缺氧膽管癌細胞外泌體對增殖、遷移、侵襲及JAK2/STAT3通路的影響

[摘要] 目的 探究缺氧條件下膽管癌（cholangiocarcinoma，CCA）細胞分泌的外泌體（exosome，Exo）對CCA細胞的增殖、遷移、侵襲及Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信號轉導和轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）通路的影響。方法 提取CCA細胞分泌的Exo并鑒定。將常氧、缺氧條件下的Exo與CCA細胞共培養，分為常氧組、缺氧組、缺氧+抑制劑組，另設空白組，檢測CCA細胞的增殖、遷移、侵襲能力和相關蛋白表達。結果 在CCA細胞質中檢測到Exo攜帶熒光染料3，3'-雙十八烷基氧雜碳菁高氯酸鹽。與空白組比較，常氧組的克隆形成數、細胞遷移數、侵襲細胞數量上升，增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、基質金屬蛋白酶（matrix metallopeptidase，MMP）-2、MMP-9、神經鈣黏蛋白（neural cadherin，N-Cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、兔抗磷酸化JAK2（phosphorylated JAK2，p-JAK2）/JAK2、兔抗磷酸化STAT3（phosphorylated STAT3，p-STAT3）/STAT3表達升高，上皮細胞鈣黏蛋白（epithelial cadherin，E-Cadherin）表達降低（Plt;0.05）；與常氧組比較，缺氧組的克隆形成數、細胞遷移數、侵襲細胞數量上升，PCNA、MMP-2、MMP-9、N-Cadherin、Vimentin、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表達升高，E-Cadherin表達降低（Plt;0.05）；與缺氧組比較，缺氧+抑制劑組的克隆形成數、細胞遷移數、侵襲細胞數量下降，PCNA、MMP-2、MMP-9、N-Cadherin、Vimentin、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表達降低，E-Cadherin表達升高（Plt;0.05）。結論 缺氧條件下CCA細胞分泌的Exo通過激活JAK2/STAT3通路促進CCA細胞的增殖、遷移、侵襲及上皮間質轉化。

[關鍵詞] 缺氧；膽管癌；外泌體；增殖；遷移；侵襲；Janus激酶2/信號轉導和轉錄激活因子3通路

[中圖分類號] R735.8" """"[文獻標識碼] A """""[DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2025.24.007

The effects of hypoxic cholangiocarcinoma cell-derived exosome on the proliferation， migration， invasion， and JAK2/STAT3 signaling pathway

ZHANG Jianhua， SU Zijian， LIAN Jinhong

Department of Hepatobiliary Surgery， Quanzhou First Hospital， Quanzhou 362000， Fujian， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of exosome （Exo） secreted by cholangiocarcinoma （CCA） cells under hypoxic conditions on the proliferation， migration， invasion， and Janus kinase 2 （JAK2）/signal transducer and activator of transcription 3 （STAT3） pathway of CCA cells. Methods Exo secreted by CCA cells was extracted and identified. Exo under normoxic and hypoxic conditions were co-cultured with CCA cells and divided into normal oxygen group， hypoxic group， hypoxic+inhibitor group， and blank group. The proliferation， migration， and invasion abilities of CCA cells were tested separately. Immunoblotting was applied to detect the expression levels of relevant proteins. Results Exo carrying fluorescent dye 3， 3'- dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate was detected in CCA cytoplasm. Compared with blank group， the number of clone formation， cell migration and invasion cells in normoxic group increased， the expression of proliferating cell nuclear antigen （PCNA）， matrix metallopeptidase （MMP）-2， MMP-9， neural cadherin （N-Cadherin）， Vimentin， phosphorylated JAK2 （p-JAK2）/JAK2， phosphorylated STAT3 （p-STAT3）/STAT3 increased， and the expression of epithelial cadherin （E-Cadherin） decreased （Plt;0.05）; Compared with normal oxygen group， the number of clone formation， cell migration and invasion cells in hypoxia group increased， the expression of PCNA， MMP-2， MMP-9， N-Cadherin， Vimentin， p-JAK2/JAK2 and p-STAT3/STAT3 increased， and the expression of E-Cadherin decreased （Plt;0.05）. Compared with hypoxia group， the number of clone formation， cell migration and invasion cells in hypoxia+inhibitor group decreased， the expression of PCNA， MMP-2， MMP-9， N-Cadherin， Vimentin， p-JAK2/JAK2 and p-STAT3/STAT3 decreased， and the expression of E-Cadherin increased （Plt;0.05）. Conclusion Exo secreted by CCA cells under hypoxic conditions promote proliferation， migration， invasion， and epithelial mesenchymal transition of CCA cell by activating the JAK2/STAT3 pathway.

