不同加工貯藏條件對抗菌肽抑菌活性的影響

關鍵詞：抗菌肽;金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）；大腸桿菌（Escherichia coli）;抑菌活性；穩定性

中圖分類號：TS202.1；TS201.2 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2025）07-0142-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.07.025 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

The effect of different processng and storage conditions on the antibacterial activity of antimicrobial peptide

SUN Xiao-sha，KONG Yi-lin，SUN Ru-jiang （Yantai Institute of China Agricultural University，Yantai 26467O，Shandong，China）

Abstract：Inordertostudythechangesofantimicrobialpeptiesduringprocsingandstorage，tapylococcusureusadEcheich iacoliwereusedasidicatorbacteriainthexperiment.Telativeantibacterialactivitsabilityfntiicrobialpeptideswasevaluatedfromtheaspetsofmnimumiibitoryconcentration（MIC），temperature，pHdiferentconcentrationsofetalons，andstor agetime.Theresultsshowedthatantimicrobialpeptideshadbroad-spectrumantibacterialactivity，godthermalstability，andcould maintain relative inhibition rates of 88.16% and 93.88% after30 minutes of treatment at 100‰ ;differentpHvalueshad asignificant impact on the antibacterial activity of antimicrobial peptides （ P lt;0.05）.Antimicrobial peptides exhibited significantly higher antibacterialactivityinacidicenvironmentsthaninstroglyalkalineenvironments，indicating tatantimicrobialpeptideswereoresuitable for processing and production in acidic environments.Different concentrations of Ca²⁺ and Na+ in the solution had significant effects on theantibacteralactiityfantiicoialpepides.Hghtnviroetsouldusedeasetiicoalctivitycial peptides，but the lowest relative inhibition rate was still above 80% .The effect of storage time on the relative inhibition rate of Escherichia coli was greater than thatof Staphylococcus aureus，and the relative inhibition rate remained above 85% after 12 months of storage. Key Words：antimicrobial peptides；Staphylococcus aureus；Escherichia coli；antibacterial activity；stability

抗菌肽（Antimicrobial peptide）是機體抵御病原體人侵時產生的一類小分子多肽，具有廣譜抑菌性、抗寄生蟲、抗病毒、調節免疫系統等多種功能[2.3]。抗菌肽具有種類多、分子量低、抗菌機制獨特、不易產生耐藥性等優點[4]，可應用于飼料、醫藥、食品等領域。2020年7月起，中國禁止使用含有促生長類藥物添加劑的飼料，抗菌肽作為飼用抗生素的主要替代物成為畜禽健康養殖的研究熱點[4]。抗菌肽由氨基酸組成，其作為飼料添加劑在飼料保存、加工和運輸過程中溫度、pH、金屬離子、存儲時間等因素可能影響其結構和功能，從而導致抗菌肽抑菌能力降低甚至喪失[5]。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）是一種廣泛存在于自然界的食源性致病菌，肉制品、蛋制品、乳制品等食品均易受金黃色葡萄球菌污染，動物常因感染金黃色葡萄球菌而引起乳腺炎、皮膚感染、關節炎等疾病，從而導致經濟損失，甚至構成公共衛生風險[]。大腸桿菌（Escherichiacoli）是大腸埃希氏菌的俗稱，屬于腸桿菌科埃希氏菌屬。大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌感染引起的一類疾病的總稱，由于感染時間、免疫力、感染途徑以及菌株毒力的差異，引起的臨床癥狀也有所不同[8，該病常與其他疾病并發或繼發感染而使死亡率升高，給養禽業帶來了巨大損失[9.10]。本研究以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為指示菌，主要研究抗菌肽對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌能力及其在不同溫度、 ΔpH ）金屬離子、存儲時間下的抑菌活性，為抗菌肽在實際生產中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗菌株大腸桿菌（Escherichiacoli，CICC21482）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaure-us，ATCC6538P），購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。試驗菌株均保存于含 20% 甘油的冷凍管中，置于 -80°C 保存備用。

1.1.2供試抗菌肽抗菌肽由山東深海生物科技股份有限公司提供。抗菌肽產品核心成分是自然菌株植物乳桿菌通過液體定向誘導表達的代謝產物，是一種熱穩定小分子多肽蛋白，由44個氨基酸組成，分子質量為 4.4ku □

1.1.3主要試劑NA固體培養基、NB液體培養基，購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司；氫氧化鈉、氯化鈉、無水氯化鈣（粒）鹽酸，購自上海麥克林生化科技股份有限公司。

