類芽孢桿菌對(duì)攜帶NDM基因的超級(jí)耐藥大腸桿菌的抑菌活性分析

doi：10.13304/j.nykjdb.2024.0457

中圖分類號(hào)：S968.22 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1008-0864（2025）08-0119-13

Analysis of Bacteriostasis Activity of Paenibacillus sp.Against Super Drug-resistant Escherichia coli CarryingNDM Genes

LI Haili ^1，2 ， YANG Fan2， CHEN Jianhao2， YANG Kang2， YANG Yiping2， DUAN Jingang2， LI Bin2， ZHANG Wanqi2，MA Chunjiang2 （1.InstituteofAnimal Husbandry，HenanAcademyofAgriculturalSciences，Zhengzhou450o02，China；2.HamiCityAnimal Disease Prevention and Control Center Xinjiang，Xinjiang Hami 839oo1，China）

Abstract：Inorderto screen medicinal plant endophytes with goodantibacterial activityagainst super drug-resistant Escherichia coli that simultaneously carry New Delhi metal- β lactamase（NDM）gene NDM1/NDM5and NDM4/ NDM5，the endophytes of Forsythia suspensa that had antagonistic effects on the super drug-resistant E .coli carrying NDMI/NDM5and NDM4/NDM5were isolatedand screened bysurfacedisinfectionmethodand plateconfrontation method.Morphological and molecular biological identificationof these endophytes were performed，and their antibacterialactivities were investigatedbygenome-wideanalysis.Theresultsshowed that23strainsof endophytes wereisolatedfromroot，stem，leafand fruitdifferentofForsythiasuspensa.AGram-positiveendophyte with good antibacterial efect wasobtained from23endophyte strains byplate confrontationassay.Itwas identifiedas

Paenibacillussp bymorphologyand molecular identification，andnamedas HNYJ2209J.HNYJ2209J could effectively inhibit the super drug-resistant E .coli.Whole genome sequencing analysis showed that the genome size of HNYJ2209Jwas5827342bp，the content ofGCwas 46.22% ，and the number ofcoding geneswas5232.There were 5 229，3 648，4 107，3 493 and 2495 annotated genes by NR，Swis-Prot，COG，GO and KEGG databases， respectively，and 8 gene clusters related to secondary metabolite synthesis were predicted byantiSMASH.The main secondary metabolites werecyclolipopeptide antibiotics（fusaricidin B），tridecaptin，polymyxin B，paenibacilin， marthiapeptideA，paeninodin，paenilipoheptin and aurantinin B/C/D.Among them，fusaricidin B，tridecaptin， polymyxin B and paenibacillin showed 100% ， 100% ， 100% and 90% homology between the predicted synthetic gene cluster and the known gene cluster.To sumup，HNYJ22O9Jhadthe potential to develop new drugs against super drug-resistant E.coli carrying NDM1/NDM5and NDM4/NDM5andas a feedable microorganism.

Keywords：Paenibacillussp.；Forsythia suspensa；endophytes；feeding microorganism；antibacterial effect; Escherichia coli；super drug-resistant

大腸桿菌（Escherichiacoli）是一種重要的人畜共患病原體，在世界范圍內(nèi)流行，對(duì)畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。隨著我國畜禽養(yǎng)殖規(guī)模化發(fā)展及抗生素用量的增加，細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)，獸醫(yī)臨床出現(xiàn)多重耐藥菌株和超級(jí)耐藥菌株，嚴(yán)重威脅著公共衛(wèi)生安全和畜禽產(chǎn)品安全。目前，大腸桿菌感染的治療主要依賴抗生素，然而，大腸桿菌耐藥性是非常令人擔(dān)憂的問題。抗耐藥微生物及其活性產(chǎn)物資源的開發(fā)和利用被認(rèn)為是抗生素的可行替代品。研究表明，藥用植物內(nèi)生菌及其代謝活性產(chǎn)物具有開發(fā)新藥的潛力和解決細(xì)菌多重耐藥問題的潛力。因此，從藥用植物中尋找抗生素的替代品及新的抗耐藥微生物藥物是解決細(xì)菌耐藥性的重要舉措。

內(nèi)生菌是指生活史某一階段在健康的寄主植物體內(nèi)，但對(duì)寄主并不引起明顯病癥的細(xì)菌或真菌，可存在于植物的根、莖、葉、花、果實(shí)和種子等部位[3。藥用植物內(nèi)生菌存在于藥用植物體內(nèi)，能單獨(dú)合成與藥用植物相同或類似的活性產(chǎn)物。中藥材本身具有特殊的藥用價(jià)值，內(nèi)生菌可產(chǎn)生多種具有生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物和新的天然產(chǎn)物（naturalproducts，NPS）的潛力，特別是來自特定產(chǎn)地的道地藥材的內(nèi)生菌，是活性先導(dǎo)化合物的重要天然產(chǎn)物資源庫4。近年來，具有抗病毒、抗腫瘤、抗菌活性的植物內(nèi)生微生物次生代謝產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)為天然藥物的研發(fā)和生產(chǎn)提供了重要研究思路[5]。

