解淀粉芽孢桿菌Y6-7的篩選鑒定及對(duì)草莓角斑病的生防效果

關(guān)鍵詞：解淀粉芽孢桿菌；草莓細(xì)菌性角斑病；防效；生物防治；穩(wěn)定性中圖分類號(hào)： S436.68⁺4 ;S182 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2025）13-0171-09

草莓角斑病（angularleafspotofstrawberry，簡(jiǎn)稱ALS）是由草莓黃單胞菌（Xanthomonasfragariae）引起的細(xì)菌性病害，該病害可導(dǎo)致果實(shí)產(chǎn)量的嚴(yán)重降低以及移植苗圃生產(chǎn)中的植物損失。該病原體首次在1962年美國(guó)明尼蘇達(dá)州被報(bào)道，后來(lái)又在美國(guó)各州以及歐洲、南美洲、非洲的草莓種植區(qū)，澳大利亞和新西蘭幾個(gè)地方發(fā)生，被歐洲和地中海植物保護(hù)組織（EPPO）列為歐洲種植種群的A2國(guó)際檢疫病原體[1]。病原體直接導(dǎo)致葉片背面產(chǎn)生角狀水浸狀的病變，在葉片邊緣產(chǎn)生棕黑色的斑點(diǎn)。發(fā)病嚴(yán)重時(shí)從葉子蔓延到莖冠，并導(dǎo)致離散的水漬病斑，從而導(dǎo)致草莓植株活力下降、倒伏和整株死亡[2]，在草莓農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中日益成為一個(gè)難題。近年來(lái)，草莓角斑病在我國(guó)不同地區(qū)草莓種植基地發(fā)生，于2021年在云南省首次發(fā)現(xiàn)，并在曲靖市會(huì)澤縣四季草莓基地暴發(fā)成災(zāi)，給當(dāng)?shù)夭葺N植者造成重大經(jīng)濟(jì)損失。目前控制細(xì)菌性病害主要依賴于預(yù)防性應(yīng)用含銅化合物或抗生素。銅化合物和抗生素硫酸鏈霉素和土霉素可以降低疾病的嚴(yán)重性，但并不是所有國(guó)家都登記使用銅化合物和抗生素來(lái)治療，而且銅化合物的藥效有限，重復(fù)使用可能會(huì)引起植物毒性。因此，更多的防治策略，特別是控制 X. ，fragariae的無(wú)毒手段將是可取的[2-3]。因此，篩選出對(duì) X ：fragariae有拮抗效果的菌株，對(duì)開發(fā)無(wú)毒微生物菌劑有一定的價(jià)值。

當(dāng)前已經(jīng)報(bào)道的防治草莓細(xì)菌性角斑病的生防菌株較少，如Miller等首次從自然感染黃單胞菌的\"Festival”草莓植株上分離到黃單胞菌噬菌體RiverRider，能感染7種不同的 X. fragariae菌株，從而殺死 X ：fragariae以達(dá)到防治的目的4；Daranas等通過(guò)溫室與大田試驗(yàn)驗(yàn)證篩選出幾株有廣譜抗菌活性并對(duì) X. ：fragariae有較好拮抗作用的乳桿菌（PM411和TC92）[5]。但目前芽孢桿菌屬細(xì)菌防治X.fragariae幾乎未見報(bào)道，因此本研究中，筆者所在課題組對(duì)采集的健康草莓根際土壤樣品進(jìn)行細(xì)菌分離，通過(guò)平板對(duì)峙室內(nèi)篩選對(duì) X. fragariae有顯著拮抗效果的生防細(xì)菌菌株，經(jīng)生理生化和16SrDNA序列分析等鑒定該菌為解淀粉芽孢桿菌，并探究該菌株的溫室防效和防病機(jī)制，為開發(fā)防治 X. fragariae的微生物菌劑提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1 供試材料

供試病原菌有草莓角斑病菌（X.fragariae）YM2、柑橘潰瘍病菌（X.citrisubsp.citri）、水稻條斑病菌（ X. oryzaepv.oryzicola）、油菜黑腐病菌（ X. （20campestrispv.campestris）、水稻白葉枯病菌（ X. oryzaepv.oryzae）、大豆細(xì)菌性斑疹病菌（ X. （204campestrispv.glycines）、水稻紋枯病菌（Rhizoctoniasolani）草莓炭疽病菌（Colletotrichumsiamense）、藍(lán)莓枝枯病菌（Lasiodiplodiapseudotheobromae）、煙草根腐病菌（Fusariumoxysporum）、煙草疫霉病菌（Phytophthoranicotianae）、藍(lán)莓灰霉病菌（Botrytiscinerea）。以上菌株均來(lái)源于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。

