虎杖苷對(duì)擴(kuò)張型心肌病大鼠心肌損傷的影響

[摘要] 目的 基于音猬因子（sonic hedgehog，Shh）/神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)致癌基因同系物1（glioma-associated oncogene 1，Gli1）信號(hào)通路探討虎杖苷（polydatin，PD）對(duì)阿霉素誘導(dǎo)擴(kuò)張型心肌病（dilated cardiomyopathy，DCM）大鼠心肌損傷的影響。方法 60只SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為Con組、DCM組、PD低劑量組、PD中劑量組、PD高劑量組、Cyclopamine組，每組10只。除Con組外，其余組均通過阿霉素誘導(dǎo)構(gòu)建DCM大鼠模型。檢測(cè)各組大鼠心功能指標(biāo)，觀察大鼠心肌組織病理、纖維化改變及心肌細(xì)胞凋亡。檢測(cè)大鼠血清炎性相關(guān)因子水平與心肌組織Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達(dá)，檢測(cè)各組大鼠心肌組織Shh/Gli1信號(hào)通路蛋白表達(dá)。結(jié)果 與Con組比較，DCM組大鼠心肌組織病理損傷和纖維化嚴(yán)重，心臟左室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic diameter，LVESD）、左室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end diastolic dimension，LVEDD）、心肌細(xì)胞凋亡率、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-18、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原平均吸光度值增加（Plt;0.05）。左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，F(xiàn)S）、Shh、Gli1表達(dá)降低（Plt;0.05）。與DCM組比較，PD低劑量組、PD中劑量組、PD高劑量組大鼠的心肌組織病理損傷和纖維化減輕，LVESD、LVEDD、心肌細(xì)胞凋亡率、IL-1β、IL-18、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原平均吸光度減少，LVEF、FS、Shh、Gli1表達(dá)增加（Plt;0.05）。與PD高劑量組比較，Cyclopamine組大鼠的心肌組織病理損傷和纖維化加重，LVESD、LVEDD、心肌細(xì)胞凋亡率、IL-1β、IL-18、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原平均吸光度顯著增加，LVEF、FS、Shh、Gli1表達(dá)顯著減少（Plt;0.05）。結(jié)論 PD通過激活Shh/Gli1信號(hào)通路能夠改善DCM大鼠心肌損傷。

[關(guān)鍵詞] 虎杖苷；音猬因子/神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)致癌基因同系物1；擴(kuò)張型心肌病；心肌損傷

[中圖分類號(hào)] R542.2" """"[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A """""[DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2025.23.005

Effect of polydatin on myocardial injury in dilated cardiomyopathy rats

CHEN Xubo， YAO Qian

Department of Cardiovascular Medicine， Jinhua Central Hospital， Jinhua 321000， Zhejiang， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of polydatin （PD） on myocardial injury in rats with doxorubicin-induced dilated cardiomyopathy （DCM） based on the sonic hedgehog （Shh）/glioma-associated oncogene 1 （Gli1） signaling pathway. Methods A total of 60 SD rats were divided into six groups using a randomization method： Con group， DCM group， PD low-dose group， PD medium-dose group， PD high-dose group， and Cyclopamine group， each group contained 10 rats. Except for the Con group， all other groups were induced with doxorubicin to establish DCM rat models. The cardiac function parameters of each group were measured， and pathological changes including myocardial tissue fibrosis and cardiomyocyte apoptosis were observed. Serum inflammatory factors， type Ⅰ and type Ⅲ collagen expression in myocardial tissues， as well as Shh/Gli1 signaling pathway protein expression in myocardial tissues of all groups were analyzed. Results Compared with Con group， rats in DCM group exhibited more severe histopathological damage and fibrosis in myocardial tissues. Significant increases were observed in left ventricular end-systolic diameter （LVESD）， left ventricular end-diastolic diameter （LVEDD）， myocardial cell apoptosis rate， as well as the average absorbance values of interleukin （IL）-1β， IL-18， type Ⅰ collagen， and type Ⅲ collagen （Plt;0.05）. Left ventricular ejection fraction （LVEF）， left ventricular fractional shortening （FS）， Shh， and Gli1 expression levels decreased significantly （Plt;0.05）. Compared with the DCM group， histopathological damage and fibrosis reduced in the PD low-dose， medium-dose， and high-dose groups. LVESD， LVEDD， myocardial cell apoptosis rate decreased，and average absorbance values of IL-1β， IL-18， type Ⅰ collagen， and type Ⅲ collagen reduced. LVEF， FS， Shh， and Gli1 expression levels increased significantly （Plt;0.05）. Compared with PD high-dose group， pathological damage and fibrosis of myocardial tissue increased， while LVESD， LVEDD， cardiomyocyte apoptosis rate， IL-1β， IL-18，average absorbance of type Ⅰ collagen and type Ⅲ collagen increased， and expression of LVEF， FS， Shh and Gli1 Decreased in cyclopamine group （Plt;0.05）. Conclusion PD may improve cardiomyopathy in DCM rats by activating Shh/Gli1 signaling pathway.