中藥材內(nèi)生菌除產(chǎn)生具有抗菌、抗腫瘤和抗氧化作用的活性物質(zhì)外，還能產(chǎn)生抗蟲類、抗糖尿病類等其他作用的活性物質(zhì)。從巴西蓮子草（Alternantherabrasiliana）中分離出的枯草芽孢桿菌（Bacillussp）可產(chǎn)生與其寄主植物相同的生物活性化合物;從藥用植物鳶尾（IristectorumMaxim）內(nèi)生真菌中分離出2種異構(gòu)體（pestacin和異pestacin）都表現(xiàn)出抗菌活性和抗氧化活性;從莢蘭屬（Podorchid）植物內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物中分離的芳香倍半萜烯類物質(zhì)對(duì)惡性瘧原蟲（Plasmodium）具有顯著殺滅活性;黃連（CoptischinensisFranch）內(nèi)生真菌Phomopsissp.能夠產(chǎn)出黃連主要活性生物堿小檗堿;從短葉紅豆杉（Taxus brevifolia）內(nèi)生菌安德列亞霉（Taxomycesandreanae）的次生代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了抗癌化合物紫杉醇[；藥用植物烏頭（AconitumcarmichaeliDebx）的內(nèi)生菌黑孢霉（Nigrosporasp.）產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對(duì)流感病毒H1N1具有顯著抗病毒活性；從藥用植物Kennedianigriscans內(nèi)生菌StreptomycesNRRL30562中分離了4種肽類化合物，具有廣譜抗菌活性；長春花（Catharanthusroseus）中分離的內(nèi)生真菌尖孢鏈孢菌（Fusariumoxysporum）能夠產(chǎn)生抗癌物質(zhì)長春新堿[13]；藥用植物附子（RadixAconitiLateralisPreparata）中分離的鏈霉菌屬（Streptomycessp.）微生物能產(chǎn)生具有抗真菌活性的 _2，2， -聯(lián)吡啶類化合物u4；來自喜樹（CamptothecaacuminataDecne）種子的內(nèi)生放線菌能產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物喜樹堿[15]。

藥用植物及其內(nèi)生菌是重要的藥用資源，有利于天然藥物的研究與開發(fā)，這類內(nèi)生菌一旦開發(fā)，能夠直接與實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用相關(guān)聯(lián)，產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。這對(duì)加大天然產(chǎn)物的生產(chǎn)力及藥用植物的保護(hù)均具有重要意義，對(duì)民族藥和中藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要推動(dòng)作用。中藥材內(nèi)生菌是一個(gè)用之不竭的重要化合物庫，是可持續(xù)發(fā)展的資源，因此，加大內(nèi)生菌代謝成分的研究，獲取新的有效成分途徑是未來研究的重點(diǎn)。進(jìn)一步深入了解內(nèi)生菌與宿主植物的動(dòng)態(tài)相互作用和內(nèi)生菌基因的起源將有利于中藥材內(nèi)生菌戰(zhàn)略產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。此外，在新資源匱乏的今天，內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物可能會(huì)成為新化合物獲得的突破點(diǎn)。目前，從獸醫(yī)臨床分離出大量耐藥菌，尤其是同時(shí)攜帶新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶（NewDelhimetal- ?β -lactamase，NDM）基因NDM1/NMD5和NDM4/NDM5基因的超級(jí)耐藥菌的出現(xiàn)，給動(dòng)物疫病防控和公共衛(wèi)生安全造成了極大威脅。因此，本研究擬從連翹（Forsythiasuspensa）根、莖、葉、花和果中分離并篩選針對(duì)超級(jí)耐藥大腸桿菌具有抑菌活性的內(nèi)生菌，并對(duì)其抑菌效果及抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行研究，旨在為新型抗菌活性物質(zhì)篩選和新型抗耐藥微生物藥物研究提供參考。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1藥用植物組織連翹根、莖、葉、花、果實(shí)等組織均采自三門峽連翹種植基地。

1.1.2供試菌株同時(shí)攜帶新德里金屬 β -內(nèi)酰胺酶NDM1/NMD5和NDM4/NDM5基因的超級(jí)耐藥大腸桿菌由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所分離、鑒定、保存[16-17]。

1.1.3試劑與培養(yǎng)基TSA（tryptone soyagar）、TSB（tryptic soyBorth）、PDA（potato dextrose agar）和LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基均購自北京路橋生物科技有限公司；Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、SanTaqPlusPCRMix預(yù)混液購自生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1連翹內(nèi)生菌的分離將連翹根、莖、葉、花和果進(jìn)行表面消毒，然后接種至PDA培養(yǎng)基上，37°C 培養(yǎng) 48～72h ，挑取不同形態(tài)的菌落在TSA培養(yǎng)基上純化，然后通過顯微鏡觀察形態(tài)特征，剔除相同的菌株。純化后的菌株 -80^°C 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2拮抗內(nèi)生菌的篩選取 -80°C 保存的內(nèi)生菌在TSA培養(yǎng)平板中央劃線接種，然后在劃線內(nèi)生菌的兩側(cè)分別劃線接種同時(shí)攜帶新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶基因NDM1/NMD5和NDM4/NDM5的超級(jí)耐藥大腸桿菌， 37^°C 培養(yǎng) 24h ，觀察內(nèi)生菌對(duì)病原菌的抑制情況。

為進(jìn)一步探究內(nèi)生菌的抑菌活性，取 -80^°C 保存的內(nèi)生菌接種至TSA平板中央，然后將 1× 10⁹CFU?mL^-1 的超級(jí)耐藥大腸桿菌菌液涂布在內(nèi)生菌周圍， 37°C 培養(yǎng) 24h ，觀察內(nèi)生菌對(duì)超級(jí)耐藥大腸桿菌的抑制情況。若內(nèi)生菌周圍有透明抑菌圈，說明內(nèi)生菌對(duì)超級(jí)耐藥大腸桿菌有抑菌和殺菌效果。抑菌效果以抑菌圈大小表示，抑菌圈直徑 gt;20mm 表示抑菌效果較強(qiáng)， 10mmlt; 抑菌圈直徑 lt;20mm 表示抑菌效果中等，抑菌圈直徑 lt;10 mm 表示抑菌效果較弱。

1.2.3內(nèi)生菌形態(tài)觀察挑取平板內(nèi)生長的內(nèi)生菌單菌落涂布于載玻片上，革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察內(nèi)生菌形態(tài)。

1.2.4內(nèi)生菌分子鑒定使用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒按說明書步驟提取DNA；采用16SrRNA（引物序列： ?5^′ -AGAGTTTGATCCTGG-CTCAG-3';5'-GGTTACCTTGTTACGACTTC-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序鑒定。PCR體系 50μL ： PCRMasterMix 25μL，DNA2μL. ，超純水 19μL ，上、下游引物各 2μL 。PCR程序： 95^°C30s;95^°C60s ，55^°C60s，72^°C60s，30 個(gè)循環(huán)； 72^°C30s 。對(duì)PCR產(chǎn)物檢測(cè)合格后送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。通過與本地?cái)?shù)據(jù)庫對(duì)比，基于16SrRNA序列選擇在種屬水平上最接近的20株菌株，通過MEGA6.0軟件選擇NJ（neighbor-joining）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定內(nèi)生菌的種屬。

