菊花BBX基因家族鑒定及UV-A處理下表達模式分析

中圖分類號： _8682.1+1 ；Q943 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-060X（2025）08-0080-11

Identification of the BBX Gene Family in Chrysanthemum and Analysis of the Expression Patterns Under UV-A Treatment

LONG Zhen-tao1，XIANGLi-li2，ZHUFan1

（1.ColegeofpedAiulUsits;.lf HunanAgriculturalUniversity，Changsha4lO128，C）

Abstract：TheBBX（B-box）familyisagroupofincfingerproteintranscriptionfactors thatplaycrucialroles inplantightsignal transduction，photoperiodregulation，andsecondary metabolismregulation.The membersof theBBXgenefamily（CmBBXsin chrysanthemum（ChrysanthemummorifoliumRamat.）weresystematicallyidentifedfromthechrysanthemumgenomedatabase Mum GARDEN，followedbybioiformaticsaalysisandfunctionprediction.Atotalof35CmBBXswereidentifed.Theplogenetic analysisindicatedthatCmBBXscouldbeclasified intofivesub-families，which showeddifferencesintheconserveddomains. Predictioofcis-actingelementsinpromoterreginssowedthatthere werealargenumberoflight-resposiveelements inCmBBXs， andsome membershadMYB-bindingsites.UnderUV-Atreatment，theexpressionpatesoffourCmBBXs weresiilartothatofthe previouslyreported chrysanthemum anthocyaninregulatory geneCmMYB6.It is hypothesized that these CmBBXs maybe involvedin thelight-regulated anthocyaninmetabolism.

Key words： chrysanthemum; BBX gene family; identification; anthocyanin; expression

轉(zhuǎn)錄因子是一類具有特殊結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子，其能夠與下游基因啟動子中的順式作用元件或其他蛋白結(jié)合，進而調(diào)控下游基因的表達[1]。植物轉(zhuǎn)錄因子根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點可分為多個轉(zhuǎn)錄因子家族，比如MYB、NAC、WRKY、AP2/ERF等家族，這些轉(zhuǎn)錄因子家族在植物的生長發(fā)育過程中扮演著重要角色[2]。光是植物生長發(fā)育過程中不可或缺的環(huán)境因子之一，其不僅為植物的生長提供能量，也能作為信號影響植物生長發(fā)育。光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是一個復(fù)雜的過程，在這個過程中有許多轉(zhuǎn)錄因子家族發(fā)揮著重大作用，比如COP1、PIFs、HY5、HYH等，其中COP1-HY5是光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的中心調(diào)控模塊[3-4]。此外還存在許多其他轉(zhuǎn)錄因子家族成員能夠與上述轉(zhuǎn)錄因子互作，在光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用，進而影響光形態(tài)建成[5]。

BBX蛋白（B-box zinc finger proteins）是鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子（Zinc finger protein transcription factor）的一個亞族，因其氨基酸序列N端存在1個或2個B-box結(jié)構(gòu)域而得名。最早從擬南芥（Arabidopsisthaliana）中鑒定出32個BBX轉(zhuǎn)錄因子蛋白，并根據(jù)其序列中B-box結(jié)構(gòu)域的數(shù)量與是否含有CCT結(jié)構(gòu)域分為5個亞族[。研究發(fā)現(xiàn)BBX蛋白在植物進化中較為保守，在水稻（Oryzasativa）、矮牽牛（Petunia × hybrida）大豆（Glycinemax）與玉米（Zeamays）等植物中都鑒定出該轉(zhuǎn)錄因子家族[7-10]。許多研究發(fā)現(xiàn)BBX蛋白可能在光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與光形態(tài)建成中發(fā)揮關(guān)鍵作用[。比如在擬南芥中AtBBX28能夠直接與AtHY5互作進而抑制AtHY5的活性，在光照條件下AtBBX21能夠積累并激活A(yù)tHY5的轉(zhuǎn)錄，促進光形態(tài)建成，AtBBX23也能夠與AtHY5結(jié)合，共同調(diào)控下游靶基因[。非脅迫下植物花青苷的合成需要光誘導(dǎo)，光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)成化學(xué)信號來促使花青苷積累，而BBX是光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要組成部分，這意味著BBX很有可能參與花青苷的代謝[3]。擬南芥中研究發(fā)現(xiàn)AtBBX21、AtBBX23和AtBBX24通過AtHY5來調(diào)控花青昔的合成，在蘋果中的研究也發(fā)現(xiàn)MdBBX20、MdBBX22在花青苷合成中起正調(diào)控作用[-12]，這說明BBX在花青苷代謝中有很大的研究潛力。

