基于CarbonS技術(shù)的UPLC-MS/MS法測(cè)定藥酒中3種茛烷類(lèi)生物堿

Determination of Three Hyoscypane Alkaloids in Medicinal Wine by UPLC-MS/MS Method Based on Carbon S Technology

ZHONG Xue，MENG Chunyang， WU Yutian， ZHOU Yibing，LIN Ye， ZOU Lu* （Guizhou Provincial Center for Disease Control and Prevention， Guiyang 55ooo4， China） Abstract： Objective： To establish a rapid method for the detection of three types of hyoscypane alkaloids in medicinal wine.Method： The samples were extracted with acetonitrile and purified with Carbon S adsorbent.The mobile phase was methanol-5 mmol L^-1 ammonium formate （containing 0.1% formic acid），and the detection was caried out in the multi-reaction monitoring positive ion mode.Result： The three kinds of hyoscypane alkaloids had a good linear relationship in the range of 2.0μg?L^-1 to 100.0μg?L^-1， and the correlation coefficient was greater than 0.999; the detection limit was 0.10μg?L^-1 to 0.25μg?L^-1 ，and the quantification limit was 0.25μg?L^-1 to 1.00μg?L^-1 the recovery rate of standard addition was 70.23% to 90.10% ，and the relative standard deviation was 1.71% to 7.44% Conclusion： This method is simple and accurate，and can be used for the rapid analysis of hyoscypane alkaloids in medicinal wine.

Keywords： hyoscypane alkaloids; medicinal liquor; Carbon S

茛蓉堿是一類(lèi)廣泛存在于茄科植物中的酯類(lèi)化合物[]，多存在于曼陀羅屬植物如洋金花中[2]。茛蓉堿主要的毒性成分為阿托品、東茛若堿和山茛蓉堿。近年來(lái)，茛蓉堿中毒的事件時(shí)有發(fā)生[3-4]，其中重度中毒可能導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)抑制、呼吸抑制、心律失常和昏迷甚至死亡。洋金花、曼陀羅等含有茛蓉堿的植物常被泡入酒中作藥酒飲用，由于部分人群對(duì)中草藥的認(rèn)知有限，誤將有毒植物當(dāng)作藥材泡酒，導(dǎo)致中毒事件頻發(fā)。因此，對(duì)藥酒中阿托品、東茛蓉堿和山茛瑩堿進(jìn)行檢測(cè)，可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)潛在的安全問(wèn)題。

目前，藥酒中茛榮烷類(lèi)生物堿的前處理方法多采用直接稀釋[5-7]、QuEChERS法[8]。藥酒中含有色素干擾，直接稀釋對(duì)色素等雜質(zhì)去除效果較差，QuEChERS法采用N-丙基乙二胺（N-PropylsulfonicAcid，PSA）和硫酸鎂（ MgSO₄ ）進(jìn)行凈化，對(duì)色素的去除效果有限。CarbonS是一種新型凈化劑，能在促進(jìn)色素吸附的同時(shí)提高疏水性化合物的回收率，在不影響茛蓉堿回收率的情況下可提供高效的基質(zhì)凈化效果。此外，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Ultra Performance Liquid Chromatography-TandemMassSpectrometry，UPLC-MS/MS）在各種基質(zhì)的生物堿檢測(cè)中應(yīng)用廣泛，可以快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)樣品中茛蓉烷類(lèi)生物堿的含量。

基于此，本文提出采用CarbonS凈化結(jié)合QuEChERS法進(jìn)行前處理，UPLC-MS/MS法檢測(cè)藥酒中阿托品、東茛蓉堿和山茛蓉堿，以期為快速鑒定茛蓉堿提供高效、準(zhǔn)確的篩查方法。

1材料與方法

1.1材料與試劑

國(guó)公酒、中華跌打酒、風(fēng)濕跌打藥酒，市售。

阿托品、山茛蓉堿、東茛蓉堿標(biāo)準(zhǔn)品，上海安譜璀世標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；甲酸（色譜純），阿拉丁公司；CNWBONDPSA填料，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；CarbonS，美國(guó)安捷倫公司。

1.2儀器與設(shè)備

Agilent1290InfinityI超高效液相色譜儀、Agilent6470三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)Agilent公司；N-EVAP氮吹儀，上海安普科技有限公司；3-30KS高速離心機(jī)，德國(guó)賽多利斯公司。