1.2.5內(nèi)生菌發(fā)酵液活性檢測(cè)首先，將同時(shí)攜帶新德里金屬 β -內(nèi)酰胺酶NDM1/NMD5和NDM4/NDM5基因的超級(jí)耐藥大腸桿菌涂布至整個(gè)平板，然后挑取 -80^°C 保存的內(nèi)生菌接種至TSB培養(yǎng)基中， 37^°C 培養(yǎng) 24h，12000r?min^-1 離心 10min ，取上清液用 0.22μm 無菌濾膜過濾。添加 100μL 內(nèi)生菌發(fā)酵液至涂布于有超級(jí)耐藥大腸桿菌的平板中，4次重復(fù)，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈大小，取其平均值。

1.2.6全基因組測(cè)序?qū)⒃?-80^°C 低溫冰箱保存的內(nèi)生菌劃線接種在TSA培養(yǎng)基上， 37°C 培養(yǎng)24h ，挑取單菌落接種于 200mL TSB肉湯培養(yǎng)基， 37^°C 培養(yǎng) 24h，12000r?min^-1 離心 5min ，棄上清，留菌體沉淀，菌體送至武漢菲沙基因信息有限公司采用IluminaHiseq+PacBio的測(cè)序方式進(jìn)行全基因組測(cè)序。

1.2.7基因組組裝及基因組注釋首先，利用短序列組裝軟件 SOAPdenovo2（http：//soap.genomics.org.cn/對(duì)IlluminaHiseq測(cè)序后的優(yōu)化序列進(jìn)行多個(gè)Kmer參數(shù)的組裝，得到基因組掃描圖；然后，再使用unicycler軟件對(duì)PacBio測(cè)序序列進(jìn)行組裝，最終得到完整的染色體及質(zhì)粒序列。通過與NCBI（national center for biotechnology information）、NR（non-redundant database）、Swiss-Prot（Swiss-Protprotein sequence database）、Pfam（the protein familydatabase）、COG（clusters of orthologous groups）、GO（gene ontology）、KEGG（Kyoto encyclopedia of genesand genomes）、VFDB（virulence factors of pathogenicbacteria）數(shù)據(jù)庫比對(duì)，對(duì)預(yù)測(cè)到的編碼基因進(jìn)行功能注釋;通過碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫（CAZy，http：//www.cazy.org/）分析碳水化合物活性酶活性，使用ResFinder 數(shù)據(jù)庫（https：//cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/）預(yù)測(cè)耐藥基因。

2 結(jié)果與分析

2.1內(nèi)生菌的分離及拮抗菌的篩選

從連翹根、莖、葉、花和果不同組織中共分離得到23株內(nèi)生菌，用平板對(duì)峙法從23株內(nèi)生菌中篩選出1株對(duì)同時(shí)攜帶NDM1/NDM5和NDM4/NDM5基因的超級(jí)耐藥大腸桿菌有抑制效果的內(nèi)生菌，將其命名為HNYJ2209J（圖1）。拮抗試驗(yàn)結(jié)果（圖2）表明，HNYJ2209J菌株對(duì)超級(jí)耐藥大腸桿菌有較好的抑制效果。

2.2 內(nèi)生菌HNYJ2209J的形態(tài)觀察

菌株HNYJ2209J在TSA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落為乳白色，圓形隆起。革蘭氏染色后呈紫色，為革蘭氏陽性菌，桿狀，孢子橢圓形（圖3）。

2.3內(nèi)生菌HNYJ2209J系統(tǒng)發(fā)育樹分析

對(duì)內(nèi)生菌HNYJ2209J基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得長度約 1800bp 的產(chǎn)物（圖4），對(duì)序列進(jìn)行同源性比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖5所示。可以看出，HNYJ2209J的序列與類芽孢桿菌（Paenibacillussp，GenBank登錄號(hào)為CP151948.1）序列相似度達(dá) 100% 。結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)

圖1拮抗菌株的篩選

A：攜帶NDM1/NDM5的超級(jí)耐藥大腸桿菌；B：攜帶NDM4/NDM5的超級(jí)耐藥大腸桿菌

A：Super-resistant E. coli carrying NDM1/NDM5 B：Super drug-resistantE.colicarryingNDM4/NDM5A：攜帶NDM1/NDM5的超級(jí)耐藥大腸桿菌；B：攜帶NDM4/NDM5的超級(jí)耐藥大腸桿菌

A：Super-resistant E.coli carrying NDMI/NDM5 B：Super drug-resistant E.coli carryingNDM4/NDM5

Fig.1Screening of antagonistic strains

圖2菌株HNYJ2209J對(duì)超級(jí)耐藥大腸桿菌的拮抗試驗(yàn) Fig.2Antagonism test of strain HNYJ22O9J on super drugresistantE.coli

Fig.3Morphology of strainHNYJ2209J

A：菌落形態(tài)；B：革蘭氏染色A：Colonymorphology;B：Gram staining因 UNV鑒定結(jié)果，將內(nèi)生菌HNYJ2209J鑒定為類芽孢桿菌。

2.4內(nèi)生菌HNYJ2209J發(fā)酵液的活性分析

由圖6可知，HNYJ2209J發(fā)酵液對(duì)攜帶NDM1/NDM5基因的超級(jí)耐藥大腸桿菌的抑菌圈 為 29±0.20mm ;對(duì)攜帶NDM4/NDM5基因的超級(jí) 耐藥大腸桿菌的抑菌圈為 （27.00±0.22）mm 。

圖4菌株HNYJ2209J的16SrRNAPCR結(jié)果 Fig.4 16SrRNA PCR result of strain HNYJ2209J

2.5 內(nèi)生菌HNYJ2209J基因組分析

注：M—Marker；1～3—HNYJ2209J的3次生物學(xué)重復(fù)。

Note：M—Marker;1～3—3biologicalreplicatesofHNYJ2209J.