菊花（ChrysanthemummorifoliumRamat.）是菊科菊屬的多年生宿根草本或亞灌木花卉，其觀賞性強，經(jīng)濟價值高，種植面積廣，在花卉產(chǎn)業(yè)中占有重要地位[13]。菊花是典型的短日照植物，對光照十分敏感，光照直接影響菊花的生長發(fā)育、花期與花色形成[4]。目前研究發(fā)現(xiàn)CmBBXs有調(diào)控菊花花期以及抗逆方面的功能，比如CmBBX24負向調(diào)控菊花開花[15]，CmBBX8正向調(diào)控夏菊開花[16-17]，CmBBX19負向調(diào)控菊花的耐旱性[18]，CmBBX22在擬南芥中正向調(diào)控植物耐旱性[19]，但在菊花中負向調(diào)控耐旱性[20]。總的來說，目前對于CmBBXs的研究主要是某一成員的功能挖掘，對于整個基因家族的鑒定與研究較少，同時對于CmBBXs是否參與光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及花青昔代謝研究較少，而調(diào)控花青昔代謝是改變菊花花色的重要手段。因此本研究通過生物信息學(xué)方法鑒定出35個CmBBXs成員，對其蛋白序列特征、系統(tǒng)進化等進行了分析與預(yù)測，對其中部分成員的功能進行科學(xué)性預(yù)測，并且分析了CmBBXs在UV-A處理下的表達模式，初步篩選了一些可能參與花青苷代謝的CmBBXs，為將來進一步研究CmBBXs成員在花青昔代謝與花色調(diào)控中的功能提供參考。

1材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所獲取的CmBBXs基因與蛋白序列來自于菊花基因組數(shù)據(jù)庫MumGARDEN[21]，供試菊花材料‘科隆香水’購于湖南省長沙市紅星花卉市場茂源花卉貿(mào)易有限公司，主要試劑有鹽酸溶液、甲醇溶液（均為分析純）、植物DNA提取試劑盒（艾科瑞生物公司）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒與ChamQUniversalSYBRqPCRMasterMix（諾唯贊生物公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1菊花CmBBXs家族成員的鑒定為了準(zhǔn)確獲取菊花CmBBXs轉(zhuǎn)錄因子家族成員，本研究在菊花基因組數(shù)據(jù)庫MumGARDEN（http：//mum-garden.kazusa.or.jp/）以“B-box”為關(guān)鍵詞進行檢索，檢索出43個菊花CmBBXs候選成員。利用在線工具NCBICD-Search、InterPro、SMART驗證其是否具有“B-box”結(jié)構(gòu)域，手動剔除不含或者缺失“B-box'結(jié)構(gòu)域的候選成員。

1.2.2菊花CmBBXs氨基酸序列特征分析利用ExPASy（https：//web.expasy.org/cgibin/protparam/protparam）在線分析軟件對CmBBXs蛋白的氨基酸數(shù)量、不穩(wěn)定系數(shù)、相對分子量等理化性質(zhì)進行預(yù)測分析。使用WoLFPSOR（Thttps：//wolfpsort.hgcjp/）對CmBBXs進行亞細胞定位預(yù)測。運用NCBI的CD-Search工具對CmBBXs家族的保守結(jié)構(gòu)域進行分析，并使用TBtools軟件進行可視化作圖。利用在線工具MEME（https：//meme-suite.org/meme/doc/meme.html）對CmBBXs進行Motif分析。

1.2.3菊花CmBBXs進化分析從擬南芥數(shù)據(jù)庫（https：//www.arabidopsis.org/）中下載已鑒定出的32條擬南芥AtBBXs序列，利用MEGAX中的ClustalW對鑒定出的CmBBXs家族的蛋白序列和擬南芥AtBBXs蛋白序列進行了多序列比對，使用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，利用在線工具Itol（https：//itol.embl.de/）對進化樹進行美化。

