紫蘇輪作對半夏連作根際土壤微生物群落結構、功能及理化性質的影響

摘要：揭示紫蘇輪作對半夏連作根際土壤微生物群落結構、功能及土壤理化性質的影響，旨在探討有助于緩解半夏連作障礙的種植模式。從紫蘇輪作和半夏連作中采集半夏根際土壤，采用高通量測序技術比較輪作1YBX、連作2YBX 和輪作3YZSBX生境中半夏根際土壤微生物群落多樣性、群落結構、功能差異，挖掘連作和紫蘇輪作生境中優勢微生物，分析其與環境因子的相關性。結果表明，輪作1YBX、連作2YBX和輪作3YZSBX的9個半夏根際土壤樣品共獲得細菌、真菌的OTU數量分別為1398、1779個，其中連作2YBX的細菌OTU數量明顯低于輪作1YBX，輪作3YZSBX真菌OTU數量高于連作 2YBX_c 。細菌門水平上，變形菌門（Proteobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteriota）是優勢細菌門；輪作3YZSBX的變形菌門（Proteobacteria）（ 39.85% ）、擬桿菌門（Bacteroidetes）（ 18.76% ）、厚壁菌門（Firmicutes） （9.01% ）相對豐度高于輪作 1YBX（34.93%，3.67% 和 2.88% ）和連作2YBX（29. 86% 、1. 15% 和1.54% ）;在屬水平上，輪作3YZSBX半夏根際土壤中的芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、雷爾氏菌屬（Ralstonia）、土生單胞菌屬（Terrimonas）和鞘氨醇盒菌屬（Sphingopyxis）相對豐度均高于連作根際土。真菌在門水平上，子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）是優勢真菌門，但輪作 3YZSBX的子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）豐度相對較低;在屬水平上，輪作3YZSBX的指示菌為被孢霉屬（Mortierella）、小葚核屬（Minimedusa）、Capnodiales 屬、青霉菌屬（Penicillium）和曲霉屬（Aspergilus）等。氨基酸生物合成途徑在紫蘇輪作和半夏連作根際土壤中占主導地位，連作阻斷了細菌的氧化呼吸鏈作用，造成細菌多樣性隨著年限的增加而降低;連作1YBX和輪作3YZSBX中病理-腐生-共生型（pathotroph-saprotroph-symbiotroph）占比（ 23.43% 和 15.95% ）較高，連作2YBX中腐生型（saprotroph）（ 39.31% ）與共生型（symbiotroph） （25.71% ）占絕對優勢。 ΔpH 值與TP含量是影響紫蘇輪作和半夏連作根際土壤細菌和真菌群落結構的環境因子，堿解氮對細菌群落結構豐度的影響較大。連作是半夏根際土壤微生物群落結構的失調的重要原因之一，紫蘇輪作不僅能有效地緩解此問題，還能有效地富集具有抑制病原真菌、抵抗半夏病蟲害和降解土壤中有機污染物等功能的有益菌，有望成為緩解半夏連作障礙的有效途徑。

中圖分類號：S182； ?5567.23?9.061 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2025）12-0235-14

半夏（Pinelliaternata）是天南星科多年生草本植物，其塊莖入藥，是傳統的中藥材，有潤燥化痰、降逆、止嘔等功效[1]。貴州省是我國種植半夏的優勢特色產區之一[2]。尤其是赫麻芋為貴州省的主栽赫章半夏品種，由于種植規模化、集約化、土地資源、氣候條件等因素的限制，產生了嚴重的連作障礙問題，這已成為半夏產業可持續發展面臨的重大難題之一。連作根際土壤微生物多樣性指數及豐富度也隨著種植年限的增加而降低，不僅改變了微生物群落結構，還使有益微生物的含量減少，有害微生物的含量增加，從而增加了土壤傳播疾病[3]。劉珊廷等研究證實，隨著連作年限的增加，會顯著改變根際土壤微生物的群落結構[4]。崔利等的研究表明，連作明顯增加了根際土壤中鐮孢菌屬、曲霉、鐮刀菌、赤霉菌等致病菌的相對豐度[5]。劉詩蓉等研究證實了連作使半夏有益微生物菌群退化，有害菌群增多[6]

輪作有利于降低病原菌數量，改善連作土壤微生物群落結構，可有效減少病害的發生。蕎麥參與烤煙輪作調節微生物群落結構[；油菜、馬鈴薯等參與小麥的輪作，有利于提高有益菌屬種類和豐度[8];小麥與半夏輪作可修復土壤微生物群落結構變化[9]。紫蘇[Perilla frutescens（L.） Britton]是唇形科1年生草本植物。于海權等的研究表明，紫蘇參與人參輪作模式抑制了土壤微生物活性的降低，改善了人參連作土壤微生態環境，對緩解人參的連作障礙具有積極作用[10]。杜洋洋等在連作和輪作對云南3個馬鈴薯主栽品種根際土壤真菌群落結構的影響的研究中發現，苦蕎輪作后會使土壤中真菌致病菌的豐度顯著降低[1]。但目前關于紫蘇輪作半夏的研究還較少。因此，本研究通過高通量測序技術對天河潭主栽赫章半夏品種的根際土壤微生物群落結構進行分析，研究紫蘇輪作模式下半夏根際土壤微生物群落變化，分析其對微生物功能的影響，旨在為緩解半夏連作障礙引起的微生物群落結構失衡、土壤微生態環境惡化提供理論依據，同時為主栽赫章半夏品種的生產實踐提供理論參考。