供試培養(yǎng)基有WBN培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基，用于細(xì)菌分離純化以及抑菌譜的篩選;蛋白酶培養(yǎng)基、淀粉酶培養(yǎng)基和纖維素酶培養(yǎng)基用于菌株酶活性測(cè)定。

試驗(yàn)地點(diǎn)：云南省農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性應(yīng)用技術(shù)國(guó)家工程研究中心，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院試驗(yàn)大棚。

1.2拮抗細(xì)菌的分離與篩選

參照起登鳳等的方法[6。采集云南省曲靖市會(huì)澤縣草莓基地不同地塊健康草莓根際土壤10份，各稱取 1g 土樣加入 9mL 無(wú)菌水的三角瓶中，置于搖床振蕩 20min ，靜置形成懸液后，吸取 100μL 上層液加入到 900μL 無(wú)菌水中充分振蕩后即為 10^-2 土壤懸浮液，依次梯度稀釋得到 10^-4，10^-5，10^-6 稀釋懸液，涂布于LB、NA、WBN板， 28^°C 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) ^72h 。挑取顏色、形態(tài)及表型不同的單菌落保存于NA凍存管中，放置于 -20^°C 冰箱備用。

平板對(duì)崎法[7]：挑取病原菌YM2接入WBN液體培養(yǎng)基培養(yǎng) ^48h 后，將YM2 菌懸液稀釋到 D_600nm= 0.5后吸取 200μL 于新的WBN培養(yǎng)基中涂布均勻。將上述保存?zhèn)溆玫募?xì)菌點(diǎn)接在平板上，進(jìn)行初步篩選。將初篩有作用的細(xì)菌接于NB培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 24h ，牛津杯放置于涂布有YM2菌懸液的WBN板上，取 200μL 細(xì)菌菌懸液加入到牛津杯中，無(wú)菌水為對(duì)照，重復(fù)3次。置于 28^°C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察記錄抑菌圈直徑，挑選抑菌活性最好的菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 菌株Y6-7的鑒定

1.3.1菌株Y6-7形態(tài)觀察和生理生化測(cè)定將菌株于NA培養(yǎng)基上純化后，觀察菌落的形態(tài)特征，挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察。依據(jù)常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)中描述的生理生化測(cè)試方法，評(píng)價(jià)Y6-7菌株的耐鹽性、檸檬酸鹽利用、吲哚試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、V-P測(cè)定等生理生化特征。

1.3.2菌株Y6-7分子序列分析使用TIANamp細(xì)菌DNA分離試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司]提取分離菌株Y6-7的DNA用于種屬確認(rèn)。用細(xì)菌通用引物對(duì)27F和1492R對(duì)分離菌株的16SrDNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物條帶大小，并將產(chǎn)物送往北京擎科生物科技股份有限公司昆明分公司測(cè)序。測(cè)序后將基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，并利用 Mega 11.0 軟件采取鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4菌株Y6-7生物學(xué)測(cè)定

1.4.1菌株Y6-7生長(zhǎng)特性與環(huán)境適應(yīng)性將篩選得到的Y6-7菌株接種于LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至D_600nm=1.0 ，以 1% 接種量接種至不同設(shè)置條件新的LB液體培養(yǎng)基，保持單因素變量的條件，分別在不同 pH 值、不同溫度條件下 30‰ 進(jìn)行培養(yǎng)，每隔 ^2h 測(cè)定其在 600nm 下的吸光度。以空白LB培養(yǎng)基作為對(duì)照，各處理重復(fù)3次，觀察菌株生長(zhǎng)特性[8]

1.4.2菌株Y6-7抑菌譜測(cè)定測(cè)定菌株Y6-7對(duì)5種黃單胞菌屬植物病原細(xì)菌的抑菌直徑，各處理重復(fù)3次。用平板對(duì)峙法檢測(cè)細(xì)菌對(duì)病原真菌的抑制效果。將直徑為 5mm 的菌餅點(diǎn)接在平板中央， 28^°C 培養(yǎng)1d后，在距菌餅 2.5cm 處的兩側(cè)點(diǎn)接Y6-7拮抗菌株，以不接拮抗菌株為對(duì)照， 28^°C 培養(yǎng) 5d 。每個(gè)處理重復(fù)3次。

真菌抑菌率 Σ=Σ （對(duì)照菌落直徑－處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑 ×100% 。

