鴨坦布蘇病毒E蛋白重組乳酸菌的構(gòu)建與鑒定

中圖分類號：S858.32 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1673-1085（2025）08-0001-07

鴨坦布蘇病毒病（DuckTembusuvirusdisease，DTMU）是由鴨坦布蘇病毒（DuckTembusuvirus，DTMUV）引起的一種以蛋鴨產(chǎn)蛋大幅下降，雛鴨和育成鴨出現(xiàn)頭頸震顫、四肢麻痹等神經(jīng)癥狀為主要特征的急性、烈性傳染病[1]。1995年，該病在我國河北等地發(fā)生，病鴨臨床表現(xiàn)為產(chǎn)蛋下降和神經(jīng)癥狀，因此將其病原稱為病毒性腦炎病毒[2]，2010年4月首次發(fā)生于我國部分東南沿海省份，之后在中國、河南等地區(qū)相繼出現(xiàn)[3。臨床上一旦出現(xiàn)病鴨，極易在短時間內(nèi)迅速蔓延至整個鴨群，發(fā)病率幾乎為 100%^[4] 。肉鴨和雛鴨感染后的死亡率為 10%～20% ，若發(fā)生繼發(fā)感染，死亡率會進(jìn)一步上升。DTMUV的主要傳播途徑為水平傳播，也可經(jīng)種蛋垂直傳播。本病全年都可發(fā)生，且夏季發(fā)病率顯著高于其他季節(jié)[5。近年來，DTMUV的檢出率為 40% 左右，嚴(yán)重威脅我國養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展。

DTMUV屬于黃病毒科黃病毒屬的RNA病毒，有三種基因型，我國流行的主要是TMUV2型和TMUV3型，其中TMUV2型流行最廣泛[7]。TMUV基因組為單股正鏈，長度約 11kb ，編碼結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白[8]。E蛋白作為病毒粒子表面的糖蛋白，不僅與病毒的吸附、穿入密切相關(guān)，還能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，是主要的免疫原性蛋白[。E基因長度為 1503bp ，編碼501個氨基酸，E蛋白分子量大小為 54.3kDa^[10] ，含有3個胞外結(jié)構(gòu)域EDI、EDⅡ、EDⅢ，這些結(jié)構(gòu)域在病毒毒力、神經(jīng)侵襲性、膜融合以及誘導(dǎo)中和抗體等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

乳酸菌作為益生菌，在改善腸道微生態(tài)環(huán)境方面具有重要作用。多數(shù)病原體經(jīng)黏膜入侵機(jī)體，而禽類腸道和鼻腔黏膜系統(tǒng)富含免疫細(xì)胞和組織。重組乳酸菌能被免疫細(xì)胞表面受體識別，并遞呈給特異性免疫細(xì)胞，啟動免疫應(yīng)答。局部黏膜免疫系統(tǒng)中，sIgA作為主要抗體，在腸道黏膜防御中發(fā)揮關(guān)鍵作用。已有研究表明，乳酸菌可阻斷微生物入侵，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生黏膜免疫，形成免疫防御屏障[12-13]。此外，乳酸菌遺傳操作技術(shù)成熟、操作簡便且具有可食用性，是表達(dá)外源基因的理想載體[14]。如，Steidler等[15]發(fā)現(xiàn)口服重組乳球菌分泌的IL-10可降低腸道通透性、改善腸道功能障礙并增強(qiáng)小鼠免疫功能Wang等[16]研究顯示，口服表達(dá)高致病性禽流感病毒蛋白血凝素HA1的乳酸桿菌，可提高小鼠黏膜中特異性抗HA-1IgA抗體和血清中IgG的產(chǎn)生，促進(jìn)脾臟T淋巴細(xì)胞增殖。

針對當(dāng)前坦布蘇病毒病免疫防控中現(xiàn)有疫苗存在免疫應(yīng)激和散毒等生物安全問題，本研究以TMUVE基因為基礎(chǔ)構(gòu)建重組乳酸菌載體，為開發(fā)新型疫苗提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1菌株、載體質(zhì)粒及試劑pMD19-T Simple質(zhì)粒購自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；NZ3900乳酸菌、NZ3900乳酸菌感受態(tài)細(xì)胞、pNZ8149質(zhì)粒購自長沙艾碧維生物科技有限公司；TMUV分離株SD 株由本實(shí)驗室保存。