[Key words] Polydatin; Sonic hedgehog/glioma-associated oncogene homolog 1; Dilated cardiomyopathy; Myocardial injury

擴(kuò)張型心肌病（dilated cardiomyopathy，DCM）是以心室擴(kuò)張和心肌收縮功能障礙為主要特征的器質(zhì)性心臟病，其核心病理改變表現(xiàn)為左心室進(jìn)行性擴(kuò)張，伴隨心肌收縮力持續(xù)下降^[1]。在心臟重構(gòu)過程中，心肌細(xì)胞發(fā)生代償性肥大，間質(zhì)纖維組織增生，最終導(dǎo)致心力衰竭^[2]。盡管當(dāng)前DCM治療取得顯著進(jìn)展，但長(zhǎng)期預(yù)后生存率較低^[3]。為改變DCM生存率低與不良預(yù)后現(xiàn)狀，亟需深入探討DCM分子病理機(jī)制并研發(fā)新型藥物。虎杖苷（polydatin，PD）是一種天然二苯乙烯多酚類化合物，主要存在于虎杖根部、葡萄和花生中^[4-5]。PD表現(xiàn)出多種藥理學(xué)活性，如心血管保護(hù)、抗炎、抗凋亡、抗氧化等。研究表明PD可通過激活核因子E2相關(guān)因子/血紅蛋白加氧酶1信號(hào)通路，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷^[6]。音猬因子（sonic hedgehog，Shh）是Hedgehog信號(hào)通路的核心配體，在調(diào)控胚胎發(fā)育、心臟發(fā)育及組織穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮作用^[7-8]。神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)致癌基因同系物1（glioma-associated oncogene 1，Gli1）作為編碼Hedgehog信號(hào)通路關(guān)鍵調(diào)控因子在細(xì)胞分化、組織發(fā)育等過程中扮演重要角色^[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)激活Shh/Gli1信號(hào)通路可減輕缺氧/再氧合誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡^[11]；但PD能否通過Shh/Gli1信號(hào)通路影響阿霉素誘導(dǎo)DCM大鼠心肌損傷尚未明確。本研究探討PD調(diào)控Shh/Gli1信號(hào)通路，揭示其對(duì)阿霉素誘導(dǎo)DCM大鼠心肌損傷的影響。

1 "材料與方法

1.1 "實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SD雄性大鼠，體質(zhì)量180～200g，購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（浙）2022-0003。所有大鼠均飼養(yǎng)于恒溫恒濕，光照周期12h明暗交替的屏障環(huán)境，提供滅菌標(biāo)準(zhǔn)飼料和純凈水。本研究經(jīng)金華市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：AL-JHYY202535）。