對(duì)菌株HNYJ2209J基因組進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果（圖7）表明，其基因組序列全長為 5827342bp GC含量為 46.22% ；對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行組裝和注釋，預(yù)測(cè)其編碼基因數(shù)為5232個(gè)。

2.6內(nèi)生菌HNYJ2209J的功能基因分析

對(duì)菌株HNYJ2209J基因組進(jìn)行注釋，NR、Swiss-Prot、COG、GO、KEGG數(shù)據(jù)庫分別有5229、3648，4107，3493，2495 個(gè)基因被注釋；通過antiSMASH軟件預(yù)測(cè)到與次級(jí)代謝產(chǎn)物合成相關(guān)的有8個(gè)基因簇。

2.6.1GO數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果由圖8可知，分別有2314、4931和6198個(gè)蛋白注釋到與細(xì)胞組分（cellularcomponent）分子功能（molecularfunction）和生物過程（biologicalprocess）有關(guān)。其中，生物過程中涉及細(xì)胞過程和代謝過程的蛋白數(shù)量較多；細(xì)胞組分中主要是細(xì)胞結(jié)構(gòu)體和含蛋白質(zhì)復(fù)合物；分子功能中主要是催化活性和結(jié)合。

圖5菌株HNYJ2209J的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5Phylogenetic tree of strainHNYJ2209J

A：攜帶NDM1/NDM5的超級(jí)耐藥大腸桿菌；B：攜帶NDM4/NDM5 的超級(jí)耐藥大腸桿菌

A：Super-resistant E.coli carrying NDM1/NDM5 B：Super drugresistantE.coli carryingNDM4/NDM5

圖6HNYJ2209J菌株發(fā)酵液對(duì)超級(jí)耐藥大腸桿菌的抑菌效果

2.6.2KEGG數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果菌株HNYJ2209J在KEGG數(shù)據(jù)庫中共有2216個(gè)蛋白被注釋與細(xì)胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、人類疾病、新陳代謝和有機(jī)系統(tǒng)6大功能的40條通路有關(guān)（圖9）。在細(xì)胞過程中，真核細(xì)胞群落和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)是主要通路；在環(huán)境信息處理過程中，膜運(yùn)輸和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是主要通路；在新陳代謝過程中，碳水化合物代謝、氨基酸代謝、輔助因子和維生素代謝、能量代謝是主要代謝通路。

Fig.6Inhibitory effect of strain HNYJ2209Jon super drugresistantE.coli

圖7HNYJ2209J基因組圈圖

Fig.7 Genome circlemap ofHNYJ2209J

2.6.3COG數(shù)據(jù)庫注釋由圖10可知，有4749個(gè)蛋白在COG數(shù)據(jù)庫中得到注釋。其中，碳水化合物運(yùn)輸和代謝的占比最高，共有527個(gè)，占11.10% ；有494個(gè)（ 10.40% 蛋白與轉(zhuǎn)錄有關(guān)；有382個(gè)（ 8.04% ）蛋白參與一般功能預(yù)測(cè)；有350個(gè)（ 7.37% ）蛋白涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。

2.6.4碳水化合物活性酶活性分析通過CAZy（carbohydrate-activeenzymes）數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，HNYJ2209J菌株中共有219個(gè)基因編碼碳水化合物酶（表2），其中糖苷水解酶最多，占比為57.08% ；糖基轉(zhuǎn)移酶和碳水化合物酯酶次之，占比分別為 15.07% 和 14.61% ；輔助氧化還原酶、多糖裂合酶、碳水化合物結(jié)合模塊的占比分別為11.87%.0.91%.0.46% 0