1.4.3Y6-7菌株定殖情況檢測(cè)菌株Y6-7抗生素篩選：將 100μL 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的拮抗菌株Y6-7分別均勻涂布在含有頭孢噻吩（cephalothin）、四環(huán)素（tetracycline）、卡那霉素（kanamycin）、利福平（rifampicin）、慶大霉素（gentamicin）、氨芐西林霉素（ampicillin）、萬(wàn)古霉素（vancomycin）的NA抗生素板上，以上抗生素濃度選擇 培養(yǎng)箱培養(yǎng) ^48h ，觀察菌株Y6-7對(duì)抗生素的抗性情況

菌株Y6-7定殖檢測(cè)：采用抗生素抗性法檢測(cè)拮抗菌株Y6-7在草莓葉片上的定殖能力。在草莓盆栽植株葉片上噴灑拮抗菌株 Y6-7（10⁸CFU/mL） ）懸浮液，以噴灑無(wú)菌水為對(duì)照，用塑料袋覆蓋。Y6-7菌株種群水平監(jiān)測(cè)如Braun和Hildebrand所述[9]。分別于接種后 0.7、14、21、28d 取樣，每個(gè)重復(fù)取3張葉片。表面消毒后研磨稀釋涂布于含有氨芐西林霉素 （ 25μg/mL ）的NA平板上，待菌落長(zhǎng)出。Y6-7的群體水平以 表示。

1.4.4產(chǎn)酶類型檢測(cè)蛋白酶檢測(cè)：挑取NA培養(yǎng)基上的單菌落Y6-7點(diǎn)接在蛋白酶鑒定培養(yǎng)基上，30% 恒溫培養(yǎng) ^48h ，每個(gè)處理重復(fù)3次，檢查透明圈的有無(wú)。

纖維素酶檢測(cè)：生防菌Y6-7單菌落點(diǎn)接到纖維素酶鑒定培養(yǎng)基上， 30^qC 恒溫培養(yǎng) ^48h ，使用碘液染色 3min ，水洗3次，每個(gè)處理重復(fù)3次，查看是否產(chǎn)生水解圈。

淀粉酶檢測(cè)：挑取活化后的生防菌Y6-7單菌落到淀粉酶檢測(cè)培養(yǎng)基上，每個(gè)處理重復(fù)3次，30% 恒溫培養(yǎng) ^48h ，檢查透明圈的有無(wú)。

1.4.5Y6-7無(wú)菌發(fā)酵液穩(wěn)定性測(cè)定Y6-7菌株接種于NB 液體培養(yǎng)基， 30‰ 過(guò)夜培養(yǎng)，以 1% 接種量接種至每瓶 500mL 的NB培養(yǎng)基，30‰ 培養(yǎng) 48h 用于活性物質(zhì)分析試驗(yàn)。

熱穩(wěn)定性檢測(cè)：取發(fā)酵液于 4‰ 條件下冷凍離心 15min ，收集上清液，經(jīng) 0.22μm 微孔濾膜過(guò)濾。取無(wú)菌發(fā)酵液 10mL 于試管中熱處理 30min ，溫度條件設(shè)置為 40，6080100120% ，以未處理發(fā)酵液為對(duì)照，處理后的無(wú)菌上清液采用平板對(duì)峙法測(cè)定對(duì)病原菌YM2的抑菌活性。

酸堿穩(wěn)定性測(cè)定：Y6-7無(wú)菌發(fā)酵液初始pH值為5.5，取等體積的無(wú)菌發(fā)酵液調(diào)節(jié)溶液 pH 值，pH 值設(shè)置為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 、10.0，靜置處理 ^2h 后，采用平板對(duì)崎法測(cè)定不同酸堿度處理的上清液對(duì)YM2的抑菌活性。

紫外線穩(wěn)定性測(cè)定：將無(wú)菌發(fā)酵液 10mL 置于紫外燈相距 30cm 處，經(jīng) 10，20，30，40，50，60min 照射處理，以未處理發(fā)酵液為對(duì)照，采用平板對(duì)崎法測(cè)定紫外線照射不同時(shí)間后上清液對(duì)YM2的抑菌活性。

蛋白酶敏感性測(cè)定：取等體積無(wú)菌發(fā)酵液分別加入蛋白酶K、溶菌酶、酸性蛋白酶，酶最終質(zhì)量濃度為 10mg/mL，37^°C 溫浴1h，以YM2為指示菌，以未處理發(fā)酵液為對(duì)照，采用平板對(duì)峙法測(cè)定不同處理的上清液對(duì)YM2的抑菌活性，測(cè)定抑菌圈直徑，各處理重復(fù)3次[0]