1.3樣品前處理

移取 2.0mL 試樣于離心管中，加入 8mL 乙腈，混勻，加入 0.2gNaCl ， 0.2gMgSO₄ ，渦旋5min ，高速離心，取上層有機(jī)相于 10mL 容量瓶中，乙腈定容，轉(zhuǎn)移至離心管中，加入 0.2g PSA， 0.3g Carbon S、 0.2gMgSO₄ ，渦旋 2min ，高速離心，取上清液 5mL 進(jìn)行氮吹至近干，殘?jiān)?1.0mL 初始流動(dòng)相復(fù)溶，過(guò) 0.22μm 濾膜，供UPLC-MS/MS測(cè)定。

1.4標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱(chēng)取 10.42mg 阿托品、 20mg 山茛蓉堿、20mg 東茛蓉堿于 10mL 容量瓶中，使用乙腈溶液定容至刻度，得到濃度為 1.042mg?mL^-1 的阿托品、 2.0mg?mL^-1 的山茛蓉堿和 2.0mg?mL^-1 的東茛榮堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。用初始流動(dòng)相逐步稀釋至濃度為200ng?mL^-1 的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。取不同體積的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，加入 500μL 基質(zhì)空白溶液，配制成濃度分別為 2.0，5.0，10.0，20.0，40.0，60.0，80.0ngmL^-1 和 100.0ng?mL^-1 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.5 儀器條件

1.5.1 色譜條件

Thermo Hypersil GOLD色譜柱（ 100mm×2.1mm 1.9μm ）；流速： 0.25mL?min^-1 ；進(jìn)樣量： 5μL ；柱溫： 35^°C ；流動(dòng)相A濃度為 5mmol?L^-1 的甲酸銨（含0.1% 甲酸），流動(dòng)相B為甲醇。梯度洗脫程序： 0～ 1.0min ， 10%B . 1.0～9.0min ， 10%70%B ： 9.0～ 10.0min ， 70%B ； 10.0～11.0min ， 70%10%B ：11.0～13.0min ， 10%B 。

1.5.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源正離子模式（ ESI⁺ ）；脫溶劑溫度： 300^°C ；毛細(xì)管電壓： 4000V ；鞘氣流速：11Lmin^-1 ；噴霧器壓力：45psi（ 310kPa ；鞘氣溫度：250°C ；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MultipleReactionMonitoring，MRM）模式。質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

1.6 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（MatrixEffect，ME）計(jì)算公式為

式中： ME 為基質(zhì)效應(yīng)， 0% ： B 為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率； A 為純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線斜率。通常，|ME|?20.0% 時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)可忽略不計(jì)； 20.0%lt; |ME|?50.0% 時(shí)，表明基質(zhì)效應(yīng)較弱； |ME|gt;50.0% 時(shí)，表明有強(qiáng)基質(zhì)干擾。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 提取條件優(yōu)化

QuEChERS法常用提取試劑為乙腈，常用鹽析劑為 MgSO₄ 、 NaCl 。 MgSO₄ 的作用是結(jié)合體系中的水分； ΔNaCl 可以促進(jìn)相分離，使待測(cè)生物堿在樣品中發(fā)生液液分配。本文采用乙腈提取，考察 MgSO₄ 與 NaCl 加人量對(duì)生物堿提取效率的影響。結(jié)果表明，MgSO₄ 與 NaCl 加入量均為 0.2g ，質(zhì)量比為 1：1 時(shí)，提取效率最好，均大于 80% 。

表1質(zhì)譜參數(shù)

注： * 為定量離子。

2.1.2 凈化方式的優(yōu)化

藥酒基質(zhì)復(fù)雜，若直接進(jìn)樣干擾較大，且影響色譜柱的壽命，需加入合適的吸附劑進(jìn)行凈化。PSA可有效吸附酚類(lèi)、糖類(lèi)、有機(jī)酸等。藥酒中的色素會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果，而CarbonS具有較強(qiáng)的色素去除能力， MgSO₄ 可進(jìn)一步除去水分，利于后續(xù)濃縮。本研究將PSA與CarbonS作為吸附劑， MgSO₄ 為干燥劑，對(duì)PSA和CarbonS設(shè)置不同的比例，研究其對(duì)回收率的影響情況，結(jié)果見(jiàn)圖1。CarbonS與PSA加入量分別為 0.1g 和 0.2g （質(zhì)量比為 1：2 時(shí)，回收率（均大于 80% ）相對(duì)較高。