2.6.5次級(jí)代謝產(chǎn)物抗菌活性物質(zhì)合成基因簇分析芽孢桿菌能產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，antiSMASH軟件預(yù)測(cè)分析（表3和圖12）表明，菌株HNYJ2209J基因組中有8個(gè)基因簇與次級(jí)代謝繁殖Reproduction[ 16 免疫系統(tǒng)過程Immune system process 18 行為Behavior 4 代謝過程Metabolic process 1653 碳水化合物的利用率Carbohydrateutilization 1 細(xì)胞過程Cellular process 2037 碳利用率Carbon utilization 1 病毒過程Viral process 19 氮利用率Nitrogenutilization 一 生殖過程Reproductive process 18 生物粘附Biologicaladhesion 12 信號(hào)Signaling 111 多細(xì)胞有機(jī)體過程Multicellular organismal process 110 發(fā)展過程Developmental process_ 251 15 生物學(xué)過lprocess 有節(jié)奏的過程Rhythmicprocess 1 積極調(diào)節(jié)生物過程Positiveregulationofbiological process 51 負(fù)向調(diào)節(jié)生物過程N(yùn)egativeregulation of biologicalprocess 74 生物過程調(diào)控Regulation of biologicalprocess 414 刺激反應(yīng)Responsetostimulus 1427 Biologicalprocessinvoedintraspecies 本地化Localization |14 1476 Clar component 多種有機(jī)物過程Multi-organismprocess 41 生物調(diào)節(jié)Biologicalregulation 1478 解毒Detoxification 19 蛋白質(zhì)復(fù)合物Protein-containing complex 193 病毒粒子組件Virioncomponent- 7 細(xì)胞結(jié)構(gòu)體Cellularanatomical entity 12109 分子功能 細(xì)胞骨架運(yùn)動(dòng)活性Cytoskeletal motor activity 5 Molecular function 催化活性Catalyticactivity 1956 結(jié)構(gòu)分子活性Structural molecule activity 61 運(yùn)輸活動(dòng)Transporteractivity 1429 結(jié)合Binding 1827 抗氧化活性Antioxidant activity 124 翻譯調(diào)節(jié)因子活性Translationregulatoractivity |12 分子換能器活性Molecular transducer activity 145 分子接頭活性Molecularadaptoractivityl 1 分子功能調(diào)節(jié)劑Molecular function regulator 18 分子載體活性Molecularcarrier activity 17 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑活性Transcription regulatoractivity 265 小分子傳感器活性Smallmolecule sensor activityl 70 ATP依賴活性ATP-dependent activityl 216 0 500 1000 1500 2000 數(shù)量Number產(chǎn)物合成相關(guān)。這些基因簇編碼的代謝產(chǎn)物包括以非核糖體途徑（non-ribosomal peptidesynthetase，NRPS）合成的環(huán)脂肽類抗生素（fusaricidenB）、噻唑環(huán)肽類化合物（marthiapeptideA）、十三肽菌素（tridecaptin）脂質(zhì)庚肽（paenilipoheptin）、多粘菌素B（polymyxinB）；以氨基端乙酰化的核糖體途徑合成的羊毛硫肽類化合物（lanthipeptide）細(xì)菌抗菌肽（paenibacillin）；以核糖體合成并經(jīng)過翻譯后修飾的天然肽類產(chǎn)物（RiPPs）套索肽（lassopeptide）、拉索肽（paeninodin）；以PKS（polyketidebiosynthase，PKS）途徑合成的抗菌物質(zhì)（aurantinin B/C/D）。其中，fusariciden B、tridecaptin和polymyxinB的預(yù)測(cè)合成基因簇與已知基因簇的同源性均為 100% ；而 paenibacillin、marthiapeptideA ? paeninodin ? aurantinin B/C/D和paenilipoheptin的預(yù)測(cè)合成基因簇與已知基因簇的同源性分別為 90% ） 41% ） 40% ） 35% 和 19% 。2.6.6抗菌物質(zhì)合成通路分析對(duì)菌株HNYJ2209J的代謝途徑進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，存在多種抗生素的生物合成途徑、吩嗪合成途徑、非核糖體合成的抗菌物質(zhì)的代謝途徑、苯丙烷類生物合成途徑、茛旁烷/哌啶/吡啶生物堿的生物合成、異喹啉生物堿的生物合成和芥子油昔生物合成。其中，抗生素的生物合成途徑包括碳青霉烯類合成、青霉素和頭孢菌素的生物合成、鏈霉素生物合成、阿卡波糖和井岡霉素的生物合成、單胺菌素生物合成、新生霉素生物合成、新霉素/卡那霉素/慶大細(xì)胞生長與死亡Cell growth and death 21 細(xì)胞運(yùn)動(dòng)Cell motility 72 細(xì)胞過程 真核細(xì)胞群落Cellular community prokaryotes 10 1107 Cellular processes 運(yùn)輸和分解代謝Transport and catabolism[ 244 膜運(yùn)輸Membrane transport 187 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)Signal transduction 52 折疊、分類和降解Folding，sortingand degradation 62 復(fù)制和修復(fù)Replicationand repair 6 轉(zhuǎn)錄Transcription 188 環(huán)境信息處理 125 Environmental 翻譯Translation 15 information 癌癥：特定類aicrsif 27 processing 耐藥性：抗菌Drug resistance：antimicrobial 15 耐藥性：抗腫瘤藥Drugresistance：antineoplastic 8 內(nèi)分泌代謝疾病Endocrine and metabolic disease- 1 免疫疾病Immune disease 16 感病 22 遺傳信息處理 神經(jīng)退行性疾病Neurodegenerative disease 11 Genetic information 藥物依賴Substancedependence 12 processing 氨基酸代謝Aminoacid metabolism 1192 基他次生代謝物的生物合成 60 Biosynthesis of other secondary metabolites 289 碳水化合物代謝Carbohydrate metabolism 117 能量代謝Energymetabolism 172 聚糖的生物合成和代謝Glycan biosynthesis and metabolism 81 人類疾病代謝 12849 1184 Humandiseases 萜類和多酮類的代謝Metabolism of terpenoidsandpolyketides 180 核苷酸代謝Nucleotide metabolism 39 異種生物降解和代謝Xenobioticsbiodegradationandmetabolism 8 老化Aging 6 消化系統(tǒng)Digestive system 21 內(nèi)分泌系統(tǒng)Endocrinesystem 9 有機(jī)系統(tǒng) 環(huán)境適應(yīng)Environmental adaptation |1 Organismal systems 排泄系統(tǒng)Excretory system 16 神經(jīng)系統(tǒng)Nervous system 15 0 100 200 300 數(shù)量Number霉素的生物合成、靈菌紅素和萬古霉素類抗生素的生物合成等。這些抗生素具有廣譜抗菌、抗病毒和抗癌活性的藥物。生物堿類的合成主要包括異喹啉生物堿的生物合成、茛蓉烷/哌啶/吡啶生物堿的生物合成。另外，還有芥子油苷生物合成、吩嗪合成、苯丙烷類生物合成以及其他各種次生代謝物的生物合成。由此說明，類芽孢桿菌HNYJ2209J具有開發(fā)新型藥物的潛能。

表2CAZy數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果

Table2AnnotationresultsofCAZydatabase

2.6.7耐藥基因分析使用ResFinder數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，菌株HNYJ2209J含有489個(gè)耐藥基因，這些基因與已知耐藥基因的相似性較小，均低于50% ，且未在可轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒等移動(dòng)原件上。其中四環(huán)素類抗生素耐藥基因數(shù)量較多（ 10.89% ），其次是氟喹諾酮類抗生素、青霉烷類抗生素、大環(huán)內(nèi)脂類抗生素、頭孢菌素、氯霉素類抗生素、頭霉素類、氨基糖苷類抗生素、碳青霉烯類和肽類耐藥基因，分別占 10.31%.9.05%.8.88%.6.12%.4.86% /4.44%.4.44%.4.27% 和 4.11% 。

表3菌株HNYJ2209J基因組中編碼次生代謝物的基因簇列表

Table3List of gene clusters encoding secondary metabolites inthe genome of strain HNYJ2209J

注：一表示沒有比對(duì)上。Note：- indicates no homology.