本試驗所用試劑PrimeSTARHS（Premix）、一步法RT-PCR試劑盒、RNA提取試劑盒、DNAMarker購自TAKARA；縫克隆試劑盒購自TransGenBiotech；質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司； 10% ExpressCast PAGE、 5× 蛋白上樣緩沖液購自蘇州新賽美公司；DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技股份有限公司；Nisin購自Sigma;M17培養(yǎng)基購自海博生物技術(shù)有限公司。1.1.2主要培養(yǎng)基的配制 20% Glucose儲存液：稱取 20g 葡萄糖，溶于 100mL 去離子水，經(jīng) 0.22μm 濾器過濾除菌，儲存于 4‰ 冰箱。

GM17固體培養(yǎng)基：稱取 4.225g 商品化M17培養(yǎng)基、 1.5g 瓊脂粉，置于錐形瓶中，加入 100mL 去離子水，攪拌溶解后用 1mol/L NaOH或 1mol/L HC1溶液調(diào)節(jié) 至7.0。培養(yǎng)基在 、 103.4kPa 條件下高壓滅菌 20min ，待冷卻至50～60℃時，加入 2.5mL20% Glucose儲存液，搖勻后倒入培養(yǎng)皿備用。

GM17-MC恢復(fù)培養(yǎng)基：分別稱取 4.0g 商品化M17培養(yǎng)基、 0.19gMgCl₂ 、 0.02gCaCl₂ ，加入100mL 去離子水?dāng)嚢杈鶆颉＝?jīng) 、 103.4kPa 高壓滅菌 20min ，冷卻至50～60℃時，加入 7.5mL 20% Glucose 儲存液。

Elliker培養(yǎng)基：稱取 _2g 胰蛋白脈、 0.15g 無水乙酸鈉、 0.05g 抗壞血酸、 0.4g 氯化鈉、 0.5g 酵母提取物、 1.5g 瓊脂粉，加入 93.8mL 去離子水?dāng)嚢枞芙猓?21℃、 103.4kPa 高壓滅菌 20min 。1.1.3引物設(shè)計根據(jù)GenBank中收錄的TMUVE基因序列，利用Oligo6.0軟件設(shè)計引物擴(kuò)增E基因全長。引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成，序列如下：

TMUV-E-F：

5’-TTCAGCTGTCTGGGGATGCAGA-3' TMUV-E-R：

5’-GGCATTGACATTTACTGCCAGG-3'

1.2試驗方法

1.2.1TMUVE基因的擴(kuò)增與純化取本實(shí)驗室保存的TMUV分離株SD株，按照RNA提取試劑盒說明書提取病毒RNA。將提取的RNA加人RT-PCR擴(kuò)增體系，反應(yīng)體系如表1所示。

表1RT-PCR反應(yīng)體系

表2連接體系

PCR反應(yīng)程序為： 50‰ 反轉(zhuǎn)錄 30min ， 94^°C 預(yù)變性 2min ，94℃變性 30s ， 退火 30s 延伸 2min ，共進(jìn)行32個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行 1% 瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)束后，在凝膠成像系統(tǒng)紫下觀察是否出現(xiàn)目的條帶。按照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書對PCR目的條帶進(jìn)行膠回收純化。

1.2.2pMD19-TMUV-E質(zhì)粒構(gòu)建 將純化的PCR產(chǎn)物于微量離心管中配制連接反應(yīng)液，反應(yīng)體系如表2所示。

將反應(yīng)液混勻后，16℃反應(yīng) 2h 。連接產(chǎn)物加入DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含氨芐青霉素的LB瓊脂平板， 培養(yǎng)過夜。次日挑取單克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)菌液PCR鑒定為陽性后，送至北京擎科生物科技股份有限公司測序。將測序結(jié)果陽性的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，次日提取質(zhì)粒，經(jīng)測序鑒定正確后，保存于 。

1.2.3重組乳酸菌載體pNZ8149-E-His/NZ3900的構(gòu)建取1.2.2保存的質(zhì)粒為模板，設(shè)計引物分別對pNZ8149與E基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列如表3所示。