1.2 "試劑與儀器

PD（98%，HPLC）（碧云天生物技術(shù)公司）；阿霉素（美國AMCE公司）；蘇木精-伊紅（hematoxylin- eosin staining，HE）、Masson、終端原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）染色試劑盒（美國Biosharp公司）；免疫組化試劑盒（福州邁新生物技術(shù)公司）；大鼠白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-18、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（美國Sangon Biotech公司）；兔源一抗Ⅰ型膠原、Shh、Gli1、β-actin、山羊抗兔二抗（愛博抗公司）；二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒、Ⅲ型膠原抗體（美國Sigmaaldrich公司）；小動(dòng)物無創(chuàng)超聲血流系統(tǒng)（塔正科技公司）；倒置熒光顯微鏡（明美光電技術(shù)公司）；多功能酶標(biāo)儀（閃譜生物科技）。

1.3 "方法

1.3.1 "DCM大鼠模型構(gòu)建及分組 "參照文獻(xiàn)[12]的方法構(gòu)建DCM大鼠模型。采用阿霉素作為誘導(dǎo)劑，將其溶解于0.9%生理鹽水中，配制成1mg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液。大鼠每周接受腹腔注射阿霉素溶液，劑量為2.5mg/kg，持續(xù)6周，累計(jì)給藥劑量達(dá)15mg/kg。Con組大鼠給予相同劑量0.9%生理鹽水。最后一次給藥結(jié)束后，使用小動(dòng)物無創(chuàng)超聲血流系統(tǒng)對(duì)Con組大鼠和DCM模型大鼠左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）進(jìn)行檢測(cè)，若LVEFlt;30%，提示DCM大鼠模型成功構(gòu)建^[13]。建模成功的大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為DCM組、PD低劑量組、PD中劑量組、PD高劑量組、Cyclopamine組，每組10只。PD低劑量組、PD中劑量組、PD高劑量組大鼠均采取灌胃分別給予10、20、40mg/kg PD，Cyclopamine組大鼠在灌胃給予40 mg/kg PD基礎(chǔ)上，腹腔注射給予10mg/kg Shh/Gli1信號(hào)通路抑制劑Cyclopamine。Con組和DCM組給予等劑量生理鹽水，每天1次，持續(xù)7周。

1.3.2 "大鼠心功能指標(biāo)檢測(cè) "最后一次藥物干預(yù)后，通過乙醚誘導(dǎo)大鼠麻醉并置于手術(shù)臺(tái)，保持仰臥位固定四肢，采用小動(dòng)物無創(chuàng)超聲血流系統(tǒng)進(jìn)行心功能檢測(cè)，觀察各組大鼠心臟左室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic diameter，LVESD）、左室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end diastolic dimension，LVEDD）、LVEF、左室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）的變化。

1.3.3 "大鼠血清IL-1β和IL-18水平檢測(cè) "超聲檢測(cè)結(jié)束，采用脫頸法處死，收集心臟血液，置于4℃離心機(jī)分離血清，酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定。通過數(shù)據(jù)獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終計(jì)算得出各組大鼠血清IL-1β和IL-18水平。剩余血清置于-80℃低溫保存。

1.3.4 "大鼠心肌組織病理、纖維變化 "取部分心肌組織進(jìn)行4%多聚甲醛固定24h并常規(guī)脫水、透明、浸蠟處理。使用組織包埋機(jī)完成包埋。將包埋組織通過切片機(jī)制備成4 μm切片，烘干備用。使用HE、Masson處理組織切片，置于顯微鏡下觀察各組大鼠心肌組織病理、纖維變化。

1.3.5 "大鼠心肌細(xì)胞凋亡變化 "通過TUNEL染色試劑盒處理切片，于顯微鏡下觀察TUNEL陽性細(xì)胞變化，計(jì)算各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率，即凋亡細(xì)胞數(shù)（綠色）/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3.6 "大鼠心肌組織Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達(dá)檢測(cè) "取切片進(jìn)行脫蠟、水化、抗原修復(fù)、H₂O₂封閉，滴加山羊血清，然后滴加一抗Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原（1：100）過夜處理。隨后，滴加二抗，室溫孵育1h，蘇木精復(fù)染，脫水、透明，中性樹膠封片，隨機(jī)選取5個(gè)視野顯微鏡下觀察，根據(jù)區(qū)域熒光強(qiáng)度總和/區(qū)域面積計(jì)算平均吸光度。