2.6.8毒力基因注釋將HNYJ2209J菌株的基因序列與VFDB數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，在菌株HNYJ2209J中共找到954個(gè)毒力基因，其中，與已知毒力基因的相似性大于 60% 的有14個(gè)（表4）。

表4HNYJ2209J菌株毒力基因預(yù)測(cè)

Table 4Virulence gene prediction of HNYJ22O9J strain

3討論

大腸桿菌是人畜共患病原菌，對(duì)人類和動(dòng)物的生命安全造成了巨大影響，尤其是攜帶NMD基因的超級(jí)耐藥大腸桿菌，使動(dòng)物臨床出現(xiàn)了無藥可用的困境[18]。因此，尋找新型抗感染藥物成為控制細(xì)菌耐藥性和超級(jí)耐藥細(xì)菌的重要手段之二[19]。抗生素的廣泛應(yīng)用和不合理使用是導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)的主要原因之一[20]。這種情況使得新型抗菌藥物的研發(fā)變得尤為緊迫。然而，新型抗菌藥物的研發(fā)難度大、周期長，且新型抗菌藥物投入臨床使用的速度遠(yuǎn)跟不上細(xì)菌耐藥的速度。因此，對(duì)于抗生素的新藥研發(fā)、發(fā)現(xiàn)和創(chuàng)新提出了緊迫的需求。近年來，一些具有抑制活性的天然產(chǎn)物和合成化合物陸續(xù)被報(bào)道。然而，這些新型藥物面臨著一些問題，如結(jié)構(gòu)類型較少、活性相對(duì)較低、成藥性較差以及作用機(jī)制研究不足等。這些問題制約了新型藥物的研發(fā)和臨床應(yīng)用。抗細(xì)菌感染的藥物主要來源于天然產(chǎn)物，其次是化學(xué)合成物。在天然產(chǎn)物中，微生物的次生代謝產(chǎn)物占據(jù)了主要地位。因此，從藥用植物內(nèi)生菌中篩選抗菌小分子越來越受到重視。這種方法有望為新型抗感染藥物開發(fā)提供新的途徑[21]。

在我國，藥用植物種類繁多，其內(nèi)生菌資源豐富[22]，這些內(nèi)生菌及其代謝產(chǎn)物的開發(fā)和應(yīng)用為開發(fā)生物活性物質(zhì)和新的藥源提供了廣闊空間[23]。通過深入研究和開發(fā)利用這一豐富的資源，有望為抗菌藥物領(lǐng)域帶來新的突破和創(chuàng)新。連翹是木犀科植物連翹的干燥果實(shí)，為臨床常用的清熱解毒類中藥。連翹味苦、性寒，可瀉火，入心肺二經(jīng)，主要含有苯乙醇苷類、木脂素類、萜類及揮發(fā)油、黃酮類等化學(xué)成分，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、疏散風(fēng)熱的功效，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌等多種藥理作用，且安全性較高，可用于治療風(fēng)熱感冒、乳癰、瘰病腫痛等疾病。劉玉珍等24從連翹枝條中分離出13株內(nèi)生菌，其中有10株內(nèi)生菌對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有較強(qiáng)的抑菌活性。楊雪25從連翹中分離篩選到1株可產(chǎn)連翹苷的內(nèi)生菌G10。翼玉良等2從連翹中篩選出抗菌活性較高的內(nèi)生真菌9株、內(nèi)生細(xì)菌7株和內(nèi)生放線菌4株。袁保紅等2從連翹中分離出1株內(nèi)生放線菌YBL-02，從其發(fā)酵產(chǎn)物中鑒定出1種酰胺類化合物。

本研究從連翹植物的根、莖、葉和花中分離出1株內(nèi)生細(xì)菌HNYJ2209J，通過16SrRNA基因測(cè)序鑒定為類芽孢桿菌。通過平板對(duì)峙法抑菌能力檢測(cè)和全基因組測(cè)序研究發(fā)現(xiàn)，HNYJ2209J對(duì)同時(shí)攜帶NMD1/NDM5和NDM4/NDM5基因的超級(jí)耐藥大腸桿菌具有較好的抑菌效果。芽孢桿菌及其代謝產(chǎn)物作為抗生素的替代品備受關(guān)注，因?yàn)樗鼈兡墚a(chǎn)生抗菌活性產(chǎn)物及其他代謝產(chǎn)物，且部分能夠在腸道中定植，分泌酶類活性成分，具有調(diào)理胃腸道和提高飼料利用率的效果，因此被用作飼料添加劑和替代抗生素的重要原料。本研究發(fā)現(xiàn)的類芽孢桿菌具有潛在的抗菌活性和益生菌功能，為開發(fā)新型抗菌藥物和飼料添加劑提供了新的可能性。

本研究通過對(duì)菌株HNYJ2209J進(jìn)行全基因組測(cè)序，并利用KEGG注釋對(duì)其代謝途徑進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了8個(gè)與次級(jí)代謝產(chǎn)物合成相關(guān)的基因簇，推測(cè)菌株HNYJ2209J具有抗菌功能。耐藥基因分析結(jié)果顯示，菌株HNYJ2209J基因組中含有489個(gè)耐藥基因，未發(fā)現(xiàn)有可移動(dòng)耐藥基因，說明其傳播耐藥基因的可能性較低。毒力基因注釋發(fā)現(xiàn)，菌株HNYJ2209J中共有954個(gè)毒力基因，且與已知毒力基因的相似性較低。由于耐藥基因和毒力基因的序列與已報(bào)道基因的序列相似性較低，因此還需要進(jìn)一步深入研究。