表3引物序列

PCR擴(kuò)增體系為：PrimeSTARHS（Premix）25μL ，上游引物F1μL，下游引物R1μL，質(zhì)粒DNA模板 1μL ，RNase Free ddH₂O 22μL 。混勻后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)步驟為：98℃變性 20s ， 退火 延伸 2min ，共進(jìn)行30個循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，按照試劑說明書對各片段進(jìn)行純化回收。

利用無縫克隆試劑盒，將純化回收的目的片段和載體片段進(jìn)行同源重組，反應(yīng)體系見表4所示。將配制好的體系放入PCR管中，50℃反應(yīng)15min ，反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)物立即用于乳酸菌的轉(zhuǎn)化。

表4同源重組反應(yīng)體系

1.2.4 重組乳酸菌pNZ8149-E/NZ3900的電轉(zhuǎn)化從 冰箱取出NZ3900乳酸菌感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍 10min 。取1.2.3反應(yīng)后的同源重組產(chǎn)物加入感受態(tài)細(xì)胞，混合均勻后轉(zhuǎn)移至電擊杯底部。在電壓 2200V 、固定電阻 200Ω 、電容 25μF 的電擊條件下進(jìn)行電擊處理。電擊結(jié)束后迅速加入 950μL 預(yù)冷的GM17-MC恢復(fù)培養(yǎng)基， 培養(yǎng) 2h （20 5000rpm 離心 5min ，棄掉上清液，將菌體沉淀涂布EIliker固體培養(yǎng)基， 48h 后觀察菌落生長情況。從EIliker固體培養(yǎng)基上挑取單個菌落，接種在預(yù)冷的GM17液體培養(yǎng)基， 恒溫培養(yǎng)24h 。將菌液進(jìn)行PCR鑒定，對結(jié)果顯示為陽性的菌液進(jìn)行測序。將測序正確的陽性菌液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，即在 5mL GM17液體培養(yǎng)基中， 靜置培養(yǎng) ^18h 。擴(kuò)大培養(yǎng)后按照質(zhì)粒提取說明書提取質(zhì)粒。

1.2.5重組乳酸菌pNZ8149-E/NZ3900的表達(dá)鑒定在 10mL GM17液體培養(yǎng)基中接種pNZ8149-TMUV-E/NZ3900陽性重組乳酸菌， 培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入終濃度為 10ng/mL 的誘導(dǎo)劑nisin，添加比例為 1：1000 ， 恒溫箱繼續(xù)培養(yǎng)7h 。誘導(dǎo)結(jié)束后，將菌液在 、 4000r/min 條件下離心 10min ，棄掉上清，PBS緩沖液重懸菌體，重復(fù)3次。使用超聲破碎儀破碎重懸產(chǎn)物，將 6μL5× 蛋白上樣緩沖液分別與 24μL 上清樣品、 24μL 沉淀樣品混合均勻，煮沸約 10min ，制備SDS-PAGE電泳樣品。

使用彩色凝膠快速試劑盒，按照說明書分別配制下層膠與上層膠。配膠完成后插入梳子，置于 培養(yǎng)箱內(nèi)，待上層膠凝固后，拔下梳子，加入樣品。在 1× Tris-Glycine SDS電泳緩沖液中，將電泳儀電壓調(diào)整為 150V 進(jìn)行電泳。當(dāng)溴酚藍(lán)遷移至凝膠底部時，結(jié)束電泳。電泳結(jié)束后將凝膠塊放入考馬斯亮藍(lán)染色液中染色 2h ，取出后脫色 ^10h ，直至呈現(xiàn)清晰條帶。使用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照保存圖像。

2試驗結(jié)果

2.1TMUVE基因的擴(kuò)增結(jié)果

TMUVE基因PCR擴(kuò)增后，經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳分析，擴(kuò)增得到的目的片段為 1 503bp 與預(yù)期相符，結(jié)果見圖1。

圖1 TMUVE基因擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳

2.2TMUVE基因與pNZ8149質(zhì)粒同源重組鑒定 結(jié)果

PCR擴(kuò)增E基因片段與載體序列，結(jié)果如見圖2，載體片段為 2600bp ，目的片段大小為1503bp 。

2.3重組乳酸菌載體pNZ8149-E的電轉(zhuǎn)化鑒定

pNZ8149-TMUV-E-His重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至NZ3900感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)復(fù)蘇后，將菌液涂布于Elliker固體平板進(jìn)行初篩，可觀察到明顯白色單菌落，見圖3。