1.5菌株Y6-7無(wú)菌發(fā)酵液活性物質(zhì)分離與活性檢測(cè)

參照\(chéng)"1.4.5”節(jié)的方法制備Y6-7菌株發(fā)酵液，低溫離心后每瓶收集 500mL 上清液備用。

酸沉淀法： 500mL 上清液加入6mol/LHCl，調(diào)節(jié) pH 值至2.0，振蕩混勻并于 4°C 靜置過(guò)夜， 4% 、12000r/min 離心 10min 收集沉淀，自然風(fēng)干，加入適量分析純甲醇抽提沉淀，總抽提液用濾紙過(guò)濾雜質(zhì)，加入 2mol/LNaOH 調(diào)節(jié)pH值至7.0，蒸發(fā)濃縮后加入甲醇溶解，冷凍干燥得到脂肽類粗提物。溶于磷酸緩沖液，微生物膜過(guò)濾后進(jìn)行抑菌試驗(yàn)（磷酸緩沖液作為對(duì)照）。

硫酸銨沉淀法：上清液加人分析純硫酸銨達(dá)30% 的溶解度， 4‰ 靜置沉淀，低溫下 12 000r/min 離心 10min ，收集沉淀后風(fēng)干，分析純甲醇充分溶解沉淀，濾紙過(guò)濾后旋蒸，濃縮后甲醇溶解，得到抑菌蛋白類粗提物（甲醇溶液作為對(duì)照）。

乙酸乙酯萃取法： 500mL 的上清液與分析純乙酸乙酯等體積裝入分液漏斗，振蕩混勻后靜置分層，收集上層有機(jī)相，將水相用等體積的乙酸乙酯萃取至無(wú)色，合并有機(jī)相萃取液后加入約 20g 無(wú)水硫酸鈉，過(guò)濾后得到去除水分的有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸濃縮得到粗提物。粗提物加入甲醇溶解后使用 0.22μm 無(wú)菌濾膜過(guò)濾后進(jìn)行抑菌試驗(yàn)（甲醇溶液作為對(duì)照）。

大孔樹脂吸附法： 500mL 上清液中加入大孔樹脂顆粒 20g ，恒溫振蕩吸附 24h 后，用 ddH₂0 清洗樹脂顆粒2遍，過(guò)4層紗布并自然風(fēng)干樹脂顆粒，然后加入 50mL 甲醇，于恒溫振蕩器中解吸附 濾出甲醇，再次用 50mL 甲醇重復(fù)解吸附2次，合并解吸附后的甲醇溶液進(jìn)行旋蒸濃縮，甲醇溶解后使用0.22μm 無(wú)菌濾膜過(guò)濾后進(jìn)行抑菌試驗(yàn)（甲醇溶液作為對(duì)照）。

1.6生防菌Y6-7產(chǎn)脂肽類和聚酮類化合物基因 檢測(cè)

以菌株Y6-7DNA為模板，對(duì)fenA、bmyA、bacA、dhbA、srfAA、beaS、dfnA、ituC8脂肽類和聚酮類合成相關(guān)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)菌株Y6-7產(chǎn)生脂肽類抗生素和聚酮類抗生素的能力，PCR檢測(cè)程序和體系參照桑建偉等文獻(xiàn)所述[1]

1.7菌株Y6-7室內(nèi)盆栽防治效果

2022年9月，于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植保學(xué)院試驗(yàn)大棚進(jìn)行溫室試驗(yàn)。將純化后的拮抗菌株Y6-7和靶標(biāo)菌YM2單菌落轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中，將菌懸液濃度調(diào)至 10⁸ CFU/mL備用。使用手動(dòng)噴霧器將拮抗細(xì)菌菌懸液噴灑至徑流，噴灑3次，將盆栽草莓放置于溫室塑料大棚以達(dá)到高溫高濕條件。接種完拮抗細(xì)菌 24h 后，病原細(xì)菌的水懸浮液均勻噴灑在草莓嫩葉背面直到徑流，屏蔽其他植物組織。每個(gè)處理接種5株，重復(fù)3次，以 70% 丙森鋅可濕性粉劑（WP）為藥劑對(duì)照，清水對(duì)照只接病原細(xì)菌不接拮抗細(xì)菌。清水對(duì)照充分發(fā)病后計(jì)算病情指數(shù)與防治效果。草莓細(xì)菌性角斑病：按角斑病斑所占葉片面積進(jìn)行分級(jí)（表1）。

病情指數(shù) τ=100×Σ （各級(jí)病葉數(shù) × 各級(jí)代表值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù) × 最高級(jí)代表值）；防效效果 Σ=Σ （對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù) × 100% 。