1材料與方法

1.1 樣地及根際土壤采集

試驗樣地位于貴州省貴陽市花溪區天河潭蘆荻村（ 106^°40^′53^′′E 26^°25^′55^′′N ，海拔 1155.3～ 1189.7m ，屬亞熱帶濕潤溫和型氣候，冬無嚴寒，年平均氣溫 15.4^°C ，年均降水量 1 129.2mm ，整個試驗基地土壤理化性質較一致。分別采集種植模式為輪作1YBX（2019 年紫蘇—2020 年紫蘇—2021年半夏）、連作2YBX（2019年紫蘇—2020年半夏—2021年半夏）和輪作3YZSBX（2019年半夏—2020年紫蘇—2021年半夏）的半夏根際土壤。在2021年半夏種植地中分別隨機設3個 10m×10m 樣方，在每個樣方中隨機采集1株健康植株，共采集9株健康植株。采用抖動法除去與根部附著不緊密的土壤，只保留根周圍 1～3mm 土壤，將附著根際土用無菌刷子輕輕刷至無菌自封袋中作為根際土樣，置于干冰中帶回實驗室。將根部及土壤樣品快速轉移至裝有無菌PBS緩沖液的無菌離心管中，室溫下 120r/min 振蕩 20～25min ，將懸浮液再次離心20min（4PC，5500r/min） ），合并收集離心后的根際土壤。土壤樣品分成2份，一份儲存在 -80°C 用于土壤微生物DNA提取和高通量測序，另一份風干過2mm 篩用于土壤理化性質測定。

1.2 試驗方法

1.2.1土壤養分測定參照《土壤農化分析》測定土壤理化指標[12]。土壤pH值采用雷磁 PHS-3CpH 計進行測定；土壤全氮（TN）、全磷（TP）、全鉀（TK）含量分別采用凱氏定氮法、高氯酸-硫酸法和堿熔-原子吸收分光光度計法測定；堿解氮（AN）有效磷（AP）、速效鉀（AK）含量分別采用堿解擴散法、碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法和乙酸銨浸提-火焰光度法測定。

1.2.2土壤微生物基因組總DNA提取及高通量測序采用E.Z.N. A^TM Mag-Bind Soil DNAKit試劑盒進行土壤微生物總DNA的提取，參照趙林艷等的方法[13對細菌 16Sr DNA基因V3～V4區和真菌ITS1—ITS2序列進行PCR擴增，擴增產物經檢測合格后送至生工生物工程（上海）股份有限公司，基于IlluminaMiseqTM/HiseqTM平臺進行高通量測序。每個樣品準備3個平行，在測序前將3個平行混合后進行測序。

1.3 數據分析

使用FLASH、Fastp對原始序列進行數據去雜和質量過濾。使用Uparsev.11在 97% 相似度下進行分類操作單元（operationaltaxonomicunits，OTU）聚類；采用RDPClassifier貝葉斯算法對每個OTU代表序列進行分類學分析，統計各樣本的群落物種組成;運用R軟件繪制OTU豐度的Venn圖；使用Mothurv.1.30.2進行 ∝ 多樣性分析，使用在線服務器（http：//galaxy.biobakery.org/）的LEfSe分析組間差異菌;使用Qiimev.1.9.1進行 β 多樣性分析；使用PICRUSt軟件和FUNGuild數據庫分別對細菌和真菌群落數據進行功能注釋預測。通過Origin完成柱形圖和理化因子相關性圖形繪制，采用Excel2016進行數據統計整理，采用SPSS25.0進行單因素方差分析（one-wayANOVA）和差異顯著性檢驗；采用Canoco5.0進行RDA分析。

2 結果與分析

2.1紫蘇輪作對半夏根際土壤理化性質的影響

從表1可以看出，與輪作1YBX相比，連作2YBX的半夏根際土壤的 pH 值及全氮、全磷、全鉀、堿解氮、速效鉀含量均顯著下降（ Plt;0.05. ），而有效磷含量差異不顯著。與連作2YBX相比，輪作3YZSBX的 ΔpH 值及全氮、全鉀、堿解氮、有效磷、速效鉀含量均顯著上升（ Plt;0.05 。

表1紫蘇輪作對半夏根際土壤理化性質的影響

注：同列數據后不同小寫字母表示不同種植模式之間差異顯著（ Plt;0.05） 。表3同。

2.2紫蘇輪作對半夏連作根際土壤微生物群落的影響

2.2.1半夏根際土壤微生物測序數據分析對根際土壤樣品測序獲得細菌和真菌序列，由表2可知，半夏根際土壤所有樣本共得到760657條細菌有效序列，其中輪作1YBX、連作2YBX和輪作3YZSBX分別產生 297880.265831.196946 條序列，測序覆蓋度為 99.58%～99.67% ；共得到143682條真菌有效序列，其中輪作1YBX、連作2YBX 和輪作3YZSBX分別產生 52114.45836.45732 條序列，覆蓋度為 99.93%～99.95% 。由此說明，樣本測序結果能基本反映樣品真實連作和紫蘇輪作半夏根際微生物群落結構組成。

表2不同種植模式半夏根際土壤微生物的測序信息

2.2.2半夏根際土壤微生物群落OTU數量的差異分析在 99% 相似水平下，半夏根際土壤所有樣本共獲得細菌、真菌的OTU數量分別為1398、1779個。其中，輪作1YBX、連作2YBX、輪作3YZSBX樣品注釋到的細菌OTU和真菌OTU分別為1134、957、868個和1148、597、740個。韋恩圖（圖1）分析顯示，3個樣地共有的細菌和真菌的OTU數量分別為431、108個，分別占對應總OTU數的 30.83% 和 6.07% ;3個樣地特有的細菌OTU數量為22、16、230個，分別占對應OTU總數的 1.57%.1.14% 、16.45% ；輪作1YBX、連作2YBX和輪作3YZSBX特有的真菌0TU數量為562、79、540個，分別占對應OTU總數的 31.59%.4.44%.30.35% 。相比細菌而言，樣本間根際土真菌共有OTU數量占共有細菌和真菌總數量（539個）的 20.04% ，說明樣本間真菌群落差異最大[14]。由此說明，天河潭試驗基地連作和紫蘇輪作半夏根際土壤微生物群落結構組成存在差異。