抗生素曾用作飼料添加劑以促進(jìn)動(dòng)物生長并提高動(dòng)物的抗病能力，但抗生素的長期應(yīng)用和濫用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)，動(dòng)物臨床出現(xiàn)多重耐藥和超級(jí)耐藥菌。我國于2020年7月全面禁止在飼料中添加抗生素，因此，尋找抗生素的替代物成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。類芽孢桿菌可分泌多種環(huán)脂肽[28-30]，具有抗菌、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等功能，且不易產(chǎn)生耐藥性，在飼料添加劑領(lǐng)域有巨大應(yīng)用潛力[31-32]。研究表明，添加環(huán)脂肽能降低斷奶仔豬的腹瀉率，改善生長性能，抑制腸道有害微生物生長等[33]；飼料中添加 50mg?kg^-1 環(huán)脂肽能促進(jìn)羅非魚生長，提高羅非魚腸道脂肪酶活性[34]。因此，環(huán)脂肽對(duì)動(dòng)物生長和代謝等具有促進(jìn)作用，可作為飼料添加劑或替代抗生素，具有廣闊的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)

[1]CHENG Z，AITHA M， THOMAS C A，et al. Machine learning modelsidentify inhibitors of New Delhi metallobeta-lactamase [J]. J. Chem.Inf.Model.，2024，64（10）： 3977-3991.

[2]KWANKAEW P， SANGKANU S，MITSUWAN W，et al.. Inhibitory and anti-adherent effects of Piper betleL.leaf extractagainst Acanthamoeba triangularis in co-infectionwith Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa：a sustainable one-health approach [J].Vet.World.，2024，17（4）： 848-862.

[3］王曉晴，劉博，王子墨，等.曼陀羅內(nèi)生真菌Fusarium solani MBM-5活性次級(jí)代謝產(chǎn)物研究[J].中國中藥雜志，2024， 49（10）：2722-2727.

[4]BARRETO RAMOS D G，GURGEL AMARAL AG，DUARTE IG，etal..Endophytic speciesofColletotrichum associated withcashewtreeinnortheasternBrazil[J].Fungal.Biol.，2024， 128（3）：1780-1789.

[5]WANGWH，LICR，QINXJ，et al..Novel Alkaloids from Aspergillus fumigatusVDL36，anendophytic fungusassociated with Vaccinium dunalianum [J].J.Agric.Food. Chem.，2024， 72（19）：10970-10980.

[6]TRAPP MA， KAI M， MITHOFER A. RODRIGUES-FILHO E. Antibiotic oxylipins from Alternanthera brasiliana and its endophyticbacteria[J].Phytochemistry，2015，110：72-82.

[7]LIUHX，LIU Z M，ZHANG YJ，et al..Antioxidant arylsubstituted phthalan derivativesproduced by endophytic fungusCytosporarhizophorae[J/OL].Front.Chem.，2022，10： 826615[2024-05-10].https：//doi.org/10.3389/fchem.2022.826615.

[8]YIN G P，GONG M，XUEG M，et al..Penispidins A-C， Aromatic sesquiterpenoids from Penicillium virgatumand their inhibitory effectson hepatic lipid accumulation[J].J.Nat. Prod.，2021，84（10）：2623-2629.

[9]GUO Z，CHEN B，CHEN D，et al.. New Isocoumarin and pyrone derivatives from the Chinese mngrove plant Rhizophora mangle-associated fungusPhomopsissp. DHS-11[J]. Molecules，2023，28（9）：125-135.

[10]GUPTA A，MESHRAM V，GUPTA M，et al..Fungal endophytes：microfactories of novel bioactive compoundswith therapeutic interventions；a comprehensive review on the biotechnological developmentsinthe fieldof fungal endophytic biology over the last decade [J].Biomolecules，2023，13（7）： 213-223

[11]KANTARI SAK，BISWAL RP，KUMARP，etal.. Antioxidant and antidiabetic activities，and UHPLC-ESIQTOF-MS-based metabolite profiling of an endophytic fungus Nigrospora sphaerica BRN O1 isolated from Bauhinia purpurea L.[J].Appl. Biochem.Biotechnol.，2023，195（12）：7465-7482.

[12]CASTILLO U F，STROBEL G A，F(xiàn)ORD E J，et al.. Munumbicins，wide-spectrum antibioticsproduced by StreptomycesNRRL 30562，endophytic on Kennedia nigriscans [J].Microbiology，2002，148（9）：2675-685.

[13]HUA H， ZHANG X， YAO Y， et al. Complete genome sequence of anovel mitovirus identified in the phytopathogenic fungus Fusarium oxysporumF.sp.melonisstrain T-SD3[J/OL].Arch. Virol.，2024，169（6）：126 [2024-05-10].htps：//doi.org/10.1007/ s00705-024-06042-2.

[14]LI H， GAO S， SHI S， et al.. Rational construction of genomeminimized Streptomyces host for the expression of secondary metabolite gene clusters [J].Synth.Syst.Biotechnol.，2024， 9（3）：600-608.

[15]WEN Y，LV Y，HAO J，et al. Two new compounds of Penicillium polonicum， an endophyticfungusfrom Camptotheca acuminata Decne [J]. Nat. Prod. Res.，2020， 34（13）：1879-1883.

[16]李海利，郎利敏，張青嫻，等.同時(shí)產(chǎn)碳青霉烯酶NDM5和 NDM的大腸埃希氏菌的鑒定及耐藥性研究[J].生物技術(shù)通 報(bào)，2022，28（9）：106-115. LIHL，LANGLM，ZHANGQX，etal..Identificationand drug resistance of Escherichia coli simultaneously producing carbapenemase NDM-1 and NDM-5[J]. Biotechnol. Bull.， 2022，28（9）：106-115.

[17］李海利，張青嫻，朱文豪，等。攜帶新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶的 豬源大腸桿菌全基因組測(cè)序分析及敏感植物提取物藥物篩 選研究[J].中國獸藥雜志，2023，57（6）：23-33. LI H L， ZHANG Q X， ZHU WH，et al..Whole genome sequencing analysis of Escherichia coli from pigs carryingdelhi metal β -lactamase and drug screening of sensitive plant extracts [J]. Chin.J.Vet.Drug，2023，57（6）：23-33.