1.2.4菊花CmBBXs基因啟動子順式作用元件分析根據(jù)鑒定的CmBBXs序列，從MumGARDEN數(shù)據(jù)庫提取CmBBXs起始密碼子ATG上游 2000bp 序列，利用PlantCARE 數(shù)據(jù)庫（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/pla-ntcare/html）對啟動子上游序列中所含的順式作用元件進行預(yù)測，并利用TBtools軟件進行可視化。

1.2.5UV-A處理與花青苷含量測定通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)紫外光能夠促進花青昔的合成，為了研究紫外光對菊花花瓣花青苷合成的影響，購買切花菊‘科隆香水’，先避光水養(yǎng) 24h ，隨后選取生長狀況相同的菊花，將枝條統(tǒng)一修剪至 10cm 瓶插水養(yǎng)，置于溫室中進行紫外光（UV-A， 320～400nm ）處理，光強度控制在約 200μmol/μmol/μmol/μmol/μmol/μmol/μmol/μmol/nμmol/n， （ m²?s ），光周期為 14L/10 D（光照/黑暗），室內(nèi)溫度為 20% 。

在光照處理0、2、8、14d時進行取樣，取頂端花瓣，液氮保存。花青昔相對含量測定參考他人方法，取菊花花瓣鮮樣 0.1g ，使用液氮研磨，加入1mL1% （V/V）鹽酸甲醇溶液，黑暗浸提 24h ，離心后取上清液，測定 525nm 處吸光度， OD₅₂₅ 反映花青苷相對含量（ OD₅₂₅/100mgFW ）[22]。

1.2.6UV-A處理下菊花CmBBXs表達模式分析為了研究CmBBXs在UV-A下的表達模式，取菊花在UV-Ag下處理0、6、24、 ^48h 的花瓣鮮樣，液氮速凍保存，每個處理3組生物學(xué)重復(fù)，隨后于 -80^°C 下保存，使用AGSteadyPure植物RNA提取試劑盒進行RNA提取，通過微量紫外分光光度計檢測RNA樣品的濃度與純度，并且通過 1% 瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA的完整性。使用Vazyme反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA樣品反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用PrimerPremier5軟件設(shè)計CmBBXs基因家族q-pcr引物并驗證，按 照 ChamQUniversal SYBR qPCR MasterMix試劑盒說明書推薦體系加人反應(yīng)液，在Bio-Rad熒光定量儀上按如下程序進行PCR反應(yīng)： 95^°C 預(yù)變性 30s ， 95^°C 變性 15s ， 60^°C 退火延伸 30s ，40個循環(huán)，3次技術(shù)重復(fù)，基因相對表達量采用2?△CT公式進行計算，使用Tbtools軟件繪制基因表達熱圖，繪圖設(shè)置為LogScale、RowScale，聚類設(shè)置為Cluster Rows。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊花CmBBXs家族成員的鑒定與命名

利用菊花（chrysanthemumseticuspe）基因組數(shù)據(jù)庫，檢索關(guān)鍵詞“B-box”，共獲得43個注釋為BBX的轉(zhuǎn)錄本，通過保守結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)其中8個蛋白序列不包含B-box結(jié)構(gòu)域，將其剔除，最終鑒定到35個菊花CmBBXs家族成員（圖1）。

為對CmBBXs進行系統(tǒng)命名，將35條CmBBXs蛋白序列提交至NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表1），其中12個成員已被命名（QueryCover為 100% ），其余23個成員的命名則參考與擬南芥AtBBXs的親緣關(guān)系，當(dāng)多個CmBBXs與同一AtBBX成員具有最高相似度時，按數(shù)字編號區(qū)分，如 與Cse_sc036011.1_g020.1皆與AtBBX2親緣最近，分別命名為CmBBX2與CmBBX2.1，以此類推。

在13個已命名的CmBBXs蛋白中，有6個成員的功能已進行研究，其中CmBBX24通過赤霉素（GA）途徑影響菊花的開花時間、耐寒性和耐旱性[5]，CmBBX20促進菊花類黃酮和綠原酸（CGA）的合成[23]，CmBBX22負向調(diào)控菊花耐旱性[20]，CmBBX7與CmBBX8可協(xié)同調(diào)控夏菊開花時間[16-17.24]，CmBBX13 在擬南芥中異源表達可延遲擬南芥開花[25]。這些研究表明，CmBBXs家族成員在花期調(diào)控、非生物脅迫應(yīng)答及次生代謝產(chǎn)物合成方面具有重要作用。

