因素對ACE抑制率和水解度的影響 Fig.2Effect of various factors of flavourzyme on ACE inhibitory rate and hydrolysis degree

風味蛋白酶不僅能賦予食品獨特的口感和風味，而且在鱈魚皮ACE抑制肽酶解中表現優異，通過單因素試驗優化其酶解條件以期改善風味，提高功能性。由圖2中A可知，在 40°C 時風味蛋白酶的ACE抑制率達到峰值 46.31% ，此時水解度為 13.45% ，酶解溫度繼續升高，酶結構穩定性下降[20]，ACE抑制率下降，因此酶解溫度選擇 40^°C 。由圖2中B可知，在 pH 為6時風味蛋白酶的ACE抑制率達到峰值 46.32% ，水解度為 13.56% ，這可能是由于風味蛋白酶的最佳 pH 范圍為 6～7 ，因此 pH 選擇6。由圖2中C可知，在酶解 時ACE抑制率最高，為 46.82% ，水解度為 13.60% ，酶解時間過短無法完全反應，酶解時間過長酶活性降低，因此酶解時間選擇 ⁴h 。由圖2中D可知，風味蛋白酶添加量為 3% 時ACE抑制率達到最高，為 58.75% ，水解度為 14.01% ，繼續增加加酶量，底物有限[21]，ACE抑制率開始下降，因此加酶量選擇 3% 。由圖2中E可知，當料液比為 1：20 時，ACE抑制率達到峰值 57.22% ，水解度為 14.75% ，溶劑過多會減少底物與酶碰撞的機會[22]，使ACE抑制率下降，因此料液比選擇 1：20 。

2.3 響應面試驗結果分析

2.3.1 響應面試驗結果及方差分析

響應面法（RSM）是一種廣泛使用的數學統計技術，可用于建模和提高ACE抑制率，本試驗利用單因素試驗篩選出3個因素進行響應面試驗，建立雙酶分步酶解工藝的優化方法。首先，通過對ACE抑制率進行多重擬合回歸得到兩種酶的二次多項式回歸模型：水解蛋白酶ACE抑制率 （Y₁）=43.14+1.22A+1.71B- 0.94C-2.26AB-1.44AC-2.52BC-1.97A²-3.79B²- 5.30C² ；風味蛋白酶ACE抑制率 （Y₂）=58.70+1.18A+ 1.36B-2.86C-2.81AB+1.70AC+1.46BC-5.18A²- 7.41B²-5.69C² 。雙酶分步酶解響應面試驗結果分別見表6和表8，方差分析結果分別見表7和表9。

表6水解蛋白酶響應面試驗設計與結果

Iable6 Response surface test design and results of hydrolase

表7水解蛋白酶回歸模型方差分析結果

Table 7 Variance analysis results of hydrolase regression model

注：“ ”表示影響極顯著 （Plt;0.001） ；“ ?? ”表示影響較顯著 （Plt;0.01） ；“ ”表示影響顯著（ Plt;0.05 ，表9同。

Table 8 Response surface test design and results of flavourzyme

表9風味蛋白酶回歸模型方差分析結果Table 9Variance analysis results of flavourzymeregression model

表8風味蛋白酶響應面試驗設計與結果

續表

由表7和表9可知，兩個回歸模型的 P 值均小于0.0001，影響極顯著。失擬項的 P 值分別為0.3676和0.182 4.P 值均大于0.05，表明模型的擬合效果良好，兩個模型能夠可靠地預測響應值。水解蛋白酶模型的決定系數 R² 為0.976 2，調整后的決定系數 R_Adj² 為0.939 1;風味蛋白酶模型的決定系數 R² 為0.9798，調整后的決定系數 R_Adj² 為0.9537。兩個模型均表現出平均值變化小、精度高和測試值可靠性強的特點。

對響應面試驗結果進行多元回歸分析，結果表明，水解蛋白酶的一次項 A （酶解時間） B （酶解溫度） C（pH） 以及二次項 A²，B²，C² 對ACE抑制率有顯著影響（ Plt; 0.05）;交互項 AB （酶解時間與酶解溫度）和 BC （酶解溫度與 pH） 對響應值有較顯著影響（ Plt;0.01） ，而 AC （酶解時間與 pH） 具有顯著影響（ Plt;0.05） 。風味蛋白酶的一次項A、B、C，交互項 AB 、AC，二次項 A² 、 B² 、 C² 對ACE抑制率有顯著影響 （Plt;0.05） 。研究結果表明，各因素之間存在交互作用，而非簡單的線性關系。水解蛋白酶參數中，對ACE抑制率的影響順序為酶解溫度 gt; 酶解時間 gt;pH ；風味蛋白酶參數中，對ACE抑制率的影響順序為 pHgt; 酶解溫度 gt; 酶解時間。

2.3.2 各因素之間交互作用分析

分析酶解溫度、酶解時間、pH對ACE抑制率的影響，三因素兩兩交互作用的響應面圖和等高線圖見圖3和圖4。等高線圖的形狀（橢圓形或圓形）可以反映兩個自變量之間交互作用對ACE抑制率的影響程度，橢圓形表示兩個自變量之間有較強的交互作用[23]