1.3.7 "各組大鼠心肌組織Shh/Gli1信號(hào)通路及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) "將剩余心肌組織置于預(yù)冷DNA蛋白裂解液（含1%蛋白酶抑制劑）。使用勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿，離心收集上清液。采用試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。每組取30 μg總蛋白，恒壓下進(jìn)行電泳分離，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，使用5%牛血清白蛋白封閉。4℃過夜孵育一抗Shh、Gli1、β-actin（均為1：2000）。然后，孵育相應(yīng)二抗（1：3000）。滴加化學(xué)發(fā)光液孵育條帶、顯影。使用Image J軟件檢測(cè)灰度值，計(jì)算目的蛋白表達(dá)量即目的蛋白/β-actin灰度值比值。

1.4 "統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（"）表示，多組間比較進(jìn)行單因素方差分析，進(jìn)一步采用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2" 結(jié)果

2.1 "各組大鼠的心功能指標(biāo)變化

與Con組比較，DCM組大鼠LVESD、LVEDD增加，LVEF、FS減少（Plt;0.05）；與DCM組比較，PD低劑量組、PD中劑量組、PD高劑量組大鼠LVESD、LVEDD減少，LVEF、FS增加（Plt;0.05）；與PD高劑量組比較，Cyclopamine組大鼠LVESD、LVEDD增加，LVEF、FS減少（Plt;0.05）。見表1。

2.2 "各組大鼠的血清IL-1β、IL-18表達(dá)水平變化

與Con組比較，DCM組大鼠血清IL-1β、IL-18水平增加（Plt;0.05）；與DCM組比較，PD低劑量組、PD中劑量組、PD高劑量組大鼠血清IL-1β、IL-18水平減少（Plt;0.05）；與PD高劑量組比較，Cyclopamine組大鼠血清IL-1β、IL-18水平增加（Plt;0.05）。見表2。

2.3 "各組大鼠的心肌組織病理、纖維化改變

與Con組比較，DCM組大鼠的心肌組織損傷和纖維化嚴(yán)重，心肌細(xì)胞排列紊亂；與DCM組比較，PD低劑量組、PD中劑量組、PD高劑量組大鼠的心肌組織損傷和纖維化減輕，心肌細(xì)胞排列趨于整齊；與PD高劑量組比較，Cyclopamine組大鼠的心肌組織損傷和纖維化顯著加重，心肌細(xì)胞排列較紊亂。見圖1、圖2。

2.4 "各組大鼠的心肌細(xì)胞凋亡變化

與Con組比較，DCM組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率增加（Plt;0.05）；與DCM組比較，PD低劑量組、PD中劑量組、PD高劑量組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率減少（Plt;0.05）；與PD高劑量組比較，Cyclopamine組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率增加（Plt;0.05）。見圖3。

2.5 "各組大鼠心肌組織膠原表達(dá)變化

與Con組比較，DCM組大鼠心肌組織Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原平均吸光度增加（Plt;0.05）；與DCM組比較，PD低劑量組、PD中劑量組、PD高劑量組大鼠心肌組織Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原平均吸光度減少（Plt;0.05）；與PD高劑量組比較，Cyclopamine組大鼠心肌組織Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原平均吸光度增加（Plt;0.05）。見圖4、圖5、表3。

2.6" 各組大鼠的心肌組織Shh/Gli1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)變化

與Con組比較，DCM組大鼠心肌組織Shh、Gli1表達(dá)水平減少（Plt;0.05）；與DCM組比較，PD低劑量組、PD中劑量組、PD高劑量組大鼠心肌組織Shh、Gli1表達(dá)水平增加（Plt;0.05）；與PD高劑量組比較，Cyclopamine組大鼠心肌組織Shh、Gli1表達(dá)水平減少（Plt;0.05）。見圖6、表4。