[Key words] Hypoxia; Cholangiocarcinoma; Exosome; Proliferation; Migration; Invasion; Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3 pathway

膽管癌（cholangiocarcinoma，CCA）是一種起源于膽管上皮細胞的惡性腫瘤，具有高侵襲性和隱匿性，多數患者發展至晚期才被確診，預后較差^[1]。因此深入探索CCA發生進展的分子機制對患者的治療十分重要^[2]。缺氧是實體瘤特征之一，可能通過外泌體（exosome，Exo）加速腫瘤發生^[3]。Exo是具有磷脂雙層結構的納米級囊泡，參與各種生理和病理過程^[4]。但缺氧條件下CCA細胞分泌的Exo對CCA細胞增殖、遷移、侵襲的影響尚未可知。Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信號轉導和轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）通路為炎癥相關疾病的治療靶點，主要通過受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）、JAK2和STAT3介導信號級聯反應。激活的JAK2刺激RTK產生STAT3的結合位點。STAT3通過其SH2結構域與RTK結合，并在JAK2作用下磷酸化進入細胞核，誘導下游信號轉導，發揮重要作用^[5]。據報道，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）類賴氨酰氧化酶1反義RNA1（lysyl oxidase-like 1 antisense RNA1，LOXL1-AS1）通過調節JAK2/STAT3信號通路影響CCA進展^[6]。本課題組基于前期研究進展，在缺氧條件下通過分離鑒定CCA細胞分泌的Exo，探究Exo對CCA細胞增殖、遷移、侵襲及JAK2/STAT3通路的影響。

1" 材料與方法

1.1" 材料

人CCA細胞RBE（ZQ0247）購自上海雅吉生物科技有限公司；兔抗CD9（BK-KT11838）、TSG101（BK-KT8280）、Syntenin（BK-KT12884）、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）（BK-KT10757）、基質金屬蛋白酶（matrix metallopeptidase，MMP）-2（BK-KT6764）、MMP-9（BK-KT7901）、神經鈣黏蛋白（neural cadherin，N-Cadherin）（BK-KT9801）、波形蛋白（Vimentin）（BK-KT12012）、上皮細胞鈣黏蛋白（epithelial cadherin，E-Cadherin）（BK-KT7131）、JAK2（BK-KT10379）、STAT3（BK-KT10994）抗體購自上海帛科生物技術有限公司。兔抗磷酸化JAK2（phosphorylated JAK2，p-JAK2）（PHA97301）抗體購自普健生物（武漢）科技有限公司；兔抗磷酸化STAT3（phosphorylated STAT3，p-STAT3）（IC184614）抗體購自上海鈺博生物科技有限公司；兔抗CD81（BGT-ANT-35744）購自武漢佰瑞得生物技術有限公司。兔抗Galnexin（GTX127352）抗體購自深圳欣博盛生物科技有限公司。JAK2抑制劑AG490購自（abx282079）艾美捷科技有限公司。Exo綠色熒光染色試劑盒3，3′-雙十八烷基氧雜碳菁高氯酸鹽（3，3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate，DIO）（MH1061-1盒）購自江蘇麥格生物科技有限公司。本研究經泉州市第一醫院倫理委員會審批通過（倫理審批號：泉一倫[2021]275號）。

1.2" 方法

1.2.1nbsp; 缺氧處理 "人膽管癌RBE細胞在DMEM培養基中培養，常氧條件：37℃、5% CO₂、20% O₂；缺氧條件：37℃、1% O₂，培養48h^[7]。

1.2.2" Exo的分離、鑒定 "將CCA細胞培養液以3400轉/min、4℃離心15min，分離上清液，以7200轉/min、4℃離心30min，去除細胞碎片，然后以30 000轉/min、4℃超速離心90min。取上清液，濾膜過濾，收集過濾液，以7200轉/min、4℃離心70min，去上清液，用預冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）重懸后，選擇超速轉子，再次以4℃、30 000轉/min，超速離心70min，去上清液，用預冷的PBS重懸，Exo于–80℃保存。

1.2.3 "透射電鏡觀察Exo "取Exo滴加在銅網上沉淀1min，濾紙吸去浮液，醋酸雙氧鈾10μl滴加于銅網上沉淀1min，濾紙吸去浮液，常溫干燥，電鏡觀察。