表1CmBBXs家族成員信息

2.2 菊花CmBBXs蛋白序列特征分析

利用在線程序ProtParam對CmBBXs進行蛋白理化性質(zhì)分析（表2），結(jié)果顯示CmBBXs家族編碼蛋白的長度為范圍為127～537個氨基酸，大部分成員長度介于200～400個氨基酸之間，蛋白相對分子質(zhì)量大小在 14376.25～60607.07 之間，CmBBXs理論等電點pI則介于4.11～9.04之間，其中28個成員屬于酸性蛋白，說明CmBBXs含有較多酸性氨基酸，不穩(wěn)定系數(shù)的變化范圍為 ，其中大部分屬于不穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)介于 50.30～86.89 之間，親水性平均值在-0.897至-0.117范圍內(nèi)變化，表明所有成員均為親水蛋白，亞細胞定位預(yù)測發(fā)現(xiàn)，22個CmBBXs蛋白主要定位于細胞核，9個CmBBXs定位于葉綠體上，但也有少數(shù)成員定位于其他亞細胞結(jié)構(gòu)，有3個成員定位于細胞質(zhì)、1個成員定位于細胞骨架。以上結(jié)果表明，CmBBXs成員大部分定位于細胞核中，但不同成員的理化性質(zhì)各有不同，這預(yù)示著該家族中大部分成員可能作為轉(zhuǎn)錄因子在菊花的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著不同的調(diào)控功能

使用CD-Search對35個CmBBXs的氨基酸序列進行保守結(jié)構(gòu)域分析（圖2），發(fā)現(xiàn)有29個成員含有Bbox1_BBX-like結(jié)構(gòu)，7個成員含有Bbox_SFsuperfamily結(jié)構(gòu)，1個成員含有BBOX結(jié)構(gòu)，1個成員含有Bbox2結(jié)構(gòu)，14個成員含有CCT結(jié)構(gòu)，這些不同保守結(jié)構(gòu)域的存在表明CmBBXs可能在DNA結(jié)合或蛋白－蛋白相互作用方面具有不同的特性。

同時利用在線工具MEME對CmBBXs的保守基序進行了預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CmBBXs主要存在5種Motif，其中Motif1、Motif3、Motif4、Motif5主要構(gòu)成各種B-box結(jié)構(gòu)域，Motif2主要構(gòu)成CCT結(jié)構(gòu)域。35個CmBBXs存在不同的保守結(jié)構(gòu)域與Motif數(shù)量，這說明成員可能發(fā)揮的功能不同。

2.3 菊花CmBBXs的系統(tǒng)進化樹

為了解CmBBXs家族與擬南芥AtBBXs家族之間的聚類關(guān)系，對35個菊CmBBXs和32個AtBBXs的蛋白序列進行多重序列比對（ClustaIW），并用MEGAX構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖3）。根據(jù)聚類關(guān)系，可以將CmBBXs劃分為5個亞族，其中I亞族有5個成員，Ⅱ亞族有7個成員，Ⅲ亞族有3個成員，V亞族有13個成員，V亞族有6個成員。此外，CmBBX33未歸屬于上述5個亞族，而是形成一個獨立分支。

已有研究表明，AtBBXs家族不同亞族成員在光信號調(diào)控、開花時間調(diào)控和次生代謝調(diào)控等方面發(fā)揮不同作用，參與調(diào)控花青昔代謝的AtBBXs成員主要集中在第IV亞族[2]。本研究基于系統(tǒng)發(fā)育分析推測不同亞族的CmBBXs蛋白在菊花生長發(fā)育過程中也發(fā)揮不同的功能，其中13個V亞族的CmBBXs成員有可能參與菊花的花青苷代謝調(diào)控。