表1草莓細(xì)菌性角斑病分類標(biāo)準(zhǔn)

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用IBMSPSSStatistics27對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，利用Prism1進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1草莓角斑病菌拮抗細(xì)菌篩選

采用稀釋涂布平板法從種植草莓的根際土壤中進(jìn)行細(xì)菌分離，獲得96株細(xì)菌。采用平板對(duì)峙和牛津杯法經(jīng)初篩、復(fù)篩，獲得4株對(duì)草莓角斑病菌YM2有較強(qiáng)拮抗作用的菌株（圖1），其中生防菌株Y6-7抑菌圈為（ 30.40±0.30 ） mm ，抑菌效果最好，用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1生防菌對(duì)草莓角斑病菌YM2的拮抗作用

2.2 菌株Y6-7的鑒定

2.2.1菌株的形態(tài)學(xué)鑒定拮抗菌株Y6-7在NA培養(yǎng)基上 37^°C 培養(yǎng) ^48h 后菌落形態(tài)生長(zhǎng)良好，單菌落呈乳白色、邊緣不規(guī)則且有褶皺，不透明，菌落黏稠（圖2-a）；在光學(xué)顯微鏡下觀察菌株呈桿狀，革蘭氏染色為陽(yáng)性（圖2-b）。

圖2菌株Y6-7在NA培養(yǎng)基上的菌形態(tài)（a）和顯微鏡形態(tài)（b）

2.2.2生理生化指標(biāo)檢測(cè)根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》芽孢桿菌屬細(xì)菌生理生化特性，進(jìn)一步測(cè)定菌株Y6-7生理生化指標(biāo)，測(cè)定結(jié)果如表2所示。革蘭氏染色為陽(yáng)性，接觸酶試驗(yàn)為陽(yáng)性，V-P試驗(yàn)陽(yáng)性，硝酸鹽還原試驗(yàn)為陽(yáng)性；在NaCl濃度為1%～7% 均可生長(zhǎng)。Y6-7菌株的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)與芽孢桿菌屬的生化代謝特征部分一致。但甲基紅試驗(yàn)呈陽(yáng)性，說(shuō)明葡萄糖分解成了丙酮酸并進(jìn)一步產(chǎn)生某種有機(jī)酸。

2.2.3菌株Y6-7的分子生物學(xué)鑒定提取菌株Y6-7基因組總DNA后，以此為模板對(duì)16SrDNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，并將該菌株的基因序列進(jìn)行BLAST分析比對(duì)。分析結(jié)果如圖3所示，菌株Y6-7的16SrDNA基因片段全長(zhǎng)為 1012bp ，提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得登錄號(hào)0Q672530，發(fā)現(xiàn)與Y6-7同源性較高的菌株均屬于芽孢桿菌屬，菌株Y6-7的16SrDNA序列與解淀粉芽孢桿菌BacillusamyloliquefaciensFJWHG14聚在同一個(gè)分支，與其相似性達(dá)到 99.90% 。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測(cè)定、分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，最終將Y6-7鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

表2菌株Y6-7的生理生化特性

注： + 表示陽(yáng)性；-表示陰性。

2.3菌株Y6-7的生物學(xué)測(cè)定

2.3.1菌株Y6-7生長(zhǎng)特性和環(huán)境適應(yīng)性鹽濃度生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示，菌株Y6-7的生長(zhǎng)與鹽濃度生長(zhǎng)成負(fù)相關(guān)，菌株適合生長(zhǎng)鹽濃度為 1% ，鹽濃度達(dá) 10% 時(shí)菌株不耐受。由適生 pH 值生長(zhǎng)曲線可知，菌株在 pH 值為 5.0～8.0 條件下能正常生長(zhǎng)，且最適生長(zhǎng) ΔpH 值為6.0，強(qiáng)堿性環(huán)境 pH 值為10.0條件下菌株生長(zhǎng)受到抑制，總體適合生長(zhǎng)的環(huán)境偏酸性。溫度對(duì)生防菌影響的生長(zhǎng)曲線顯示，菌株在20% 時(shí)生長(zhǎng)緩慢，菌株在 2h 之后進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，^12h 進(jìn)入穩(wěn)定增長(zhǎng)期，且 30^qC 菌株生長(zhǎng)量最高，表明 30% 是其最適生長(zhǎng)溫度（圖4）。