2.3紫蘇輪作對半夏連作根際土壤微生物 ∝ 多樣性的影響

在 ∝ 多樣性指數中，Chao豐富度指數和ACE指數主要反映不同年限連作根際土壤微生物群落豐富度和物種豐富度信息，指數越大表明群落豐富度越高；Shannon指數代表了根際土壤微生物細菌及真菌群落的多樣性，指數大小表明多樣性的高低；而Simpson指數與Shannon指數相反，其值越大，多樣性越低；測序覆蓋指數表示測序深度，越接近1，數據越合理。由表3可知，在所測不同年限半夏根際土壤樣品中，真菌及細菌的多樣性和豐富度各有不同。半夏根際土壤所有樣本細菌與真菌組間的測序覆蓋度指數均達到1.00，表明測序結果具備代表性，能夠較真實、合理地反映細菌和真菌多樣性。輪作1YBX半夏根際土壤細菌豐富度（Chao1）指數顯著高于連作2YBX和輪作3YZSBX，其真菌豐富度（Chao1）指數高于連作2YBX，但不顯著，輪作3YZSBX半夏根際土壤細菌和真菌的豐富度Chao1）指數均最低。輪作1YBX半夏根際土壤細菌多樣性指數（Shannon）顯著高于輪作3YZSBX，真菌Shannon指數二者差異不顯著；連作2YBX半夏根際土壤真菌Shannon指數最低。以上結果表明，在天河潭試驗種植區，連作2YBX種植模式下真菌菌群的多樣性指數顯著降低，而連作后采用紫蘇輪作有利于恢復真菌群落的多樣性。

圖1不同種植模式下半夏根際土壤細菌和真菌群落組成的韋恩圖

表3紫蘇輪作對半夏連作根際土壤微生物細菌和真菌 α_α（α_α） 多樣性指數的影響

2.4紫蘇輪作對半夏連作根際土壤微生物β多樣性的影響

為了分析紫蘇輪作和半夏連作根際土壤細菌和真菌群落結構組成差異，根據半夏根際土壤所有樣本含有的OTU物種信息，對其微生物進行基于非加權組平均法（unweightedpair group method witharithmeticmean，UPGMA）的樣本層級聚類和主成分分析（principal component analysis，PCA），結果如圖2所示。輪作1YBX和連作2YBX根際土壤細菌距離相對較近，每個樣地根際土壤真菌單獨聚為1個類群，真菌群落結構組成輪作1YBX和輪作3YZSBX的距離卻較為較近。細菌主成分1（PC1）和主成分2（PC2）對半夏根際土壤細菌的差異貢獻率分別為 52.14%.17.87% ，累計貢獻率為70.01% ；對半夏根際土壤真菌的差異貢獻率分別為29.69% ，20.04% ，累計貢獻率為 49.73% ，能較好地區分連作和輪作半夏根際土壤樣品。因此說明在天河潭試驗基地，紫蘇輪作和半夏連作根際土壤細菌和真菌群落結構組成差異較大。

2.5紫蘇輪作對半夏連作根際土壤微生物群落結構的影響

2.5.1微生物種群歸類分析由表4可知，半夏根際土壤所有樣本細菌共注釋到28門、65綱、100目、169科、308屬、459種，其中輪作1YBX注釋到27門、60綱、90目、154科、268屬和393種，連作2YBX樣品注釋到22門、56綱、85目、138科、225屬和318種，輪作3YZSBX注釋到27門、61綱、93目、157科、268屬和377種；3個樣地半夏根際土壤真菌共注釋到9門、38綱、99目、213科、247屬和381種，其中輪作1YBX注釋到9門、20綱、58目、108科、211屬和312種;連作2YBX處理注釋到9門、17綱、49目、75科、133屬和185種;輪作3YZSBX注釋到9門、20綱、49目、77科、126屬和167種；紫蘇輪作和半夏連作根際土壤微生物除了真菌在門類注釋無差異外，其余各分類等級的數量都存在明顯差異，說明紫蘇輪作和半夏連作模式的改變，使得半夏根際土壤微生物群落結構組成存在差異。

2.5.2 細菌群落結構分析輪作1YBX、連作2YBX和輪作3YZSBX半夏根際土壤細菌在門的水平上，共注釋到27門，除去平均占比小于 1% 的門為其他（other）和Unclassified_Bacteria門后，主要細菌門包括變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteriota）、綠彎菌門（Chloroflexi）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、藍－綠藻菌門（Cyanobacteria_Chloroplast）、疣微菌門（Verrucomicrobia）厚壁菌門（Firmicutes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）浮霉菌門（Planctomycetes）、candidate_division_WPS-2等11個門（圖3），其中優勢細菌主要為變形菌門（Proteobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteria），其相對豐度之和占總細菌門的50% 以上；輪作3YZSBX的變形菌門（Proteobacteria）（ 39.85% ）和厚壁菌門（Firmicutes）（9.01% ）的相對豐度明顯高于輪作1YBX（ 34.93% 和 2.88% ）和連作 2YBX（29.86% 和 1.54% ），而酸桿菌門（Acidobacteria）的相對豐度 12.55% 低于輪作 1YBX（21.75% 和連作 2YBX（23.84% （圖3）。在屬水平上，輪作1YBX、連作2YBX和輪作3YZSBX的相對豐度都排在前面的為芽單胞菌屬（Gemmatimonas） （2.55%，2.88% 和 4.57% ）、Unclassified_Sphingomonadaceae 屬 （4.86%，6.34% 和3. 53% ）、Unclassified_Bacteria屬（ 4.93% 74.02% 和 2.92% ）、Unclassified_Betaproteobacteria屬 （2，27%，1.42% 和 1.76% ）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）（ （1.18%1.07% 和 1.44% ）;輪作1YBX和連作2YBX半夏根際土壤的細菌屬相對豐度靠前的較為接近，其中Gp1屬（11. 08% 和15.14% ）相對豐度最高，Gp2屬、Unclassified_Rhodospirillales 屬、Unclassified _ Ktedonobacteria、Unclassified- Ktedonobacterales、 UnclassifiedActinomycetales、伯克氏菌屬（Burkholderia）、Ktedonobacter和WPS-2_genera_incertae_sedis屬在1.03%～6.34% 之間，且在輪作3YZSBX根際土壤中幾乎處于未檢測狀態;輪作3YZSBX中的 屬（ 7.70% ）、普雷沃菌屬（Prevotella） （4.77% ）、土生單胞菌屬（Terrimonas）（3. 44% ）、Unclassified_Anaerolineaceae（ 2.52% ）鞘氨醇盒菌屬（Sphingopyxis）（1.67% ）和假單胞菌屬（Pseudomonas）（ 1.10% ）卻在輪作1YBX和連作2YBX中未被發現，Unclassified_Caulobacteraceae屬 （9.73% ）、Ralstonia屬 （8.16% ）、Unclassified_Prevotellaceae（ 4.38% ） .Gp6（2.46%） 《巨球藻屬（Megasphaera） （ 1. 53% ）也高于輪作1YBX和連作 2YBX 。上述結果表明，紫蘇輪作和半夏連作模式是影響半夏根際細菌群落結構差異的主要原因。