3 "討論

DCM是以心室腔異常擴(kuò)張和心肌纖維化為主要特征的原發(fā)性心肌病變，可導(dǎo)致進(jìn)行性心力衰竭、心律失常及猝死風(fēng)險(xiǎn)顯著增加^[14-15]。目前DCM的治療方法主要是調(diào)控血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素受體阻滯劑及血管緊張素受體–腦啡肽酶抑制劑機(jī)制，改善心臟重塑和功能，同時(shí)應(yīng)用β–受體阻滯劑對(duì)減輕心臟負(fù)荷具有重要意義，但仍面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，缺乏針對(duì)DCM病理機(jī)制的特異性藥物，患者呈現(xiàn)進(jìn)行性心功能惡化，5年生存率較低，且晚期患者預(yù)后較差^[16]。因此必須加快新型治療方案的研發(fā)進(jìn)程。本研究采用阿霉素誘導(dǎo)DCM大鼠模型發(fā)現(xiàn)與Con組大鼠比較，LVESD、LVEDD顯著增加，LVEF、FS顯著減少，證明DCM大鼠造模成功。

在DCM發(fā)病過程中，免疫系統(tǒng)失調(diào)導(dǎo)致心肌組織處于炎癥狀態(tài)，進(jìn)而引發(fā)心肌細(xì)胞損傷和凋亡。持續(xù)炎癥微環(huán)境不僅損害心肌細(xì)胞，甚至可導(dǎo)致心肌纖維化和心臟重塑^[17]。李偉等^[14]研究表明PD抑制Hippo/Yes相關(guān)蛋白通路，減少心肌組織炎性細(xì)胞浸潤和膠原纖維沉積，改善冠心病大鼠心肌損傷。王天光等^[18]研究顯示PD抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β/Smad/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶通路，減少促炎細(xì)胞因子IL-6、TNF-α表達(dá)水平，改善急性心肌梗死心肌纖維化程度，促進(jìn)心肌損傷修復(fù)。以上研究結(jié)果表明PD具有改善心肌組織炎癥和纖維化療效。本研究DCM組大鼠心肌組織病理損傷和纖維化嚴(yán)重，心肌細(xì)胞凋亡率、促炎因子、心肌纖維化標(biāo)志物平均吸光度增加。然而，DCM大鼠經(jīng)不同劑量PD處理后，心功能指標(biāo)LVESD、LVEDD降低，LVEF、FS升高，改善心功能，與王天光等^[18]研究結(jié)果一致。大鼠心肌組織促炎因子和心肌纖維化標(biāo)志物表達(dá)降低，心肌細(xì)胞凋亡減少，提示PD可改善DCM大鼠炎癥反應(yīng)和心肌組織纖維化。

Shh為分泌型信號(hào)分子，可與跨膜受體Patched特異性結(jié)合，激活下游因子Gli1，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、治療抵抗性及血管生成^[19]。最新研究發(fā)現(xiàn)Shh/Gli1信號(hào)通路在心肌損傷病理機(jī)制中具有關(guān)鍵調(diào)控作用。王琮翰等^[20]研究顯示激活Shh/Gli1信號(hào)通路，改善心功能指標(biāo)、心肌梗死面積，進(jìn)而減輕急性心肌梗死大鼠心肌損傷。上述研究結(jié)果證明Shh/Gli1信號(hào)通路激活對(duì)心肌細(xì)胞損傷具有顯著改善作用。本研究DCM大鼠心肌組織中Shh、Gli1表達(dá)降低；不同劑量PD處理DCM大鼠，Shh、Gli1表達(dá)增加。但使用Shh/Gli1信號(hào)通路抑制劑Cyclopamine可削弱PD對(duì)阿霉素誘導(dǎo)大鼠心肌保護(hù)作用，提示PD可能通過激活Shh/Gli1信號(hào)通路，在DCM病理進(jìn)程中發(fā)揮心臟保護(hù)功能。

綜上，PD對(duì)DCM大鼠心功能、心肌損傷及纖維化表現(xiàn)出顯著改善作用，可能與激活Shh/Gli1信號(hào)通路密切相關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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