圖1加入不同比例的PSA和CarbonS的生物堿回收率

2.1.3 基質(zhì)效應(yīng)

根據(jù)1.6評(píng)判基質(zhì)效應(yīng)，得到阿托品、山茛若堿、東茛榮堿ME值分別為 -42.22% 、 -40.44% 、 -41.76% 均有基質(zhì)干擾。因此，本文采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)減少基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.2 色譜及質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

由于阿托品、山茛蓉堿和東茛蓉堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)帶有氨基基團(tuán)，正離子模式下易生成 [M+H]⁺ 峰。Q1掃描模式下，可以觀察并鑒別出明顯高于背景噪音的母離子。之后進(jìn)行子離子掃描，選取兩個(gè)豐度較高的碎片離子，其中豐度最高的碎片離子作為定量離子，另一離子為定性離子。在此基礎(chǔ)上優(yōu)化碎裂電壓和碰撞電壓等參數(shù)，以獲得最佳的質(zhì)譜條件，確保特征離子對(duì)的比例和相對(duì)豐度效果達(dá)到最佳，優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見(jiàn)表1。

2.2.2 色譜條件優(yōu)化

通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流動(dòng)相A選用 0.1% 甲酸水時(shí)，色譜峰會(huì)拖尾，加入甲酸銨可提高各目標(biāo)物的離子化效率；流動(dòng)相B若選用乙腈作為有機(jī)相，峰形存在分叉和拖尾現(xiàn)象。此外，對(duì)比不同色譜柱的分離效果。使用BEHHILIC色譜柱時(shí)柱效較低，分離度較差，存在相互串?dāng)_；采用HSST3色譜柱時(shí)，東茛蓉堿和山茛蓉堿響應(yīng)較低，分離度較差。使用ThermoHypersilGOLD色譜柱時(shí)，阿托品、山茛蓉堿和東茛蓉堿峰形對(duì)稱(chēng)、響應(yīng)值較高和分離度較好，無(wú)串?dāng)_。因此，選用ThermoHypersilGOLD色譜柱，甲醇-5mmol?L^-1 甲酸銨溶液（含 0.1% 甲酸）為流動(dòng)相，山茛蓉堿、東茛蓉堿、阿托品的保留時(shí)間分別為4.305、4.376、 5.780min （圖2）

2.3線性方程、檢出限和定量限

以系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以其對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3倍信噪比（SN=3）對(duì)應(yīng)的濃度為檢出限，以10倍信噪比（ S/N=10 ）對(duì)應(yīng)的濃度為定量限，得到線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限結(jié)果如表2所示。3種生物堿在 2.0～100.0μg?L^-1 線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于 0.999 。檢出限在 0.10～0.25μg?L^-1 ，定量限在0.25～1.00μg?L^-1 ，可滿足檢測(cè)要求。

2.4加標(biāo)回收率與精密度

在 2.0mL 藥酒空白樣品中分別加入10、40、80μg?L^-1 這3個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行6次平行試驗(yàn)，計(jì)算加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表3。藥酒中3種茛旁堿的加標(biāo)回收率在 70.23% ～90.10% ，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在 1.71%～6.59% ，表明具有較好的回收率和精密度。

表23種生物堿的線性方程、檢出限和定量限

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

對(duì)藥店中隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)的3批次不同生產(chǎn)廠家藥酒進(jìn)行檢測(cè)，均未檢出阿托品、山茛蓉堿和東茛蓉堿。

3結(jié)論

本研究采用以CarbonS凈化的QuEChERS前處理方法，并結(jié)合UPLC-MS/MS技術(shù)，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)藥酒中阿托品、山茛蓉堿和東茛夢(mèng)堿的準(zhǔn)確測(cè)定。該方法具有較高的準(zhǔn)確性、靈敏度，能夠滿足藥酒中3種茛蓉烷類(lèi)生物堿定性、定量分析的要求，可用于藥酒中茛旁烷類(lèi)生物堿的快速分析。

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