圖2不同種植模式下半夏根際土壤微生物群落聚類分析和主成分分析

表4不同種植模式下半夏根際土壤微生物細菌學和真菌學分類階層總數

2.5.3 真菌群落結構分析輪作1YBX、連作2YBX和輪作3YZSBX半夏根際土壤真菌在門的水平上共注釋到9門，除去Unclassified門、unidentified門、Unclassified_Fungi門以及平均占比小于 0.1% 的門，主要的真菌門包括子囊菌門（Ascomycota）擔子菌門（Basidiomycota）、絲足蟲門（Cercozoa）壺菌門（Chytridiomycota）、球囊霉門（Glomeromycota）和接合菌門（Zygomycota）6個門（圖3），其中排列前3的子囊菌門（Ascomycota）相對豐度分別為 40.33% ！36.99% 和 34.53% ，擔子菌門（Basidiomycota）相對豐度分別為 14.24% 43.99% 和 4.81% ，接合菌門（Zygomycota）相對豐度分別為 9.35%.4.40% 和10.21% 。在屬的水平上，輪作1YBX排列前5的為Unclassified_Fungi（ 29.98% ）、鐮刀菌屬（Fusarium）（15. 55% ）、Unclassified_Tremellomycetes（ 10.81% ）、被孢霉屬（Mortierella）（9. 66% ）和Unclassified_Ascomycota（ 7.12% ）；連作2YBX排列前5的為紅菇屬（Russula）（37. 13% ）、阿尼菌屬（Arnium）（ 20.60% ）、Unclassified_Fungi（ 12.02% ）、鐮刀菌屬（Fusarium）（7. 61% ）、被孢霉屬（Mortierella）（ 4.42% ）；輪作3YZSBX半夏根際土壤排列前5的為Unclassified_Fungi為（ 46.12% ）、被孢霉屬（Mortierella）（10. 35% ）、unidentified （5.95% ）Unclassified_Trichocomaceae（ 4.52% ）、Unclassified_Nectriaceae（ 3.83% ）。由此可知，真菌屬與上述細菌屬豐度差異較大，真菌屬絕大部分相對豐度小于 1% 。

2.6紫蘇輪作對半夏根際土壤微生物群落優勢菌群的影響

2.6.1差異細菌分析比較半夏根際土壤所有樣本的細菌顯著性差異物種，從門到屬水平對各個處理進行LEfSe分析，檢測具有顯著豐度差異的細菌群落，僅LDA得分值大于4的被展示（圖4）。輪作1YBX中差異指示細菌為Acidobacteria 綱、Deltaproteobacteria綱、Gammaproteobacteria綱、Alphaproteobacteria 綱、Rhizobiales目、Rhodospirillales目、Unclassified_ Acidobacteria_ Gp2科、Caulobacteraceae 科、Hyphomicrobiaceae 科、Gp2 屬、根微菌屬（Rhizomicrobium）、Rhodoplanes屬、Unclassified Clostridia屬等，相對豐度較高且具有統計學意義；與連作2YBX和輪作3YZSBX相比，輪作1YBX的優勢菌Gp2屬的豐度顯著性最高，根微菌屬（Rhizomicrobium）的豐度分別是連作2YBX和輪作3YZSBX的3.4倍和86.3倍；紅游動菌屬（Rhodoplanes）的豐度分別是連作2YBX和輪作3YZSBX的1.12倍和4.39倍。連作2YBX指示菌為Ktedonobacteria 綱、Actinobacteria門、Actinobacteria綱、Actinomycetales 目、Thermomonosporaceae 科、戴氏菌屬（Dyella）等，戴氏菌屬（Dyella）的豐度分別是輪作1YBX和輪作3YZSBX的2.09倍和926.5倍；輪作3YZSBX半夏根際土壤的差異指示細菌為Bacteroidetes 門、Bacteroidia 綱、Bacteroidales 目、Gp4屬、Prevotellaceae科、Ralstonia 屬、Prevotella屬、Terrimonas 屬、Negativicutes 綱、Selenomonadales目、Anaerolineae 綱、Anaerolineales 目、Anaerolineaceae科、Veillonellaceae 科、Acidobacteria -Gp6 綱、Gp6屬、巨球藻屬（Megasphaera）、鞘氨醇盒菌屬（Sphingopyxis）。以上結果表明，不同的種植模式明顯影響半夏根際土壤中細菌優勢菌群的組成。