2.3.2菌株Y6-7的抑菌譜測(cè)定抑菌譜測(cè)定結(jié)果表明，菌株Y6-7對(duì)黃單胞菌屬的5種常見的細(xì)菌性病害和6種真菌性病害具有不同程度的抑制作用。其中Y6-7菌株抑制水稻條斑病菌的作用最強(qiáng)，抑菌圈直徑為 22.75mm ，對(duì)其他4種細(xì)菌病原也有良好的抑制能力，抑菌圈范圍為 10.73～14.75mm （表3）。Y6-7菌株對(duì)真菌性病害也具有良好的抑制效果，對(duì)6種真菌性病害其抑菌率范圍在52.33%～72.87% ，其中對(duì)立枯絲核菌和煙草疫霉菌的抑菌率可達(dá) 70% 以上，對(duì)灰葡萄孢的抑制作用最弱，抑菌率為 52.33% （表4）。

表3菌株Y6-7對(duì)病原細(xì)菌的拮抗作用測(cè)定

注：表中數(shù)據(jù)為平均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差，同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著，下表同。

表4菌株Y6-7對(duì)病原真菌的拮抗作用測(cè)定

2.3.3 菌株Y6-7在草莓葉片上的定殖檢測(cè)通過(guò)抗生素篩選結(jié)果可知，Y6-7菌株只在有氨芐西林霉素的平板上生長(zhǎng)。采用噴霧法噴灑Y6-7（ 10⁸CFU/mL ）懸浮液于葉片上，選用終濃度為25μg/mL 的氨芐西林霉素測(cè)定菌株Y6-7在草莓葉片上的定殖能力。監(jiān)測(cè)溫室條件下菌株Y6-7在草莓葉片上的存活率。結(jié)果顯示，接種后的 7～ 14d，種群水平下降了約100倍，接種后28d菌株的存活率穩(wěn)定在 10⁵CFU/g （圖5）。

圖5解淀粉芽孢桿菌Y6-7在草莓葉片上的定殖情況

2.3.4菌株Y6-7水解酶活性檢測(cè)由圖6可知，菌株Y6-7在蛋白酶培養(yǎng)基、淀粉酶培養(yǎng)基、纖維素酶培養(yǎng)基上都能產(chǎn)生清晰的降解圈，表示菌株Y6-7能產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶及纖維素酶。

a一蛋白酶檢測(cè)；b—淀粉酶檢測(cè)；c—纖維素酶檢測(cè)

圖6菌株Y6-7產(chǎn)酶種類鑒定

2.3.5Y6-7無(wú)菌發(fā)酵液穩(wěn)定性測(cè)定菌株Y6-7發(fā)酵液最初 pH 值為5.5，調(diào)節(jié)無(wú)菌發(fā)酵液 pH 值，測(cè)定Y6-7無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)YM2的抑菌活性。由圖7-A可知， pH 值調(diào)為5.0時(shí)，抑菌活性最強(qiáng)，抑菌直徑高達(dá) 22.55mm ，但pH值為10.0時(shí)其抑菌成分開始失活；菌株在 pH 值為2.0時(shí)仍有 11.25mm 的抑菌直徑，說(shuō)明菌株抑菌活性成分耐酸不耐強(qiáng)堿。由圖7-B可知，菌株Y6-7無(wú)菌發(fā)酵液在不同溫度梯度處理下對(duì)草莓角斑病菌仍具有較強(qiáng)的拮抗作用，抑菌活性隨著溫度的升高而下降，經(jīng)過(guò) 120^°C 處理 30min 仍具有 20.00mm 的抑菌直徑，說(shuō)明發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)具有較好的熱穩(wěn)定性。由圖7-C可知，紫外線照射不同時(shí)間后，菌株的發(fā)酵液抑菌活性與未處理對(duì)照相比其分泌的拮抗成分基本穩(wěn)定。照射 10min 后抑菌直徑有所下降，但無(wú)顯著差異，表明菌株Y6-7具有較好的紫外線照射穩(wěn)定性。由圖7-D可知，無(wú)菌發(fā)酵液中加入不同的蛋白酶處理 1～2h 后，加入溶菌酶和蛋白酶K與對(duì)照相比抑菌圈直徑顯著減小，溶菌酶和蛋白酶K對(duì)菌株Y6-7發(fā)酵液有顯著的分解作用，酸性蛋白酶對(duì)拮抗菌株無(wú)菌發(fā)酵液抑菌活性影響較小，由酶影響結(jié)果來(lái)看，Y6-7所產(chǎn)抑菌物質(zhì)為肽類物質(zhì)和蛋白類的細(xì)菌素物質(zhì)。