1.2.4 "分析Exo粒徑 "取Exo進行稀釋，粒徑分析檢測Exo粒徑分布。

1.2.5 "檢測Exo標志蛋白表達 "將Exo加入裂解液，混勻，用聚氰基丙烯酸正丁酯試劑盒檢測蛋白濃度。配置十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，取蛋白樣品，加熱變性，上樣，轉移至聚偏二氟乙烯膜上，于5%脫脂牛奶含有Tris-HCl緩沖鹽和Tween的溶液（solution containing Tris-HCl buffer salt and Tween，TBST）中，封閉1h，加一抗稀釋液（1 ： 1000）4℃過夜孵育，TBST洗膜，加二抗稀釋液（1 ： 5000）室溫孵育1h，TBST洗膜，與增強化學發光避光反應5min，曝光，分析各蛋白條帶表達量。

1.2.6" Exo攝取實驗" Exo樣本與DIO染料混合，室溫孵育30min，分離柱吸取上層保護液，PBS清洗，將樣本加分離柱上層，離心，避光加PBS，離心，取24孔板，用多聚賴氨酸包被細胞爬片，加CCA細胞和熒光標記的Exo樣本，加等量的PBS作為空白組，室溫孵育過夜，用鼠抗人α-Tubulin抗體（1 ： 200）染色細胞骨架，過夜孵育，清洗，用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚染色，封片，在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.7" 實驗分組 "將RBE細胞制備為單細胞懸液，轉移至96孔板，每孔加3000個細胞，分別加入PBS、常氧、缺氧條件下提取的Exo，分為空白組、常氧組、缺氧組和缺氧+抑制劑組，每組設置6個重復，缺氧+抑制劑組使用50μmol/L JAK2抑制劑AG490和缺氧Exo處理RBE細胞24h^[8]。

1.2.8" 克隆形成實驗檢測CCA細胞增殖活性 "將各組RBE細胞接種至6孔培養板中，培養14d，多聚甲醛固定15min，結晶紫染色30min。鏡下觀察，統計細胞克隆形成數。

1.2.9 "檢測CCA細胞遷移能力" 將各組RBE細胞接種在加入不含基質膠的小室上室，下室加血清培養基，培養12h，甲醛固定，結晶紫染色，顯微鏡觀察，計數細胞遷移數目。

1.2.10" Transwell實驗檢測CCA細胞侵襲能力 "將RBE細胞接種于Transwell小室上室，下室鋪滿FBS培養基，培養24h，室溫下用多聚甲醛固定15min，隨后結晶紫染色30min。顯微鏡下觀察，統計侵襲數目。

1.2.11 "檢測蛋白表達 "參考1.2.5中實驗步驟，檢測各組PCNA、MMP-2、MMP-9、N-Cadherin、Vimentin、E-Cadherin、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表達。

1.3" 統計學方法

采用SPSS 25.0統計學軟件對數據進行處理分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（" ）表示，多組間比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2" 結果

2.1" RBE細胞分泌的Exo鑒定

CCA細胞RBE經無Exo培養基分別在常氧和缺氧條件下培養48h，分離、提取其中的Exo。透射電鏡觀察發現Exo為雙層膜結構，呈“茶托”樣，粒徑約90nm，與Exo結構一致。常氧和缺氧條件下，RBE細胞Exo中均含有Exo標記蛋白CD81、CD9、TSG101，但不表達Galnexin，證明本研究已有效分離Exo，結果見表1、圖1至圖3。

2.2" 熒光顯微鏡觀察RBE細胞能否攝取Exo

Exo用DIO標記并與RBE細胞共培養后，在RBE細胞質中檢測到Exo攜帶熒光染料DIO，說明RBE細胞對Exo進行攝取，并儲存于細胞質中，見圖4。

A.PBS為空白對照；B.紅色熒光染色為細胞骨架；C.A與B合并圖像；D.DIO綠色熒光染色為Exo；E.紅色熒光染色為細胞骨架；F.D與E合并圖像

2.3" 缺氧Exo對RBE細胞增殖、遷移、侵襲的影響

與空白組比較，常氧組的克隆形成數、細胞遷移數、侵襲細胞數量均上升（Plt;0.05）；與常氧組比較，缺氧組的克隆形成數、細胞遷移數、侵襲細胞數量升高（Plt;0.05）；與缺氧組比較，缺氧+抑制劑組的克隆形成數、細胞遷移數、侵襲細胞數量減少（Plt;0.05），見表2、圖5至圖7。