2.6.2差異真菌分析比較紫蘇輪作和半夏連作根際土壤真菌顯著性差異物種，從門到屬水平對各個處理進行LEfSe分析，檢測具有顯著豐度差異的真菌群落，僅LDA得分值大于4的被展示（圖4）。輪作1YBX的差異指示真菌為Tremellomycetes綱、Hypocreaceae 科、木霉屬（Trichoderma）、Magnaporthales目、unidentified科、根內球囊霉屬（Rhizophagus）、氯霉屬（Chloridium）、微結節菌屬（Microdochium）、Pucciniomycetes 綱、Platygloeales目、Eocronartiaceae科、柱銹耳屬（Eocronartium）、Ascobolaceae科、糞盤菌屬（Ascobolus）、絲孢菌屬（Scedosporium）、杯革菌屬（Cotylidia）。連作2YBX的差異指示真菌為Basidiomycota門、Lasiosphaeriaceae 科、Arnium 屬、Sebacinaceae科、Sebacina屬、Cantharellaceae科、Waitea屬等。輪作3YZSBX的差異指示真菌為Zygomycota門、Dothideomycete 綱、Mortierellales 目、Capnodiales目、Bionectriaceae科、Mortierellaceae科、被孢霉屬（Mortierella）、小葚核屬（Minimedusa）、unidentified屬、Capnodiales屬、青霉菌屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）等。以上結果表明，連作后采用紫蘇輪作有利于優勢菌群的富集。

2.7紫蘇輪作半夏根際微生物功能預測

2.7.1細菌功能預測分析基于本研究所測得的細菌多樣性數據，比對KEGG數據庫以及MetaCyc代謝通路數據庫進行豐度分析，對半夏不同種植模式下其根際土壤細菌進行初步的功能預測（表5）。所有樣本共注釋到406條代謝通路，其中位于前10的代謝通路中，參與氨基酸生物合成途徑的有PWY-5101（ L- isoleucine biosynthesis II，L-異亮氨酸生物合成II）、ILEUSYN-PWY[L-isoleucinebiosynthesis I（from threonine）， L- 異亮氨酸生物合成I（來自蘇氨酸）]、VALSYN-PWY（L-valinebiosynthesis，L-氨酸生物合成）、BRANCHED-CHAIN-AA-SYN-PWY（superpathway of branchedchainaminoacid biosyn-esis，支鏈氨基酸生物合成的超途徑）PWY-5103（L-isoleucinebiosynthesisⅢ，L-異亮氨酸生物合成Ⅲ）;參與有氧呼吸途徑的有 PWY-3781[aerobic respiration I（cytochrome c），有氧呼吸I（細胞色素c）]；參與厭氧呼吸途徑的有PWY- 7663［gondoatebiosynthesis（anaerobic），gondoate生物合成（厭氧）];參與能量調控相關的代謝途徑有糖酵解途徑PWY－7111［pyruvatefermentationtoisobutanol（engineered），丙酮酸發酵生成異丁醇（工程）];參與脂肪酸合成的有FASYN-ELONG -PWY（fatty acid elongation saturation，脂肪酸鏈延長及飽和化）；參與其他代謝相關的生物合成有PWY-5973（cis- vaccenate biosynthesis，cis-vaccenate生物合成）。進一步分析發現，各代謝通路豐度占比僅稍有不同，輪作1YBX和連作2YBX中各代謝通路的占比相對更高和更為接近，這與層級聚類的結果一致。

紫蘇輪作和半夏連作根際土壤共注釋到2167個功能酶。其中表達豐度較高位于前10的功能酶（表6）中，參與氧化呼吸的酶有EC：1.6.5.3[NADH：ubiquinone reductase[（ H⁺ - translocating），NADH：泛醌還原酶（ H⁺ -異位）];參與調節蛋白質的酶有EC：5.2.1.8（peptidylprolyl isomerase，肽基脯氨酰異構酶）；參與細菌DNA修復和復制的酶有EC：2.7.7.7（DNA-directed DNA polymerase，DNA 指導的 DNA聚合酶）、EC：2.7.7.6（DNA-directedRNApolymerase，DNA指導的RNA聚合酶）和EC：3.6.4.12（DNAhelicase，DNA 5^′3^′ 解旋酶）；參與雙組分系統的酶有EC：2.7.13.3（histidinekinase，組氨酸激酶）；參與細菌脂肪酸生物合成代謝的酶有EC：1.1.1.10O（3 -oxoacyl -［acyl -carrier -protein]reductase，3-氧代酰基-［酰基載體蛋白］還原酶）和EC：6.3.5.6[asparaginyl -|tRNA synthase（glutamine-hydrolyzing），天冬酰胺-tRNA合酶（谷氨酰胺水解）]；參與蛋白質合成的酶有EC：6.3.5.7[glutaminyl - tRNA synthase （glutamine -hydrolyzing），谷氨酰-tRNA合酶（谷氨酰胺水解）]。

圖4紫蘇輪作半夏根際土壤微生物群落LEfSe系統發育圖和柱狀圖

2.7.2 真菌功能預測分析采用FUNGuild平臺對紫蘇輪作和半夏連作根際土壤真菌群落進行功能預測分析，結果發現，樣本共涉及共生型（symbiotroph）、病理型（pathotroph）、腐生型（saprotroph）、病理－腐生-共生型（pathotroph-saprotroph-symbiotroph）病理-共生型（pathotroph -symbiotroph）、病理－腐生型（pathotroph-saprotroph）、腐生-共生型（saprotroph-symbiotroph）

表5不同種植模式下半夏根際土壤細菌群落部分代謝通路豐度

表6不同種植模式下輪作半夏根際土壤細菌群落部分功能酶豐度

7種生態營養模式。本研究對真菌功能菌群進行作圖分析（圖5），進一步比較發現，病理-腐生-共生型、腐生-共生型和其他型功能菌群在輪作1YBX和輪作3YZSBX半夏處理中相對豐度分別為23.43% 、10. 46% 、54. 75% 和 15.95% 、11. 64% 、53.34% ，與層級聚類分析結果一致。而連作2YBX種植模式下的功能菌群是共生型 （39.31% ）和腐生型 25.71% ）占絕對優勢，其對應的優勢菌屬為Russula屬和Arnium屬，其他營養型僅為 18.54% 0其中紫蘇輪作和半夏連作根際土壤病理-腐生 -共生型優勢屬均為鐮刀菌屬（Fusarium），腐生-共生型優勢均屬為被孢霉屬（Mortierella）。