表2菊花CmBBXs蛋白理化性質(zhì)分析與亞細胞定位預(yù)測

注：nucl代表細胞核，cyto代表細胞質(zhì)，chlo代表葉綠體，cysk代表細胞骨架。

圖2菊花CmBBXs保守結(jié)構(gòu)域分析與Motif分析

圖3菊花CmBBXs家族與擬南芥AtBBXs家族系統(tǒng)發(fā)育進化樹

I-V表示不同亞族，紅色為I亞族，黃色為Ⅱ亞族，綠色為Ⅲ亞族，藍色為IV亞族，紫色為V亞族）

2.4菊花CmBBXs啟動子順式作用元件

為了進一步研究CmBBXs的潛在應(yīng)答機制，提取CmBBXs啟動子上游2000bp序列，進行順式作用元件預(yù)測，結(jié)果顯示（圖4），CmBBXs家族成員的順式作用元件包括光響應(yīng)相關(guān)元件、激素響應(yīng)相關(guān)元件、抗逆與脅迫響應(yīng)相關(guān)元件以及MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。其中光響應(yīng)元件最多，大部分成員都存在多個光響應(yīng)元件，這表明CmBBXs可能在光信號調(diào)控中發(fā)揮作用，而光能夠促進菊花花青昔合成，因此，CmBBXs在光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及花青苷代謝中的潛在作用值得進一步研究。

此外，CmBBX24、CmBBX22.4、CmBBX7與CmBBX28.3這4個成員的啟動子區(qū)存在與類黃酮生物合成調(diào)控相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點。這表明部分CmBBXs可能與MYB轉(zhuǎn)錄因子相互作用，從而參與調(diào)控類黃酮色素的生物合成。

2.5 UV-A處理下菊花花瓣花青苷含量

研究表明紫外光對植物花青苷的合成有促進作用[27]，研究對‘科隆香水’菊花進行了紫外光（UV-A）處理，持續(xù)觀察花瓣表型并測定花青昔相對含量。從圖5可以看出，處理0d時菊花花瓣內(nèi)輪呈現(xiàn)綠色，外輪為白色，隨著UV-A處理時間的延長，內(nèi)輪綠色褪去，外輪白色部分增多，到處理14d時，花瓣外輪變紅，檢測花青苷含量（圖6）發(fā)現(xiàn)處理14d時菊花花瓣中花青苷含量顯著上升，這表明UV-A能夠促進菊花花瓣花青昔合成。

2.6UV-A處理下菊花CmBBXs的表達模式分析

為了篩選可能參與菊花花青昔代謝的CmBBXs成員，在UV-A處理下收集處理 ^48h 內(nèi)不同時間點的菊花花瓣樣品，并檢測了CmBBXs的表達水平，同時分析了CmBBXs與已報道菊花花青苷合成轉(zhuǎn)錄因子CmMYB6表達模式的相關(guān)性[28]

圖4菊花CmBBXs啟動子順式作用元件分析

圖5UV-A處理菊花切花（圖中標(biāo)尺為 3cm ）

圖6UV-A處理下菊花花瓣花青苷相對含量[-圖中不同小寫字母a，b表示不同處理天數(shù)下菊花花瓣花青苷含量差異顯著（Plt;0.05） ]

僅30個CmBBXs在花瓣中檢測到表達，其余5個成員未檢測到表達信號，推測這5個基因在花瓣中表達水平較低或不表達。對30個CmBBXs基因的表達進行了聚類分析（圖7），結(jié)果顯示在UV-A處理下，CmBBX20、CmBBX22、CmBBX22.2與CmBBX28.2的表達模式與CmMYB6相似，提示這些基因可能與CmMYB6共同調(diào)控紫外光誘導(dǎo)的花青昔積累。此外，還有7個成員在UV-A處理下表達量整體呈上升趨勢，且在 48h 時顯著上調(diào)，與CmMYB6的表達趨勢一致，這些基因可能是紫外光誘導(dǎo)花青昔代謝的潛在調(diào)控因子。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

CmBBXs與AtBBXs構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹表明，除CmBBX33單獨聚類成一支外，其余34個成員能夠與AtBBXs聚類成5個亞族，并且符合擬南芥中的分類規(guī)則。擬南芥I、Ⅱ亞族中含有2個B-box與1個CCT結(jié)構(gòu)域，I亞族中的成員存在1個B-box與1個CCT結(jié)構(gòu)域，IV亞族成員存在2個B-box結(jié)構(gòu)域，V亞族成員存在1個B-box結(jié)構(gòu)域，且V、V亞族無CCT結(jié)構(gòu)[。在鑒定的CmBBXs中I、Ⅱ、Ⅲ亞族的成員中存在B-box與CCT結(jié)構(gòu)域，IV、V亞族僅鑒定出B-box結(jié)構(gòu)域，這與擬南芥中的分類相似。在水稻中鑒定出30個OsBBX成員，根據(jù)BBX保守結(jié)構(gòu)域的組成與系統(tǒng)進化樹分析也可以分成5個亞族[7，此外在多個物種的BBX基因家族鑒定研究中也有類似發(fā)現(xiàn)[8.29-30]。可以看出不同物種的BBX在進化過程中相對保守，都能夠分為5個亞族，并且每個亞族中的成員在保守結(jié)構(gòu)域的組成上相似。