2.4" 缺氧Exo對RBE細胞增殖、遷移、侵襲蛋白的影響

與空白組比較，常氧組的PCNA、MMP-2、MMP-9表達升高（Plt;0.05）；與常氧組比較，缺氧組的PCNA、MMP-2、MMP-9表達升高（Plt;0.05）；與缺氧組比較，缺氧+抑制劑組的PCNA、MMP-2、MMP-9表達下降（Plt;0.05），見圖8和表3。

2.5" 缺氧Exo對RBE細胞N-Cadherin、Vimentin、E-Cadherin的影響

與空白組比較，常氧組的N-Cadherin、Vimentin表達升高，E-Cadherin表達降低（Plt;0.05）；與常氧組比較，缺氧組的N-Cadherin、Vimentin表達升高，E-Cadherin表達降低（Plt;0.05）；與缺氧組比較，缺氧+抑制劑組的N-Cadherin、Vimentin表達下降，E-Cadherin表達上升（Plt;0.05），見圖9和表4。

2.6" 缺氧Exo對JAK2/STAT3通路的影響

與空白組比較，常氧組的p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表達升高（Plt;0.05）；與常氧組比較，缺氧組的p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表達升高（Plt;0.05）；與缺氧組比較，缺氧+抑制劑組的p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表達下降（Plt;0.05），見圖10和表5。

3" 討論

CCA占所有胃腸道惡性腫瘤的3%，預后極差，全球發病率呈上升趨勢，其病因和發病機制目前尚不完全清楚。手術切除是治愈CCA的唯一方法，但術后復發率和轉移率較高^[9]。目前多數靶向藥物的效果并不理想^[10]。因此，迫切需要確定新的生物標志物或靶向療法改善CCA患者的臨床結局。

Exo包含蛋白質、信使RNA和微小RNA，廣泛分布于不同體液中，在各種生物行為中起重要作用^[11]。據報道，Exo在腫瘤微環境中以多種方式參與腫瘤的發生或轉移^[12]。Exo本身攜帶CD9、CD63、CD81、CD83、Alix、Tsg101等標志物，可調節受體細胞內的信號轉導、基因轉錄翻譯、關鍵酶促反應過程^[7]。本研究從缺氧條件下分離CCA分泌的Exo，檢測Exo標志蛋白CD9、CD81、Tsg101，發現CCA細胞具有攝取Exo的能力。腫瘤相關M2巨噬細胞分泌的Exo中Circ_0020256可促進CCA細胞的增殖、遷移和侵襲^[13]。缺氧對癌癥進展有不同的影響，不僅促進腫瘤細胞的侵襲、遷移，還驅動癌細胞產生更多細胞因子、非編碼RNA和Exo，參與各種生理生化過程^[14-15]。腫瘤中的缺氧區域可作為惡性細胞的孵化器，惡性細胞適應缺氧微環境，調節上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、增殖、遷移、轉移等過程^[16]。本研究中，缺氧條件下CCA分泌的Exo可增加CCA細胞的克隆形成數、細胞遷移數、侵襲細胞數量，促進PCNA、MMP-2、MMP-9、N-Cadherin、Vimentin表達，抑制E-Cadherin表達，說明缺氧條件下的Exo可促進CCA細胞的增殖、遷移、侵襲與EMT。

JAK2/STAT3是關鍵的炎癥信號通路，與腫瘤多個生物學行為密切相關，其異常表達對腫瘤預后有重要意義^[17]。由于JAK2在細胞中的作用，其已成為癌癥治療的重要靶點。STAT3可被許多細胞因子和生長因子激活，參與致癌和胞內信號轉導^[18]。研究顯示抑制JAK2/STAT3信號轉導可促進CCA細胞凋亡^[19]；細粒棘球蚴囊液及其Exo可促進肝癌細胞Hepa1-6增殖，抑制其凋亡，可能通過JAK2/STAT3通路實現的。本研究中，缺氧條件下從CCA細胞中提取的Exo與CCA細胞共培養可促進p-JAK2/ JAK2、p-STAT3/STAT3表達；回復實驗中，JAK2抑制劑可逆轉結果，說明Exo可激活JAK2/STAT3信號通路促進CCA細胞惡性行為。

綜上，在缺氧條件下，CCA細胞Exo可促進CCA細胞的增殖、遷移、侵襲與EMT，可能通過激活JAK2/STAT3通路實現。然而，Exo的哪種遺傳物質發揮作用尚不清楚，需進一步研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2025–02–09）

（修回日期：2025–08–01）

基金項目：福建醫科大學啟航項目（2020QH1270）

通信作者：張劍華，電子信箱：710262737@qq.com