菌種選育技術在藥用真菌中的應用與展望

中圖分類號：S646.15 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2025.13.036

自然界存在豐富的藥用真菌資源，我國早在東漢的《神農本草經》中就記錄了茯苓、紫芝、木耳、僵蠶等10余種藥用真菌及其功效I。隨著分子測序技術的發展和真菌種質資源工作的深入，目前我國發現的藥用真菌已達到692種[2。現代藥理學研究表明，藥用真菌生長發育過程中會產生多糖、黑色素、萜類化合物、多酚、黃酮類等多種活性物質，具有抗氧化、抗腫瘤、增強機體免疫力、降血糖、抗炎等藥用功能[3-5]。隨著藥用真菌的藥效活性被不斷發現，藥用真菌廣泛應用于醫療保健、食品、動物飼料、農業等領域。

藥用真菌野生資源有限，傳統的人工栽培生產子實體對木材等基質資源消耗量大，并且生長過程易受氣候、病蟲害等外在環境影響，面臨嚴重的品種退化問題，制約產業化發展，難以滿足市場需求。深層發酵技術具有生長周期短、產量高、品質穩定、易操作、對設備要求低等優點，已廣泛應用于靈芝、猴頭菇、豬苓、桑黃等多種藥用真菌生產，成為工業化獲取藥用真菌菌絲體及其有效成分的有力途徑[6-9]。

目前，藥用真菌發酵工業所用的菌株大多來源于栽培菌株，存在遺傳背景單一、產品同質化程度高等問題，導致工業化生產極不穩定。因此，培育高產優質的藥用真菌品種、開發高價值產品是藥用真菌產業亟待解決的問題。筆者將總結誘變育種、基因重組育種、基因工程育種等菌種選育技術在藥用真菌中的應用，為藥用真菌發酵工業的進一步開發提供理論依據。

1誘變育種

誘變育種是現階段最重要、運用最廣泛的菌種選育方法。藥用真菌的誘變主要通過物理、化學等方式處理，具有突變頻率高、變異范圍廣等優勢。誘變材料可采用藥用真菌的菌絲體、原生質體、孢子懸浮液等。此外，不同誘變方式與輻射劑量處理獲得的目的菌株的誘變性能不同。

1.1物理誘變

1.1.1紫外線誘變技術

紫外線誘變是菌株改良的有效物理方法之一。Aina等分別以30、60、 90min 的時間間隔對野生型裂褶菌孢子進行紫外線照射，繼代培養后經發酵罐發酵獲得菌絲體和胞外多糖（ExtracellularPolysaccharide，EPS）。結果表明，生物體暴露在紫外線下的時間越長，菌絲體生物量和EPS產量就越高，照射 60min 的裂褶菌突變體具有最高的菌絲產量和EPS。此外，紫外線誘變能增強菌絲體提取物的活性[0]。Bamigboye等使用紫外線照射虎奶菇菌絲體獲得高產突變菌株，與野生虎奶菇相比，突變體經搖瓶發酵獲得的胞內多糖（IntracellularPolysaccharide，IPS）和EPS具有更高的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （1，1-Diphenyl-2-Picrylhydrazyl，DPPH）自由基和羥自由基清除活性[1]。

1.1.2電離輻射誘變技術

人們常用 γ 射線處理藥用真菌獲得生理活性物質含量提升的突變株，如KIM等采用 γ 射線輻射處理杏鮑菇的原生質體，獲得纖維素酶含量更高的突變菌株[12]。 γ 射線照射還能提高菌絲體對硒的富集能力，如楊夢蓮利用 ⁶⁰Co-γ 射線誘變育種的方法篩選出耐高硒的靈芝突變體[13]。

1.1.3脈沖強光誘變技術

脈沖強光（IntensePulsedLight，IPL）是一種新興的非熱技術。有研究表明，經IPL誘變篩選出的突變株發酵菌絲體中多糖、多酚、黃酮類化合物和三萜類化合物等產量均優于親本菌株[4]。

1.1.4航天育種

航天育種具有突變率高、周期短、突變譜廣、安全性高等優勢。Zhao等使用宇宙輻射誘變法成功分離出一種新的灰樹花突變體M270，用于高產EPS；對M270進行20余代測定，考察突變體M270的遺傳穩定性，結果顯示各代間產生的EPS差異不顯著，表明突變體M270的遺傳較穩定[15]。