[18]AL-BAYSSARIC，NAWFALDAGHERT，HAMOUISEL， et al.. Carbapenem and colistin-resistant bacteria in North Lebanon： coexistenceof mcr-1 and NDM-4 genesin Escherichia coli [J].J. Infect.Dev. Countries，2021，15（7）：934-342.

[19]MEHAFFEY MR，AHN YC，RIVERAD D，et al.. Elusive structural changes ofNew Delhi metallo-beta-lactamase revealed by ultraviolet photodissociation mass spectrometry [J]. Chem. Sci.，2020，11（33）：8999-9010.

[20]RAHMAN M， SHUKLA S K，PRASAD K N， et al..Prevalence and molecular characterisation of New Delhi metallo-betalactamases NDM-1，NDM-5，NDM-6andNDM-7 inmultidrugresistant Enterobacteriaceae from India [J]. Int.J.Antimicrob. Agents.，2014，44（1）：30-37.

[21]ZHANG Y，ZHANG Q，LI C，et al.. Advances in cell membrane-based biomimetic nanodelivery systems for natural 10].https：//doi.org/10.1080/10717544.2024.23611696.

[22]MAMANGKEY J， MENDES L W，MUSTOPA A Z，et al.. Endophytic Aspergilli and Penicillii from medicinal plants：a focus on antimicrobial and multidrug resistant pathogens inhibitoryactivity[J].Biol. Technol.，2024，105（1）：83-95.

[23]MARYAM H，F(xiàn)AZEL P，MOSTAFA N.ISolation and screening of antibacterial activity of Actinomycetota from the medicinal plant，Anthemis pseudocotula Boiss [J].Archives Razi Institute， 2023，78（5）：1638-1646.

[24］劉玉珍，高飛，馬雪燕，等.連翹中具有藥物活性成分內(nèi)生菌 的篩選及其拮抗特性的研究[J].延安大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué) 版），2024，4（33）：84-88. LIU Y Z， GAO F， MAX Y， et al..Screening of drug active products endophytic from Fructus Forsythiae and study on theirantagonism[J].J.Yanan Univ.（Nat. Sci.），2O24，4（33）： 84-88.

[25]楊雪.高產(chǎn)連翹苷內(nèi)生真菌Colletotriclum gloeosporioides的 誘變選育[D].西安：陜西師范大學(xué)，2014. YANG X.Mutagenesisand breeding of endophytic fungus Colletotriclum gloeosporioideswith high yield of forsythin [D]. Xi'an： Shaanxi NormalUniversity014.

[26］翼玉良，李丹青，李堆淑，等.連翹內(nèi)生菌的分離及對(duì)植物病 原菌的抑菌活性測(cè)定[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，246：2258- 2262. YIYL，LIDQ，LIDS， etal. Isolationof endophyte fromFructus forsythiaeand determination of itsinhibitionactivities to plant pathogens [J]. Southwest Agric.J.，2011，24（6）：2258-2262

[27]袁保紅，杜青平，胡立勇.小連翹內(nèi)生放線菌YBL-02菌株的 初步鑒定和發(fā)酵產(chǎn)物分離[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2009， 5（26）：360-363. YUANBH，DU Q P，HU L Y.Taxonomy，fermentation and products characterization of actinomycete strain YBL-02 from Hyperioums sampsonii Hance [J].Chin. J. Modern Appl. Pharmacy，2009，5（26）：360-363.

[28]NADEEM H，NIAZI P，ASIF M，et al. Bacterial strains integrated with surfactin molecules of Bacillus subtilis MTCC441 enrich nematocidal activity against Meloidogyne incognita [J].Plant Biol.，2021，23（6）：1027-1036.

[29]KIM Y T，KIM SE，LEE W J，et al. Isolation and characterizationof a high iturin yielding Bacillusvelezensis UV mutant with improved antifungal activity [J/OL].PLoS One， 2020，15（12）：e02341772024-05-10]. htps：//oi.org/10.1371/ journal.pone.0234177.

[30]FANAEI M，JURCICK，EMTIAZI G.Detectionof simultaneous production of kurstakin，fengycin and surfactin lipopeptides in Bacillus mojavensis using a novel gel-based method and MALDI-TOF spectrometry[J].World J. Microbiol. Biotechnol.，2021，37（6）：97-107.

[31]SHARMA D， SINGH S S， BAINDARAP， et al.. Surfactin like broad spectrum antimicrobial lipopeptide co-produced with sublancin from Bacillus subtilis strain A52： dual reservoir of bioactives [J].Front.Microbiol.，2020，11：1167-1177.

[32]GAN P， JIND，ZHAO X，et al. Bacillus-produced surfactin attenuates chronic inflammation in atherosclerotic lesions of

ApoE（-/-） mice[J].Int.Immunopharmacol.，2016，35：226-234.[33]都海明，戚廣州，王建軍，等.抗菌脂肽對(duì)斷奶仔豬生長性能、腸道微生物及血液指標(biāo)的影響研究[J].中國糧油學(xué)報(bào)，2011，26（5）：76-82.DUHM，QIGZ，WANGJJ，etal..Effectsofantimicrobiallipopeptides on performance，intestinal microflora and bloodbiochemical parameters in weaned pigs [J].J.Chin. CerealsOils Assoc.，2011，26（5）：76-82.

[34]翟少偉，李劍，孫秀文.飼料中添加表面活性素對(duì)吉富羅非魚 生長性能、血清生化指標(biāo)及脂肪代謝的影響[J].動(dòng)物營養(yǎng) 學(xué)報(bào)，2015，27（12）：3959-3967. ZHAISW，LIJ，SUN XW.Effects of surfactin supplementation on growth performance，serum biochemical indexesandlipid metabolismof geneticallyimproved farmed tilapia（Oreochromisniloticus）[J].Chin.J.Anim.Nutr.，2015， 27（12）：3959-3967.