圖3水解蛋白酶各因素交互作用對ACE抑制率影響的響應面圖和等高線圖

Fig.3Response surface diagrams and contour plots of effects of the interaction of various factors of hydrolase on the ACE inhibitoryrates

由圖3可知，酶解時間與酶解溫度（AB）及酶解溫度與 pH（BC ）的交互作用的等高線呈橢圓形且響應面坡度陡峭，可見這兩組的交互作用對ACE抑制率的影響較顯著；AC的交互作用雖略弱，但其等高線亦呈輕微橢圓形，交互作用顯著，與方差分析結果一致。

圖4風味蛋白酶各因素交互作用對ACE抑制率影響的響應面圖和等高線圖

Fig.4Response surface diagrams and contour plots of effectsof the interaction of various factors of flavourzymeon the ACE inhibitoryrates

由圖4可知，酶解時間與酶解溫度（AB）的交互作用的等高線呈橢圓形，表明二者的交互作用對ACE抑制率有較顯著影響。酶解時間與 pH（AC 的交互作用的響應曲面坡度較陡峭且等高線呈橢圓形，表明二者的交互作用對ACE抑制率有顯著影響。由此可見，在風味蛋白酶酶解過程中，酶解時間與酶解溫度的協同優化是提高ACE抑制率的關鍵步驟。

通過響應面軟件分析得到雙酶分步酶解的最優工藝條件：酶類型為水解蛋白酶，酶解溫度為 50^°C ，料液比為 1：20 ，酶解時間為 4.5h ，加酶量為 4%，pH 為9，預測ACE抑制率為 43.56% ，在此條件下進行試驗驗證，ACE抑制率為 （44.67±0.65）% ；酶類型為風味蛋白酶，酶解溫度為 40°C ，料液比為 1：20 ，酶解時間為 ⁴h 加酶量為 3% ，pH為6，預測ACE抑制率為 59.11% ，在最優條件下進行試驗驗證，ACE抑制率為 （57.82±0.72）% 與模型預測值的誤差小于 1% ，證實了預測工藝的有效性和可靠性。

2.3.3 雙酶分步酶解順序

單一酶在水解過程中往往只能特異性地作用于某一類或某幾類肽鍵，導致酶解產物的多樣性和功能性受限，而雙酶分步酶解可以利用不同酶的特異性，依次作用于不同類型的肽鍵，產生更豐富的多肽種類，從而提高 ACE 抑制活性[12]。雙酶分步酶解試驗結果見表10。

表10雙酶分步酶解試驗結果 Table1o Results of double-enzyme stepwise enzymatic hydrolysis test

由表10可知，雙酶分步酶解的ACE抑制率相比單酶酶解顯著提升。ACE抑制率與水解度呈正相關，水解蛋白酶 + 風味蛋白酶的水解度最高，為 （32.07±0.62）% 其ACE抑制率也達最大值 65.44±0.53）% 。

研究表明，不同酶的協同效應可以提高ACE抑制肽的得率[14]，通過雙酶分步酶解，可以更有效地生成具有ACE抑制活性的肽段，對單酶（風味蛋白酶）和雙酶分步酶解進行比較，結果見圖5。

圖5單酶和雙酶分步酶解對鱈魚皮ACE抑制肽水解度和ACE抑制率的影響

Fig.5Effects of single-enzyme and double-enzyme stepwise enzymatic hydrolysison hydrolysis degreeand ACEinhibitoryrate of ACE inhibitory peptides from cod skin

由圖5可知，采用 10mg/mL 統一測試濃度的單一風味蛋白酶酶解時，鱈魚皮膠原蛋白ACE抑制肽的水解度和ACE抑制率分別為 （14.70±0.49）% 和（45. 43± 0.66）% IC₅₀ 值為 3.78mg/mL ；經過工藝優化后雙酶分步酶解，水解度和ACE抑制率均顯著提高，分別為（32.07±0.62）% 和 （65.44±0.53）%，IC₅ 值為 1.46mg/mL 較單酶產物 IC₅₀ 值降低 61.4% ，抑制活性提升2.59倍。

2.4分子量分布結果

小分子量肽段由于結構簡單，更容易與ACE結合，從而能更有效地抑制其活性[17]，因此本試驗研究了分子量分布情況。標準品分子量和酶解產物分子量分布液相色譜圖分別見圖6和圖7。

圖65個多肽標準品的保留時間與分子量的關系 Fig.6Relationship between retention time and molecular weightof fivepolypeptide standard samples

圖7鱈魚皮酶解產物分子量液相色譜圖 Fig.7Molecular weight liquid chromatogram ofcodskin enzymatic hydrolysates