2.8土壤環境因子與根際土壤微生物群落的關系

相關性分析（圖6）發現，紫蘇輪作和半夏連作根際土壤全磷含量與細菌中Unclassified_Bacteria門相對豐度呈顯著正相關關系（ Plt;0.05， ）；有效磷含量與酸桿菌門（Acidobacteria）相對豐度呈顯著負相關關系（ Plt;0 .05）；全鉀含量與厚壁菌門（Firmicutes）相對豐度呈顯著正相關關系（ Plt; 0.05）。全氮含量與真菌中擔子菌門（Basidiomycota）相對豐度呈顯著負相關關系（ Plt;0.05），與Unclassified_Fungi門相對豐度呈顯著正相關關系（ Plt;0. 05 ）；有效磷含量與絲足蟲門（Cercozoa）相對豐度呈顯著正相關關系（ Plt;0.05， ；堿解氮含量與接合菌門（Zygomycota）相對豐度呈顯著正相關關系（ Plt;0.05， ； pH 值與unidentified門相對豐度呈顯著正相關關系（ Plt;0.05 ）。

圖5不同種植模式下半夏根際土壤真菌功能預測

*表示顯著相關 （Plt;0.05） 。色帶相應顏色與熱圖矩陣數據相映射，靠近正值顏色（紅色）即為正相關，靠近負值顏色（藍色）即為負相關

圖6不同種植模式下半夏根際土壤微生物與土壤環境因子的相關性分析

根據細菌和真菌10個優勢門物種（包括未被注釋的門）和7個環境因子的RDA結果可見（圖7），細菌第1軸物種與環境因子相關性為0.9999，第2軸物種與環境相關性為0.9443，RDA解釋變量解釋度為 94.2% ，排序結果可靠。RDA1和RDA2解釋率分別為 56.03% 和 21.71% ，2軸能解釋 77.74% 的差異信息；AN含量、 pH 值與TP含量對紫蘇輪作和半夏連作根際土壤細菌群落組成變異的解釋度分別為 47.80% （ Plt;0.10^? ）、13. 10% （ Plt;0.10） 和 13.40% （ ），是影響紫蘇輪作和半夏連作根際土壤細菌群落的3個主要環境因子。真菌第1軸物種與環境因子相關性為0.9993，第2軸物種與環境相關性為0.9773，RDA解釋變量解釋度為 93.80% ，排序結果可靠。RDA1和RDA2解釋率分別為 41.71% 、 17.47% ，2軸能解釋59.18% 的差異信息；TK含量與TP含量對紫蘇輪作和半夏連作根際土壤真菌群落組成變異的解釋度分別為 39.60% （ Plt;0.10） 和 14.00% （ Plt;0.10^? ，是影響紫蘇輪作和半夏連作根際土壤真菌群落的2個主要環境因子。

圖7不同種植模式下半夏根際土壤微生物與土壤環境因子的RDA分析

3討論

3.1紫蘇輪作對半夏根際土壤微生物多樣性的影響

本研究對天河潭輪作1YBX、連作2YBX和輪作3YZSBX的9個半夏根際土壤樣品進行了測序分析，共獲得細菌、真菌的OTU數量分別為1398、1779個，其中連作2YBX的細菌OTU數量明顯低于輪作1YBX，該結果與前人研究報道的丹參連作根際土壤細菌OTU數量隨種植年限的增加而降低的結果[3]一致，均證實地下塊莖類作物種植根際土壤細菌OTU隨種植年限延長而下降。輪作3YZSBX真菌OTU豐度高于連作2YBX，這一結果與木薯輪作后真菌OTU數量高于連作的結果[4]一致。本研究說明連作會降低土壤細菌OTU數量，而紫蘇輪作有利于提高連作土壤真菌的OTU數量。土壤微生物多樣性在增強群落穩定性和提高群落生產力方面具有重要意義，連作年限是影響塊莖類作物根際微生物多樣性的變化的關鍵因素[15]。本研究發現，連作顯著降低了真菌菌群的多樣性指數，而連作后采用紫蘇輪作有利于恢復真菌菌群的多樣性。