圖7菌株Y6-7無(wú)菌發(fā)酵液穩(wěn)定性測(cè)定

2.4Y6-7菌株產(chǎn)脂肽類和聚酮類活性化合物相關(guān)基因及其抑菌測(cè)定

基因檢測(cè)：以生防細(xì)菌Y6-7基因組DNA為模板，獲得8條單一條帶（圖8），分子量相符，可以擴(kuò)增到fengycin、bacillomycinD、iturin、surfactin、bacilysin、bacillaene、difficidin、bacillibactin對(duì)應(yīng)的合成基因，表明菌株Y6-7具有合成上述8種脂肽類抗生素和聚酮類抗生素的基因片段。說(shuō)明菌株Y6-7發(fā)酵液中可能含有相關(guān)物質(zhì)。

圖8菌株Y6-7抗生素合成基因PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果

4種方法提取粗提物的抑菌活性及產(chǎn)率：4種方法提取的Y6-7粗提物對(duì)草莓黃單胞菌YM2均有較好的抑制效果，且對(duì)照組對(duì)草莓黃單胞菌沒有作用（表5）。大孔樹脂吸附法得到的粗提物抑菌圈直徑和產(chǎn)量最高，與其他方法具有顯著差異，抑菌圈直徑為（ （36.57±0.47 ） mm ，而乙酸乙酯萃取得到的粗提物抑菌活性最低，酸沉淀法得到的粗提物產(chǎn)量最低。

表54種方法粗提物的抑菌活性及產(chǎn)率

2.5溫室盆栽評(píng)價(jià)菌株Y6-7對(duì)草莓角斑病的防治效果

使用蒙特瑞草莓品種評(píng)價(jià)解淀粉芽孢桿菌Y6-7對(duì)草莓角斑病YM2的抑制作用，接種7d后對(duì)照組草莓葉片出現(xiàn)明顯水漬狀病斑，通過(guò)病斑面積計(jì)算病情指數(shù)。調(diào)查結(jié)果（表6）顯示，對(duì)照發(fā)病率為 100% ，病情指數(shù)為 40.00，70% 丙森鋅800倍稀釋液處理組病情指數(shù)為16.67，解淀粉芽孢桿菌Y6-7處理組的病情指數(shù)為7.94，比對(duì)照組和 70% 丙森鋅800倍稀釋液處理組病情指數(shù)低。菌株Y6-7和 70% 丙森鋅800倍稀釋液對(duì)草莓角斑病的防效達(dá) 80.16% 和 67.06% ，表明菌株Y6-7對(duì)草莓角斑病具有較好的防治效果。

表6菌株Y6-7對(duì)草莓角斑病的防治效果

3討論與結(jié)論

由草莓黃單胞菌引起的草莓角斑病是嚴(yán)重影響草莓果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)的重要病害之一，控制該病主要依賴于預(yù)防性應(yīng)用含銅化合物或抗生素的殺菌劑。然而，植物毒性和抗性病原體是這種做法的主要缺點(diǎn)[12]。目前生物防治是植物病害防治的發(fā)展趨勢(shì)，繼續(xù)尋求與靶病原體共享相同生境的細(xì)菌或真菌生物防治劑（BCAs）菌株愈發(fā)重要[13]。在草莓上，屬于細(xì)菌種的BCAs，如枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌，已經(jīng)在葉面施用中測(cè)試了對(duì)草莓病原體的拮抗作用，包括B.cinerea和Sphaerothecamacularis[14-15]。Mishra 等研究記載了BCAs 對(duì)草莓以外作物上的葉面病原體（黃單胞菌屬）的功效[16-18]。到目前為止并不知道有任何研究評(píng)估了與草莓角斑病有關(guān)的BCAs或BCAs衍生產(chǎn)品。在本次試驗(yàn)中，筆者所在課題組報(bào)告了從草莓健康根際土中分離出具有拮抗活性的細(xì)菌分離物（解淀粉芽孢桿菌）對(duì)角斑病可能具有BCAs潛力。