1.1.4主要儀器INDINATEF50型酶聯免疫檢測儀，特康奧地利有限公司；DK-98-I型電熱恒溫水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司；DHP-9160B型電熱恒溫培養箱，上海瑯玕實驗設備有限公司；GI80DS型全自動高壓滅菌鍋，致微（廈門）儀器有限公司；IS09001型濁度計，上海昕瑞儀器儀表有限公司；FE28型智能酸度計、ME104E型電子天平，瑞士梅特勒-托利多集團；BCD-133EN型低溫冰箱、HCB-1300V型超凈工作臺，青島海爾股份有限公司；DHG-924385-Ⅲ型電熱鼓風干燥箱，上海新苗醫療器械制造有限公司；HNY-200B型恒溫振蕩器，天津歐諾儀器股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1菌種擴大培養接種環取甘油菌以平板劃線法接種于 10mL 營養瓊脂培養基上， 37^°C 恒溫培養5～6h 取出， 4^°C 保存備用。

1.2.2菌種活化挑取擴大培養的培養皿中單菌落于 5mL 營養肉湯培養基中， 37^°C 下 180r/min 恒溫振蕩培養 5～6h 。取 800μL 菌液，用無菌生理鹽水稀釋至 8mL ，轉移至濁度杯中測定濁度，使最終加入指示菌終濃度為 1×10⁷CFU/mL ，其余菌液 4^°C 保存備用。

1.2.3最小抑菌濃度測定測定抗菌肽的最小抑菌質量濃度（Minimuminhibitoryconcentration，MIC）。取對數期的菌體，制備成菌懸液（菌液濃度為10⁷CFU/mL ，加入96孔板內。用二倍稀釋法將抗菌肽溶液稀釋后加入菌懸液中，每個質量濃度3個重復，對照組為等量無菌水。將96孔板置于 37^°C 恒溫培養箱培養 ^16h ，使用酶聯免疫檢測儀測定OD_620nm ，測定各試驗組與對照組的 OD_620nm 差值，以抗菌肽質量濃度為橫坐標、 OD_620nm 差值為縱坐標繪制曲線，拐點即為MIC[1]（圖1）。

1.2.4不同條件對抗菌肽抑菌效果的影響

1）溫度。參考宋賢娟等5方法并作一定修改，以MIC濃度下的抗菌肽液體培養基溶液，分別在- 2 0 、 2 0、 4 0、6 0 、 8 0 、１００℃ 下處理 30min 后冷卻至室溫 （25^°C） ），以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌為指示菌，在96孔板中每孔加入 200μL 處理后的終濃度為MIC的抗菌肽菌懸液（菌液濃度為 10⁷CFU/mL ，設置陰性對照和陽性對照。陰性對照只加入 200μL 液體培養基菌懸液，陽性對照只加入 200μL 終濃度為MIC的抗菌肽液體培養基溶液，用酶聯免疫檢測儀測定其在 620nm 處吸光度，研究不同溫度對抗菌肽抑菌活性的影響。按式（1）計算噴干粉抗菌肽的相對抑菌率 （X）

X=（A₀-A₁）/（A₀-A₂）×100%

式中， 分別為陰性對照組、試驗組和陽性對照組在 620nm 處吸光度值。

2）pH 。以MIC濃度下的抗菌肽液體培養基溶液測定初始 pH ，再分別用濃度為 1mol/L 的HCl溶液和 NaOH 溶液調節抗菌肽溶液 pH 為2、4、6、8、10、12，處理 ^4h 后調回中性，以未處理的樣品作為對照（相對抑菌率為 100% ），同上法測定不同 pH 下的相對抑菌率，研究不同 pH 對抗菌肽抑菌活性的影響。

3）金屬離子。以MIC濃度下的抗菌肽液體培養基溶液，分別配制成NaCl溶液濃度為200、150、100、75.50.25mmol/L 的抗菌肽鹽溶液和 CaCl₂ 溶液濃度為 10.00、7.50、5.00、3.75、2.50、1.25mmol/L 的抗菌肽鹽溶液[12]，以未處理的樣品作為對照（相對抑菌率為 100% ），同上法測定不同金屬離子及不同濃度下的相對抑菌率，研究不同濃度的不同金屬離子對抗菌肽抑菌活性的影響。

4）儲存時長。將抗菌肽在 4^°C 下儲存3個月、6個月、9個月、12個月，取出后恢復至室溫（ 25^°C ，配制成終濃度為MIC的抗菌肽溶液，以未處理的樣品作為對照（相對抑菌率為 100% ，同上法測定不同儲存時間下的相對抑菌率，研究不同儲存時長對抗菌肽抑菌活性的影響。