由圖6和圖7可知，不同分子量的多肽組分在酶解產物中的占比如下：小于 1000Da 占總體的 99.5% ，主峰 （MW≈508.67Da） 占色譜峰總面積的 81.57% 。通過液相分析，工藝優化后的多肽主成分分子量集中于500Da 。小分子多肽通常具有較高的ACE抑制活性，這是因為它們更容易與血管緊張素轉換酶（ACE）的活性位點結合，在體內，小分子多肽通常比大分子多肽更容易被吸收和利用，并且小分子多肽在體內環境中的穩定性較高，不易被酶解或降解[24]

2.5 游離氨基酸分析

游離氨基酸是風味的重要貢獻者，游離氨基酸既能作為合成芳香化合物的前體物質，又能通過核苷酸發揮協同作用，增強鱈魚皮ACE抑制肽的整體風味[25]，因此本研究探討了雙酶分步酶解后游離氨基酸的含量，見表11。

表11酶解產物游離氨基酸含量

Table1l Content of free amino acidsin enzymatic hydrolysates

由表11可知，酶解產物凍干粉的游離氨基酸總含量為 71.04mg/100g 。研究發現，谷氨酸是主要的鮮味氨基酸，谷氨酸占游離氨基酸總含量的 2.6% ，為ACE抑制肽提供了鮮味。甘氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、精氨酸5種游離氨基酸能賦予水產品甜味[26]，其占游離氨基酸總含量的 43.1% ，組氨酸、酪氨酸、氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、異亮氨酸6種游離氨基酸為苦味氨基酸，占游離氨基酸總含量的 15.8% ，甜味氨基酸能有效消減苦味帶來的影響并增強鮮味，在酶解產物中甜味氨基酸為主要成分，說明ACE抑制肽有很好的風味。此外，必需氨基酸占游離氨基酸總含量的 20% ，半必需氨基酸占游離氨基酸總含量的 48.8% ，表明鱈魚皮ACE抑制肽的營養價值極高。

2.6 膜分離結果

膜分離是為了研究鱈魚皮ACE抑制肽在不同分子量范圍內的ACE抑制活性，已有研究表明，小分子肽往往具有更高的生物活性和更好的吸收特性[24]。因此，通過超濾分離，不僅可以優化產物的活性，而且能進一步揭示鱈魚皮ACE抑制肽的分子量與活性之間的關系。本研究采用膜分離方法將酶解產物分為4個組分： ）、1 ）、F 和F40 ，并測定各組分濃度為 10mg/mL 時的ACE抑

制率。

圖8膜分離各組分的ACE抑制率

Fig.8ACE inhibitory rates of various components bymembrane separation

圖9 組分生成的HHL的液相色譜圖 Fig.9Liquid chromatograms of HHL produced by lt;1 kDa components

注：A表示未加入抑制劑，B表示加入抑制劑。

由圖8可知，F1、F2、F3、F4的ACE抑制率分別為73.75%.76.62%.80.47%.87.65%，F4∣ 的ACE抑制率較高，其 IC₅₀ 值為 0.86mg/mL 。圖9中A和B為加入抑制活性最高的 lt;1kDa 組分前后生成HHL的峰面積，通過膜分離，小分子多肽的種類和分布更均一，特異性更強，可以減少其他分子的干擾，增加小分子多肽對ACE的特異性抑制，從而增強其抑制活性[27]。Li等[28]利用胃蛋白酶酶解鱈魚皮制備降血壓肽，通過lt;1kDa 膜分離后ACE抑制率最高，為 70% Ngo 等[29]使用 超濾膜從鱈魚皮中提取出ACE抑制活性高的組分，其中 lt;1kDa 組分的ACE抑制率最高，為78.2% 。研究表明膜分離方法對鱈魚皮膠原蛋白酶解產物具有較好的分離效果，能夠有效地分離ACE抑制活性高的組分。

3結論

本研究基于單因素試驗和響應面法建立了鱈魚皮ACE抑制肽雙酶分步酶解工藝，結合膜分離方法構建了鱈魚皮ACE抑制肽制備工藝。單酶酶解產物主要是一些小分子蛋白、多肽、小肽、氨基酸的混合物，且不同組分的生物活性大小不一，雙酶分步酶解利用不同酶的特異性，依次作用于不同類型的肽鍵，產生更豐富的多肽種類，從而提高酶解產物的ACE抑制活性，通過膜分離將ACE抑制活性高的組分從混合物中分離純化出來。建立最優分步酶解工藝：水解蛋白酶（酶解溫度 50°C，pH 9 ！料液比 1：20 ，加酶量 4% 酶解 4.5h ，再加入風味蛋白酶（酶解溫度 40°C，pH 6 ，料液比 1：20 ，加酶量 3% 酶解 ⁴h 后滅酶。在此條件下ACE抑制率最高，為 （65.44±0.53）% 游離氨基酸總含量為 71.04mg/100g ，分子量在 1 000Da 以下的多肽占 99.5% 。經膜分離后，發現 組分的ACE抑制活性最高，較單酶酶解提高了4.25倍。鱈魚皮ACE抑制肽中的游離氨基酸和多肽等呈味物質為降壓食品和調味品的開發提供了理論依據。

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