芽孢桿菌代謝物中重要的抑菌活性物質(zhì)是抑菌蛋白和抑菌多肽，桑建偉等研究表明，解淀粉芽孢桿菌BEB17能產(chǎn)生脂肽類物質(zhì)和聚酮類物質(zhì)的抑菌成分[1]。Chen 等研究表明，解淀粉芽孢桿菌抗菌成分結(jié)構(gòu)主要由iturin、fengycin和surfactin脂肽組成[19]。主要的環(huán)狀脂肽是由芽孢桿菌菌株通過(guò)非核糖體肽合成酶產(chǎn)生的，破壞生物膜的完整性等拮抗病原菌，脂肽對(duì)植物具有延緩萎蔫癥狀發(fā)展、減輕萎蔫嚴(yán)重程度的作用，能干擾微生物生態(tài)群落的建立和存活，因此可作為植物病害的有效生物防治劑[20-21]。本研究檢測(cè)到菌株Y6-7有聚酮類和脂肽類合成基因，具有合成8種脂肽類抗生素和聚酮類抗生素的基因片段。且解淀粉芽孢桿菌Y6-7無(wú)菌發(fā)酵液的抑菌活性物質(zhì)具有良好的熱穩(wěn)定性和紫外線穩(wěn)定性，耐酸堿、對(duì)溶菌酶和蛋白酶K敏感。由于細(xì)菌素的氨基酸組成特征不同，造成細(xì)菌素對(duì)蛋白酶的敏感性不同。4種方法提取的粗提物對(duì)草莓黃單胞菌YM2均有較好的抑制效果，其中大孔樹脂粗提物拮抗效果和產(chǎn)量最高，通過(guò)上述研究結(jié)果和對(duì)相關(guān)基因檢測(cè)得出菌株Y6-7發(fā)酵液的抑菌成分可能存在蛋白類物質(zhì)、聚酮類物質(zhì)和脂肽類物質(zhì)。要明確解淀粉芽孢桿菌Y6-7對(duì)草莓角斑病菌主要的抑菌活性物質(zhì)還需進(jìn)一步通過(guò)薄層層析和高效液相色譜等方法研究探索。

開發(fā)高效的微生物接種劑是當(dāng)前研究的重要鄰域，但一旦應(yīng)用于該領(lǐng)域，這些接種劑通常缺乏一致性。其中一個(gè)主要原因是引入的微生物無(wú)法有效地在植物器官中定殖，也無(wú)法與天然菌群協(xié)作，而植物原生菌群組成相對(duì)穩(wěn)定，受環(huán)境因素影響較小，植物菌群也影響果實(shí)品質(zhì)和香氣[22]。因此，可以從寄主植物土著菌群中選擇促生微生物進(jìn)行單接種或混合接種，以克服促生微生物的不可靠性，提高在植物上的定殖力和持久性[23」。楊洪鳳等利用抗生素平板，檢測(cè)解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）CCo9在小麥根部的定殖情況，發(fā)現(xiàn)在小麥根內(nèi)、根表和根際菌株CC09均能定殖，對(duì)麥苗赤霉室內(nèi)防效高達(dá) 90.7%^[24] ;黎起秦等將內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌B47通過(guò)針刺和灌根法接種到番茄植株中，B47不僅可以在植株的根中定殖而且可以從根部傳導(dǎo)到莖中，且表現(xiàn)為先增加后下降的趨勢(shì)，2種接種方法都能防治番茄青枯病[25]；劉爽等從小粒野生稻根部分離1株解淀粉芽孢桿菌OMR1-7在擬石蓮屬多肉植物的根和莖部可大量定殖，有效阻正從根部侵入的土傳性黑腐病菌F.oxysporum，阻斷病菌向維管束蔓延[26]。本研究中分離自健康草莓根際土中的解淀粉芽孢桿菌Y6-7通過(guò)抗生素標(biāo)記法于葉片噴施，可在草莓葉片內(nèi)定殖，定殖數(shù)量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，說(shuō)明菌株Y6-7可通過(guò)定殖作用進(jìn)人草莓組織內(nèi)部，可能誘導(dǎo)草莓植株對(duì)細(xì)菌性角斑病產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，從而達(dá)到防治病害的作用。

本研究以草莓角斑病YM2為靶標(biāo)菌從健康草莓根際土壤中分離出1株解淀粉芽孢桿菌Y6-7，其菌體和發(fā)酵液均可有效抑制草莓角斑病的生長(zhǎng)，菌株抑菌譜廣，其最適生長(zhǎng)溫度為 30^°C ，具有高的鹽耐受性和耐酸堿性；抑菌活性物質(zhì)具有良好的熱穩(wěn)定性和紫外線穩(wěn)定性，耐酸堿，對(duì)溶菌酶和蛋白酶K敏感；4種粗提物活性物質(zhì)對(duì)草莓角斑病YM2具有顯著抑制作用。在溫室試驗(yàn)中其相對(duì)防效達(dá)到 80.16% ，上述研究證明菌株Y6-7在植物病害防治中有一定的應(yīng)用潛力。接下來(lái)，深入探索菌株Y6-7的穩(wěn)定性和抑菌機(jī)制，為生防菌劑的產(chǎn)品開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

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