1.2.5數據處理每組樣品均進行3次重復測定，用Excel軟件對原始數據進行處理。采用SPSS27.0軟件單因素ANOVA檢驗進行組間均數差異多重比較，兩兩比較方差齊性時采用最小顯著性差異法，非齊性時使用塔姆黑尼T2方法，顯著性水平 Plt; 0.05表示差異顯著，用Origin2024繪制統計圖，結果以“平均值 ± 標準偏差” 表示。

2 結果與分析

2.1 抗菌肽最小抑菌濃度

如圖1所示，隨著抗菌肽質量濃度增加，相應的OD_620nm 呈下降趨勢，當抗菌肽濃度達 50mg/mL 時，OD_620nm 快速下降至穩定，且繼續增加抗菌肽質量濃度， OD 變化可以忽略，且金黃色葡萄球菌和大腸桿菌也無法正常生長，抗菌肽對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC均為 50mg/mL

2.2不同條件對抗菌肽抑菌效果的影響

2.2.1不同溫度下的相對抑菌率不同溫度處理對抗菌肽的抑菌活性影響如圖2所示。由圖2a可知，抗菌肽對金黃色葡萄球菌的相對抑菌率在 -20～ 80^°C 處理 30min 無顯著性差異 （Pgt;0.05） 。 100^°C 處理 30min 后恢復室溫，相對抑菌率略下降，但仍保持在將近 90% ，其余溫度做相同處理，相對抑菌率均在（ 91.85±3.76）% 至 （94.66±1.52）% 范圍內。由圖2b可知，抗菌肽對大腸桿菌的相對抑菌率經 20°C 處理30min 后恢復室溫相較其他試驗組具有顯著性變化1 （Plt;0.05） ，相對抑菌率達到最大 （98.45±0.69）% ，其余溫度做相同處理，相對抑菌率均在 93% 以上。綜合抗菌肽對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌在低溫、常溫、高溫環境下的相對抑菌率來看，抗菌肽具有良好的熱穩定性。該結果可能由于抗菌肽分子質量小、a.抗菌肽對金黃色葡萄球菌的MIC；b.抗菌肽對大腸桿菌的MICa.不同溫度下抗菌肽對金黃色葡萄球菌相對抑菌率;b.不同溫度下抗菌肽對大腸桿菌相對抑菌率不同小寫字母表示有顯著性差異 （Plt;0.05 。下同二級結構簡單，在低溫、常溫環境下肽鍵以及氫鍵不易解開，當溫度緩慢恢復后，抗菌肽的抑菌活力略微上升，高溫對其結構影響小，在極端高溫條件消失后，抗菌肽會很大程度上恢復其原始結構，恢復其抑菌活性[13]

圖1抗菌肽對兩種致病菌的MIC

圖2不同溫度下抗菌肽的相對抑菌率

2.2.2不同 pH 下的相對抑菌率不同 pH 處理對抗菌肽的抑菌活性影響如圖3所示。由圖3可知， pH 對抗菌肽的抑菌活性影響很大，具有顯著性差異（ P lt;0.05） 。從圖3a可以看出，抗菌肽對金黃色葡萄球菌在 pH 為4時相對抑菌率達到最大值（ 86.92± 2.34）% ， pH 為2、8、10時的相對抑菌率相比顯著下降，最低值為 （6.98±1.89）% ，而抗菌肽在 pH 為12時完全喪失抑菌活性。從圖3b可以看出，抗菌肽對大腸桿菌在 pH 為4時相對抑菌率達到最大值（ 84.35± 1.95）% ， pH 為10時，相對抑菌率下降至 （14.19± 0.79）% 。

圖3不同pH下抗菌肽的相對抑菌率

不同 pH 處理后，抗菌肽對大腸桿菌的抑菌活性強于金黃色葡萄球菌，且抗菌肽對兩種指示菌在偏酸性環境下能更好地發揮抑制作用。抗菌肽的抑菌活性與其所含螺旋二級結構含量有關[14]，導致pH對抗菌肽抑菌活性產生巨大影響的原因可能是強堿性環境破壞抗菌肽的螺旋二級結構，打破抗菌肽自身結構穩定性，使其無法行使正常的生物學功能，導致抑菌活性降低甚至完全喪失。另一種原因是抗菌肽經酸堿處理后，自身的帶電狀態發生變化，影響與金黃色葡萄球菌和大腸桿菌細胞膜的結合，減弱抑困T用。