圖7UV-A處理48h內(nèi)菊花CmBBXs表達模式（紅框內(nèi)為CmMYB6與表達模式相近的CmBBXs成員）

不同亞族的BBX成員可能發(fā)揮不同作用，擬南芥中I亞族的成員主要參與開花調(diào)控及光周期響應(yīng)[2，菊花中鑒定出5個I亞族成員，主要與AtBBX2、AtBBX6親緣相近，并且這5個成員啟動子上游序列中都存在許多響應(yīng)植物激素、光信號的順式作用元件，其可能通過參與激素信號與光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來調(diào)控開花與光周期響應(yīng)。菊花中鑒定出Ⅱ亞族成員7個，主要與AtBBX7、AtBBX11親緣相近，其中AtBBX7調(diào)控開花，AtBBX11與葉綠素合成有關(guān)，二者都屬于Ⅱ亞族[2]，Ⅱ亞族的7個CmBBXs可能有類似功能。擬南芥IⅣ亞族成員主要參與花青苷代謝與下胚軸調(diào)控[2，菊花中鑒定出13個V亞族成員，主要與AtBBX20、AtBBX22及AtBBX24親緣較近，其中與AtBBX22相近成員最多，擬南芥中AtBBX20、AtBBX22及AtBBX24都參與花青苷代謝調(diào)控，菊花中的CmBBX20、CmBBX20.1、CmBBX20.2、CmBBX22.1等成員也存在大量光信號元件，也可能參與花青苷的代謝，值得進一步研究。

研究結(jié)果表明，UV-A能夠促進采后切花菊花瓣中花青苷的積累，在許多園藝作物中都有相類似的研究結(jié)果。有研究表明，UV-B能夠促進菊花花瓣中花青苷與類黃酮物質(zhì)的積累[31-33]，UV-A能夠促進多種植物中花青苷的合成[34-3，這些已有研究證明了研究結(jié)果的可靠性。基于此，進一步分析了UV-A處理 ^48h 內(nèi)多個時間點的CmBBXs與已知的花青苷正向調(diào)控基因CmMYB6的表達模式，發(fā)現(xiàn)有4個CmBBXs與CmMYB6表達都是持續(xù)上調(diào)，這與花青昔積累模式相似，由于基因調(diào)控速度遠快于次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，研究中UV-A處理14d時花瓣中花青昔含量上調(diào)。因此推測 ^48h 內(nèi)表達量持續(xù)上調(diào)且與CmMYB6表達模式相似的CmBBXs可能參與花青苷代謝。在紫薇（Lagerstroemiaindica）中研究發(fā)現(xiàn)，黑暗處理會抑制葉片中花青苷的積累，恢復(fù)光照則可促進花青苷合成，有學(xué)者基于此分析黑暗與光照處理條件下LiBBX的表達模式，篩選與花青昔積累模式相似的LiBBX，最終鑒定出參與花青昔代謝的LiBBX4[37]。有學(xué)者在矮牽牛（Pe tunia×hybridc ）中的研究發(fā)現(xiàn)，白光促進矮牽?；ò曛谢ㄇ嘬辗e累，紅光則起抑制效應(yīng)，通過分析白光與紅光處理下的矮牽牛轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)有7個差異表達BBX基因可能參與花青苷合成[38]，有學(xué)者在云南楊（PopulusyunnanensisDode）中鑒定出43個PyunBBX，通過分析其在UV-B下的表達模式。篩選出12個表達上調(diào)的PyunBBX，并從中鑒定出參與花青昔調(diào)控的PyunBBX18l39]。在芒果（Mangifera indica）中研究發(fā)現(xiàn)，MiBBX24和MiBBX27參與藍光誘導(dǎo)下的芒果花青苷合成[40]。這些研究結(jié)果表明，通過研究不同光處理下BBX的表達模式能夠篩選出可能參與花青日代謝的BBA成貝。