3.2紫蘇輪作對半夏根際土壤微生物群落結構的影響

本研究揭示了天河潭紫蘇輪作對半夏根際土壤微生物群落變化影響的規律。在細菌門水平上，本研究中變形菌門（Proteobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteria）是優勢細菌門，其相對豐度之和占總細菌門的 50% 以上；輪作3YZSBX的變形菌門（ 39.85% ）、擬桿菌門（18. 76% ）、厚壁菌門0 9.01% ）相對豐度顯著高于輪作1YBX（ 34.93% ！3.67% 和 2.88% ）和連作 2YBX（29.86%，1.15% 和1.54% ），這可能是由于這些菌在輪作環境條件下有利于生存和繁殖，可更好地保護其內部rRNA免受外部干擾[1]，從而成為輪作半夏根際土壤的優勢細菌菌門，這與輪作能顯著提升煙草、小麥和稻田[17]等長期連作土壤中的變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）的結果一致。在屬水上，本研究連作2YBX模式下不僅芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、Gp6屬和鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）相對豐度顯著低于輪作3YZSBX，而且Gp4屬、普雷沃菌屬（Prevotella）、土生單胞菌屬（Terrimonas）、Unclassified_Anaerolineaceae、鞘 醇盒菌屬（Sphingopyxis）和假單胞菌屬（Pseudomonas）在連作2YBX中并未被發現。結合細菌的LEfSe結果表明，與連作2YBX和輪作3YZSBX相比，輪作1YBX的優勢菌Gp2屬豐度最高，這與其在新土中占比高于老參土和百香果連作地的結果[18-19]一致;根霉菌屬（Rhizomicrobium）的相對豐度分別是連作2YBX和輪作3YZSBX的3.4倍和86.3倍，該屬是一種降解大分子有機氮生成小分子有機氮、胺和氨基酸的過程的關鍵指示菌[20]，紅游動菌屬（Rhodoplanes）的相對豐度分別是連作2YBX和輪作3YZSBX的1.12倍和4.39倍，該屬在有機肥處理橘園土壤及果實品質研究中發揮重要作用[21]。本研究發現，輪作3YZSBX半夏根際土壤中的芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、雷爾氏菌屬（Ralstonia）土生單胞菌屬（Terrimonas）和鞘氨醇盒菌屬（Sphingopyxis）相對豐度均高于連作根際土樣，其中前2種屬不僅能抑制病原真菌侵染、抵抗植物病蟲害和誘導植物產生系統抗性[22]，還能與植物病原體爭奪生態位來發揮其生物防治能力[23]；后2種菌屬不僅能有效降解土壤中的除草劑、農藥等有機污染物，還可以固定大氣中的氮供植物利用[24]，如王小利等發現鞘氨醇盒菌屬（Sphingopyxis）是小麥連作土壤氮代謝的主要物種[25]。由此可推測，在紫蘇輪作半夏的根際土壤中，優勢功能菌占據了主導地位，這些微生物主要參與能量代謝、分解有機物的過程，進而促進半夏生長。

在真菌門水平上，本研究中子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）是優勢真菌門，這一結果與大部分作物連作和輪作根際土壤中優勢菌門的結果[13.26]一致。連作后采用紫蘇輪作，子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）相對豐度較低，這一結果與同為塊莖的馬鈴薯輪作結果[1相似。在屬水平上，與連作2YBX相比，輪作1YBX和紫蘇輪作3YZSBX優勢屬種類較多。結合真菌的LEfSe結果表明，輪作1YBX的指示菌屬為木霉屬（Trichoderma）、根內球囊霉屬（Rhizophagus）、氯霉屬（Chloridium）、微結節菌屬（Microdochium）、糞盤菌屬（Ascobolus）、絲孢菌屬（Scedosporium）、杯革菌屬（Cotylidia），輪作3YZSBX的指示菌屬為被孢霉屬（Mortierella）、小葚核屬（Minimedusa）、unidentified屬、Capnodiales屬、青霉菌屬（Penicillium）和曲霉屬（Aspergillus）等，這進一步解釋了本研究微生物群落聚類分析時輪作1YBX和輪作3YZSBX根際土壤真菌較為接近的原因。其中被孢霉屬（Mortierella）是一種具有增加土壤養分有效性和提高酶活性的有益腐生真菌，在本研究連作和輪作土壤中，其相對豐度差異較大，連作2YBX中為 4.42% ，而輪作3YZSBX中為 10.35% ；同時，鐮刀菌屬（Fuwrium）真菌為連作土壤典型病原菌，在本研究輪作3YZSBX中豐度（ （2.26% ）最低，這一結果表明紫蘇輪作可改善連作半夏根際土壤典型病原菌群豐度。

因此，紫蘇輪作半夏，可有效地富集半夏連作根際土壤中具有抑制病原真菌、抵抗半夏病蟲害和降解土壤中有機污染物等功能性有益微生物，如芽單胞菌屬（Gemmatimonas）雷爾氏菌屬（Ralstonia）、土生單胞菌屬（Terrimonas）和鞘氨醇盒菌屬（Sphingopyxis）和被孢霉屬（Mortierella）等，今后可進一步分離這些有益微生物應用于實踐，使其在緩解半夏連作過程中發揮著重要作用。

3.3不同種植模式下半夏根際土壤細菌和真菌功能預測的分析

研究表明，連作環境下微生物的適應行為復雜，與代謝途徑密切相關[27]。本研究通過 KEGG 數據庫對細菌功能預測共注釋到406條代謝通路，參與氨基酸生物合成途徑的有PWY-5101（L-isoleucinebiosynthesisII，L-異亮氨酸生物合成I）、ILEUSYN-PWY[L-isoleucine biosynthesisI（fromthreonine），L-異亮氨酸生物合成I（來自蘇氨酸）]、VALSYN-PWY（L-valine biosynthesis，L-氨酸生物合成）、BRANCHED-CHAIN-AA-SYN-PWY（superpathway of branched chain aminoacidbiosyn-esis，支鏈氨基酸生物合成的超途徑）、PWY-5103（ L- isoleucine biosynthesis II，L-異亮氨酸生物合成ⅢI）;參與有氧呼吸途徑的有PWY-3781[aerobic respiration I（cytochrome c），有氧呼吸I（細胞色素c）];參與厭氧呼吸途徑的有PWY-7663[gondoatebiosynthesis（anaerobic），gondoate 生物合成（厭氧）]；參與能量調控相關的代謝途徑有糖酵解途徑PWY- 7111[pyruvate fermentation toisobutanol（engineered），丙酮酸發酵生成異丁醇（工程）]；參與脂肪酸合成的有FASYN-ELONG -PWY（fattyacid elongationsaturation，肪脂酸鏈延長及飽和化）;參與其他代謝相關的生物合成有PWY-5973（cis-vaccenate biosynthesis，cis-vaccenate 生物合成）。細菌代謝功能多樣性、強弱與其群落結構和組成密切相關。本研究結果顯示，氨基酸生物合成途徑在連作和紫蘇輪作中占主導地位，這與大別山五針松根際細菌群落代謝途徑結果[28]較為一致。有研究表明，氨基酸的組成和豐度的變化影響代謝細菌群落和調節微生物與環境之間的互作關系[29]，如氨酸與合成抗菌物質有關，異亮氨酸能夠合成激素、酶類物質和可制成抗菌劑[30-31]，推測本研究氨基酸的生物合成在半夏根際土壤微生物系統內部的能量傳遞和物質代謝過程扮演重要的角色，可以減緩半夏受到的根際有害菌群的脅迫。