2.2.3不同濃度金屬離子的相對抑菌率 不同濃度金屬離子處理對抗菌肽的抑菌活性影響如圖4所示。不同濃度金屬離子的抗菌肽溶液相對抑菌率對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有顯著性差異（ Plt; 0.05）。由圖4a可知，抗菌肽對金黃色葡萄球菌的相對抑菌率在Ca離子濃度為 1.25～2.50mmol/L 時無顯著性變化 （Pgt;0.05） ），Ca離子濃度在 1.25～5.00mmol/L 時抗菌肽對金黃色葡萄球菌的相對抑菌率保持在91%～94% 之間，在Ca離子濃度 ≥7.50mmol/L 時相對抑菌率有所下降，在 10mmol/L 時相對抑菌率降至（ 82.87±1.20）% 。由圖4b可知，隨著溶液中 CaCl₂ 的濃度不斷升高，抗菌肽對大腸桿菌的相對抑菌率呈下降趨勢，當Ca離子濃度為 10.00mmol/L 時，其相對抑菌率處于最低值，為（ 85.62±2.15）% 。由圖4c可知，抗菌肽 Na 溶液對大腸桿菌的相對抑菌率在Na離子濃度為 25～75mmol/L 時無顯著性差異（ Pgt; 0.05），相對抑菌率均在 91% 以上。Na離子濃度為100mmol/L時，相對抑菌率相對于對照組下降16.8個百分點， Na 離子濃度 ?100mmol/L 時有顯著性變化 （Plt;0.05） 。由圖4d可知，抗菌肽Na溶液對大腸桿菌的相對抑菌率在 Na 離子濃度 ?100mmol/L 時有明顯下降。高濃度的金屬離子會對抗菌肽的抑菌活性產生較大影響，高鹽環境可以引起抗菌肽抑菌活性降低，但是最低相對抑菌率仍在 80% 以上。其原因可能為帶正電荷的金屬離子與指示菌菌體帶負電荷的磷脂相結合，從而減弱抗菌肽對指示菌的吸附效果，降低了抗菌肽的抑菌活性[15]。

2.2.4不同儲存時間下的相對抑菌率不同儲存時間對抗菌肽的抑菌活性影響如圖5所示。由圖5a可知，儲存12個月抗菌肽對金黃色葡萄球菌的最低相對抑菌率仍在 94% 以上，可見雖然不同儲存時間的抗菌肽對金黃色葡萄球菌的相對抑菌率有顯著性差異 （Plt;0.05） ），但是儲存時間對其抗菌活性的影響較小。由圖5b可知，抗菌肽對大腸桿菌的相對抑菌率具有顯著性差異 （Plt;0.05） 。當儲存時間為12個月時其抑菌活性最低，相對抑菌率為 （85.00±1.33）% ，可見不同儲存時間的抗菌肽對大腸桿菌的抑菌活性影響更大。

3 結論

抗菌肽的抑菌活性是否穩定在生產、運輸、儲存過程中尤為關鍵。研究新型抗菌肽在飼料加工貯藏過程中極端情況下的抑菌穩定性，對其作為飼料添a.不同濃度Ca離子下抗菌肽對金黃色葡萄球菌相對抑菌率;b.不同濃度Ca離子下抗菌肽對大腸桿菌相對抑菌率；c.不同濃度 Na 離子下抗菌肽對金黃色葡萄球菌相對抑菌率;d.不同濃度Na離子下抗菌肽對大腸桿菌相對抑菌率加劑開發應用具有重大意義。本試驗以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌這兩種常見致病菌為指示菌，研究抗菌肽在生產儲存中可能遇到不同溫度、不同pH、不同濃度金屬離子等極端環境條件下，其抑菌能力的穩定性。不同溫度下抗菌肽可保持良好的抑菌活性，具有熱穩定性。不同 pH 對抗菌肽抑菌活性有顯著影響（ Plt;0.05， ，抗菌肽在偏酸性下表現出抑菌活性明顯高于強堿性環境，表明抗菌肽更適合在偏酸性環境中加工生產，在實際應用過程中要盡可能地避免改變抗菌肽的 pH ，以使其更好地發揮抑菌活性。抗菌肽抑菌活性與溶液中所含不同濃度的Ca²⁺ 、 Na⁺ 均有顯著性差異，高鹽環境可以引起抗菌肽抑菌活性降低。儲存時間對大腸桿菌相對抑菌率的影響要大于金黃色葡萄球菌，儲存12個月其相對抑菌率仍在 85% 以上。抗菌肽具有廣譜抑菌性，在生產、運輸儲存過程中應選擇合適的條件，以保證抗菌肽抑菌活性穩定，確保其在產品中能最大程度發揮抑菌效果。

圖4不同濃度金屬離子下抗菌肽的相對抑菌率

a.不同儲存時間下抗菌肽對金黃色葡萄球菌相對抑菌率;b.不同儲存時間下抗菌肽對大腸桿菌相對抑菌率

圖5不同儲存時間下抗菌肽的相對抑菌率

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（責任編輯屠晶）