UV-A能夠促進菊花花瓣中花青苷的積累，進一步研究CmBBXs在UV-A下的表達模式篩選出CmBBX20、CmBBX22、CmBBX22.2與CmBBX28.2這4個成員是潛在的菊花花青昔調(diào)控基因，這些CmBBXs皆屬于第IV亞族（其中CmBBX28.2雖命名為BBX28.2，但進化樹聚類屬于V亞族）。擬南芥中研究發(fā)現(xiàn)AtBBX21、AtBBX23和AtBBX24都能夠通過AtHY5來調(diào)控花青苷的合成，蘋果中的研究發(fā)現(xiàn)MdBBX20、MdBBX22在花青苷合成中起正調(diào)控作用[1l-12]，梨中PpBBX21，草莓中FaBBX24都對花青苷代謝具有調(diào)控效應(yīng)[41-42]。這些植物中已鑒定的參與花青苷調(diào)控的BBX都屬于V亞族，所以本研究中鑒定出的這4個CmBBXs成員極有可能參與花青苷的代謝，值得更進一步的研究。此外有學(xué)者不僅鑒定出參與花青昔代謝調(diào)控的BBX成員，并且探究其互作因子，豐富了花青苷代謝的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在蘋果中的研究發(fā)現(xiàn)，蘋果BBX蛋白MdCOL11能夠促進花青苷的合成，并且能夠激活蘋果花青苷調(diào)控基因MdMYBA的表達[43]，此外蘋果中MdBBX1、MdBBX17、MdBBX15、MdBBX35、MdBBX51與MdBBX54都能夠激活花青苷正調(diào)控因子MdMYB10的表達[44]，在草莓中的研究發(fā)現(xiàn)FaMYB5能夠與FaBBX24互作從而調(diào)控草莓中花青苷的合成[42]，說明 BBX 很有可能通過MYB參與花青苷代謝調(diào)控。除MYB外，BBX還能夠通過HY5來調(diào)控花青昔代謝，在擬南芥中研究發(fā)現(xiàn)AtBBX21能夠調(diào)節(jié)AtHY5的表達，進而促進花青苷的合成，AtBBX24能夠干擾AtHY5與花青苷合成基因啟動子的結(jié)合，從而抑制花青苷的積累[45]，在楊樹中過表達PtrBBX23能夠促進MYB轉(zhuǎn)錄因子與花青苷結(jié)構(gòu)基因的表達，從而促進花青苷合成，并且PtrBBX23能夠與PtrHY5互作[4，蘋果MdBBX37能夠與花青苷正向調(diào)控因子MdMYB1、MdMYB9互作，抑制二者對下游靶標(biāo)的結(jié)合，從而抑制花青苷積累；并且MdBBX37能夠與MdHY5的啟動子相結(jié)合，通過抑制MdHY5的表達影響花青苷代謝[47]，蕎麥中FtBBX22和FtHY5能夠形成復(fù)合物促進FtMYB42的表達從而正向調(diào)節(jié)光誘導(dǎo)的花青素積累[48]。這說明BBX-MYB-HY5可能構(gòu)成花青苷代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在菊花中CmBBXs是否與CmMYB、CmHY5共同調(diào)控花青苷代謝還有待進一步研究。

3.2 結(jié)論

從菊花基因組數(shù)據(jù)中鑒定出35個CmBBXs成員，并對其進行命名。蛋白理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)大部分CmBBXs屬于酸性、不穩(wěn)定蛋白，都具有親水性。CmBBXs具有不同保守結(jié)構(gòu)域與Motif數(shù)量，這可能導(dǎo)致其成員間的功能差異。進化分析發(fā)現(xiàn)CmBBXs與擬南芥AtBBXs相似，成員分為5個亞族。順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)CmBBXs存在許多光響應(yīng)相關(guān)元件、激素響應(yīng)相關(guān)元件、抗逆與脅迫響應(yīng)相關(guān)元件以及MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，這說明CmBBXs可能參與調(diào)控光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、光形態(tài)建成與激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。UV-A下CmBBXs表達模式分析發(fā)現(xiàn)CmBBX20、CmBBX22、CmBBX22.2與CmBBX28.2這4個成員表達上調(diào)，且與菊花花青苷代謝調(diào)控基因CmMYB6表達相似，是潛在的菊花花青昔代謝調(diào)控基因。

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（責(zé)任編輯：高國賦）