為揭示細菌群落結構及功能酶活性對半夏根際土壤生態系統中的生物化學反應進程產生的影響，本研究紫蘇輪作和連作半夏根際土壤共注釋到2167個功能酶，其中排列首位的參與氧化呼吸的酶有EC：1.6.5.3［NADH：ubiquinonereductase（ H⁺ -translocating），NADH：泛醌還原酶（ H⁺ -異位）]。細菌的氧化呼吸直接關系細菌的存活，本研究中參與細菌氧化呼吸的酶平均占比為 1.71% ，說明氧化呼吸是影響半夏根際土壤細菌群落結構的最關鍵的因素，連作可能阻斷了半夏根際土壤細菌的氧化呼吸鏈，從而使細菌的生長繁殖受到嚴重影響，導致細菌多樣性、豐富度等因連作而受到影響，造成細菌群落結構的失調。

通過對半夏根際土壤真菌群落進行功能預測分析，本研究發現，輪作1YBX和輪作3YZSBX中病理-腐生-共生型（pathotroph－ saprotroph-symbiotroph）相對占比（ 23.43% 和 15.95% ）較高，這一結果可能與群落結構中占優勢的子囊菌門相關，子囊菌門主要以腐生菌為主，能分解土壤中難降解的有機物，從而促進土壤養分的不斷循環利用[32]。連作2YBX中腐生型（saprotroph）0 39.31% ）與共生型（symbiotroph）（ （25.71% ）占絕對優勢，這一結果與連作玉米的結果[33]一致，有研究表明，共生型真菌（如外生菌根真菌和叢枝菌根真菌）能提高宿主抗逆性[34]。本研究表明，紫蘇輪作半夏不僅能影響根際土壤真菌群落結構的變化，還會改變真菌群落自身的功能；紫蘇輪作有利于豐富真菌群落功能，提高病理-腐生-共生（pathotroph-saprotroph-symbiotroph）病理-共生型（pathotroph -symbiotroph）、病理－腐生型（pathotroph-saprotroph）和腐生-共生型（saprotroph-symbiotroph）過度型的比例，增加真菌群落的代謝多樣性，有利于緩解連作土壤病原真菌的富集。

3.4不同種植模式下半夏根際土壤理化性質的相關性分析

土壤微生物群落與土壤環境因子互相影響，土壤環境因子不僅影響著微生物的生長發育，還能直接或間接地改善土壤理化性質、維持土壤質量和肥力[35-36]。本研究表明，紫蘇輪作和半夏連作根際土壤理化性質及根際土壤微生物群落結構存在顯著差異，其中酸桿菌門（Acidobacteria）與有效磷含量顯著負相關，酸桿菌能夠促進植物營養物質的富集和生長[37]，表明有效磷含量影響半夏根際土壤中微生物的富集和細菌功能變化，說明在半夏生產管理中需要重視磷肥的配施。厚壁菌門作為適應貧瘠惡劣環境的主要菌門，可通過促進土壤中的有機物降解，增加土壤中的有益細菌的數量，改善土壤結構，提高土壤肥力[38]。本研究中全鉀含量與厚壁菌門（Firmicutes）呈顯著正相關，說明紫蘇輪作刺激了連作土壤厚壁菌門的繁殖和生存，進而對連作土壤肥力的改善其作用。在真菌群落結構中，擔子菌門（Basidiomycota）與全氮含量顯著負相關，這可能是由于紫蘇輪作和半夏連作土壤全氮含量差異過大導致結果相反的現象。結合RDA分析結果，本研究pH 值與TP含量是影響紫蘇輪作和半夏連作根際土壤細菌和真菌群落結構的環境因子，堿解氮含量是影響細菌群落結構豐度的主要環境因子。

4結論

紫蘇輪作和半夏連作根際土壤微生物多樣性、群落結構存在明顯差異。紫蘇輪作不僅有助于提升真菌多樣性指數，還可有效富集連作半夏根際土攘中具有抑制病原真菌、抵抗半夏病蟲害和降解土壤中有機污染物等功能的有益微生物，如芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、雷爾氏菌屬（Ralstonia）、土生單胞菌屬（Terrimonas）和鞘氨醇盒菌屬（Sphingopyxis）和被孢霉屬（Mortierella）等。氨基酸的生物合成在連作半夏根際土壤微生物系統內部的能量傳遞和物質代謝過程扮演重要的角色，可以減緩半夏受到的根際有害菌群的脅迫。連作可能阻斷了半夏根際土壤細菌的氧化呼吸鏈，從而使細菌的生長繁殖受到嚴重影響，導致細菌多樣性、豐富度受到影響，造成細菌群落結構的失調。紫蘇輪作和半夏連作影響半夏根際土壤真菌群落結構的變化，改變真菌群落自身的功能；紫蘇輪作有利于豐富真菌群落功能，提高病理-腐生-共生（pathotroph-saprotroph-symbiotroph）、病理－共生型（pathotroph-symbiotroph）、病理-腐生型（pathotroph 1一saprotroph）和腐生-共生型（saprotroph-symbiotroph）過度型的比例，增加真菌群落的代謝多樣性，有利于緩解連作土壤病原真菌的富集。pH值與TP含量是影響紫蘇輪作和半夏連作根際土壤細菌和真菌群落結構的環境因子，堿解氮含量是影響細菌群落結構豐度的主要環境因子。綜上所述，連作是半夏根際土壤微生物失調的主要原因，是半夏的連作障礙的重要影響因素，而紫蘇輪作不僅可改善連作引起的半夏根際土壤微生物失調問題，還可成為緩解半夏連作障礙的有效途徑。

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