1.1.5常壓室溫等離子體誘變

常壓室溫等離子體（AtmosphericandRoomTemperaturePlasma，ARTP）誘變是一種新穎有效的物理誘變技術，目前已在藥用真菌誘變育種中廣泛應用。例如，Gong等利用ARTP誘變技術獲得的猴頭菇突變菌株HEB和HEC的發酵菌絲體多糖含量較出發菌株分別提高 23.25% 和 47.45%^[16] 。此外，ARTP誘變技術可結合其他誘變技術獲得目標突變株，解除單一誘變劑產生的誘變飽和效應，提高育種效率。例如，李亞潔等結合 ⁶⁰Co-γ 射線與ARTP誘變技術選育出高產和性狀遺傳穩定的蛹蟲草突變菌株[17]。

1.2化學誘變

化學誘變是指借助化學誘變劑，如烷化劑、堿基類似物、金屬鹽、移碼突變劑等，對菌種進行誘變選育。KIM等用 0.2% 甲基磺酸甲酯（一種烷基化劑）處理繡球菌的均質菌絲碎片，成功篩選出2種高產β-葡聚糖的突變菌株（B4和S7），證實了單一誘變劑對藥用真菌菌種選育的有效性[18]。此外，多種誘變劑的組合使用具有可行性。例如，化學誘變劑氯化鋰或氯化鋰與 TritonX^-100 的組合使用已被用于處理靈芝的原生質體，以增強多糖和三萜類化合物的產生[9]。化學誘變劑吖啶橙（AcridineOrange，AO）還可與紫外線聯合處理香菇菌株以獲得具有更高EPS產量、強效抗菌和抗氧化活性的突變體[20]。但大部分化學誘變劑屬于高毒性或致癌物質，使得化學誘變技術在藥用真菌中的應用受限。

2 基因重組育種

2.1雜交育種

雜交育種主要適用于異宗配合的品種，具有一定的方向性，對于野生種質資源的利用具有重要意義，已成為一種常用的技術手段。研究發現，將2種蛹蟲草菌株ZGCM和CM17進行雜交可以獲得高產類胡蘿卜素和蟲草素且穩定遺傳的優質菌株，為蛹蟲草相關產品的開發提供了優良的種質資源[2I]。此外，李娜等利用原生質體單核化技術獲得雜交菌株GZ02，結果表明，與親本相比，雜交菌株發酵菌絲體的胞內多糖含量和得率分別提高 5.47% 和 1.34%^[22] 。目前，大多文獻主要集中研究雜交育種對發酵菌絲體生長速度、生物量及活性物質產量的影響，而較少探究親本與雜交菌株的發酵產物在結構和生物活性之間的差異。段語嫣利用原生質體單核化技術獲得雜交菌株GZ36，探究其發酵菌絲體的胞外多糖含量、重均分子量分布特征、單糖組成特征和免疫活性與親本之間的差異，結果表明，雜交菌株的胞外多糖含量明顯高于2個親本，且單糖組成和比例與親本菌株G0154更接近，與親本菌株相比，雜交菌株胞外多糖的活性更強[23]。

2.2 原生質體融合技術

原生質體融合技術是改進微生物菌株代謝物譜和生物量產量的有效手段。此外，該技術可以克服遠緣菌株雜交的限制，對于珍稀野生藥用真菌馴化、藥用真菌菌種改良及新品種選育具有重要意義。育種步驟一般包括原生質體制備和再生、親本原生質體融合、融合子篩選、融合子鑒定等。有研究發現，擔子菌的細胞壁成分主要為葡聚糖和幾丁質，采用組合酶制備原生質體的酶解效果較好[24]。

藥用菌原生質體的融合主要通過聚乙二醇（PolyethyleneGlycol，PEG）、電場或電脈沖誘導，其中最常用的是PEG（含 Ca²⁺ ）。有研究表明，PEG濃度對原生質體融合具有重要影響。例如，魏荷芬等探究桃紅側耳原生質體的制備條件，發現經 250g?L^-1 PEG處理可得到高產蛋白質的優良融合菌株[25。然而，PEG具有一定毒性，對轉化效率和融合子再生具有負面影響。采用物理方法誘導原生質體融合也是一種常見的育種技術。例如，高明俠等使用電脈沖誘導紫芝和赤芝原生質體，融合率可達 0.038% ，發酵結果表明，與親本菌株相比，融合株的生物量與多糖含量顯著提高，且遺傳穩定性好[26]。

3 現代育種技術

3.1 遺傳轉化技術

由于不同菌株的細胞壁成分差異較大，各菌種適用的遺傳轉化體系不盡相同。常用的遺傳轉化技術有農桿菌介導轉化法（Agrobacterium-MediatedTransformation，ATMT）、原生質體介導轉化法（Protoplast-MediatedTransformation，PMT）、脂質體介導轉化法（Liposome-Mediated Transformation，LMT）和電穿孔轉化法（Electroporation，EP），其中ATMT技術的應用較廣，已用于多種藥用真菌遺傳轉化體系的構建[27]。例如，Chen等首次使用ATMT技術實現雙孢蘑菇的遺傳轉化[28]，隨后豬苓[29]、蟬花[30]等藥用真菌的遺傳轉化體系也相繼建立。ATMT技術還可與自的基因過表達相結合，用于研究與藥用真菌功能活性成分代謝相關的基因。例如，Chen等研究發現，在蛹蟲草中過表達EgtD、CmEIB和CmEgt2能明顯提高麥角硫因的產量，由此構建一條麥角硫因合成途徑，并通過ATMT技術將該途徑引入蛹蟲草基因組，成功提高發酵液和菌絲體中麥角硫因和蟲草素的產量，推動了蛹蟲草在藥理學功能研究中的發展[31]。

3.2CRISPR/Cas9基因編輯育種技術

成簇的規則間隔短回文重復序列/CRISPR相關蛋白9（Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats/CRISPR-associated protein 9， CRISPR/Cas9）系統是第三代基因組編輯技術，具有操作簡單、精度高、成本低等優點。近年來，該技術被用于雙孢蘑菇、靈芝、蛹蟲草等藥用真菌的基因編輯，為藥用真菌次生代謝產物的高效合成提供可行的途徑。例如，Qin等在靈芝上成功建立CRISPR/Cas9介導的基因編輯系統[32l，Wang等利用該基因編輯系統對細胞色素P450單加氧酶（CYP450）基因cyp5150l8進行編輯，進而調控突變體的發酵產物，為靈芝和其他擔子菌類蘑菇的進一步基因編輯和代謝工程提供了研究方向[33]。

4結論與展望

近年來，全球對藥用真菌的需求不斷增長，提高真菌發酵產物及其活性物質產量成為研究熱點。培育高產藥用真菌品種的方法主要分為誘變育種、基因重組育種和現代分子育種，通常根據藥用菌的種類、目標產物、遺傳背景及經濟價值等方面選擇合適的育種技術。然而，誘變育種與基因重組育種周期長且可預測性低，已無法滿足發酵工業中的高產和高品質要求。

遺傳轉化和CRISPR/Cas9基因編輯等現代分子生物學技術有助于藥用真菌發酵產業的發展，加速藥用真菌活性物質的開發利用。但是，大多數藥用真菌并非傳統意義上的模式菌株，且遺傳背景復雜，遺傳操作方法尚不成熟，仍存在一些亟待解決的問題。例如，遺傳背景復雜的藥用真菌難以建立遺傳轉化體系，制約基因工程育種的應用，后續需要利用測序技術對藥用真菌的遺傳背景進行分析。大多藥用真菌在發酵過程中活性物質的合成途徑與調控元件尚不清楚，缺乏系統研究與鑒定，嚴重阻礙現代分子生物學技術對發酵產物的調控，后續需要加強標準化、通用化、精準化的合成途徑與合成基因鑒定平臺及生物信息學分析平臺建設，不斷發掘各種活性物質的合成途徑，明確具體的調控基因，以便實現藥用真菌的定向改造。CRISPR/Cas9基因編輯系統面臨編輯效率低、脫靶效應嚴重等難題，后續可以通過優化目標菌株的密碼子、選擇合適的啟動子表達Cas9基因來提高編輯效率；還可通過改造系統元件，增加CRISPR系統基因編輯的特異性來減少脫靶效應。

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（責任編輯：劉寧寧）