2.4 重組乳酸菌載體pNZ8149-E/NZ3900的測序鑒定

提取pNZ8149-TMUV-E/NZ3900重組乳酸菌質(zhì)粒進(jìn)行測序，經(jīng)序列比對，表明重組乳酸菌載體pNZ8149-TMUV-E/NZ3900構(gòu)建成功，見圖4。2.5重組乳酸菌載體pNZ8149-E-His的SDS-PAGE分析結(jié)果將未誘導(dǎo)、誘導(dǎo)后的樣品分別SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色、脫色后分析。結(jié)果見圖5，約在 56kD 位置出現(xiàn)明顯的蛋白條帶，同預(yù)期相符合，表明重組蛋白成功表達(dá)。

圖2PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

圖3EIliker固體平板菌落（詳見附錄彩圖）

注：M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：pNZ8149載體片段；2：TMUVE基因片段。

圖4pNZ8149-TMUV-E-His重組質(zhì)粒測序比對圖（詳見附錄彩圖）

圖5 SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果（詳見附錄彩圖）

注：M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：誘導(dǎo)前樣品；2：誘導(dǎo)后樣品。

3討論與結(jié)論

鴨坦布蘇病毒病是由鴨坦布蘇病毒引起的以神經(jīng)系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)為特征癥狀的傳染性疾病，臨床表現(xiàn)主要為共濟(jì)失調(diào)及產(chǎn)蛋量下降。鴨坦布蘇病毒具有非常廣泛的宿主譜系，已有研究表明，DTMUV存在感染人類的潛在風(fēng)險[7]，這一特性使其對公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了潛在威脅。因此，研發(fā)安全且高效的新型疫苗，對于防控鴨坦布蘇病毒病至關(guān)重要。

E蛋白作為TMUV的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，在病毒感染宿主細(xì)胞的過程中發(fā)揮著核心作用，與病毒吸附宿主細(xì)胞及病毒毒力有關(guān)，其表面的抗原表位能夠激活機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[18]，因此E蛋白成為鴨坦布蘇病毒疫苗領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[19-20]。乳酸菌主要通過在機(jī)體腸道內(nèi)定植來改善腸道微生態(tài)環(huán)境，具有免疫調(diào)節(jié)活性、維持腸道內(nèi)菌群平衡、促進(jìn)生長發(fā)育等功能。研究顯示，乳酸菌可作為外源蛋白的遞送載體，可以解決口服藥用蛋白載體易在消化道中發(fā)生水解的問題，同時也可刺激機(jī)體產(chǎn)生黏膜免疫，形成局部免疫屏障，現(xiàn)已成為畜禽飼料添加劑與微生態(tài)制劑研究的熱點(diǎn)。

本研究利用同源重組技術(shù)，將E基因重組至乳酸菌載體pNZ8149中，并電轉(zhuǎn)至乳酸菌NZ3900，經(jīng)試驗驗證，pNZ8149-TMUV-E/NZ3900重組乳酸菌載體構(gòu)建成功，并可正常表達(dá)。該重組乳酸菌構(gòu)建成功，不僅可減少免疫過程中的應(yīng)激，同時還可刺激機(jī)體產(chǎn)生黏膜免疫反應(yīng)，為后續(xù)動物免疫保護(hù)試驗奠定基礎(chǔ)，對鴨坦布蘇病毒防控具有重要的意義。

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Abstract：TheE protein isanenvelope protein located on the surface of the duck Tembusu virus （TMUV）and serves as its primary antigenic protein.To construct recombinant lactic acid bacteria （LAB） expressing the TMUV E protein，this study first amplified and purified the fulllengthE gene by comparing it with the DTMUV E gene sequences available in GenBank.A recombinant cloning vector，pMD19-T-E，was successfully constructed.Using the pMD19- T-E recombinant vector as a template，the pNZ8149-TMUV-E/NZ3900 LAB expression vector was developed through homologous recombination.Both bacterial colony PCR and sequencing confirmed the successful construction of the pNZ8149-TMUV-E recombinant LAB expression vector.SDS-PAGE analyses further demonstrated that the recombinant LAB pNZ8149-TMUV-E efficiently expressed the E protein.In conclusion，this study successfully engineered recombinant LAB capable of expressing the duck Tembusu virus E protein，laying a foundation for the future developmentof novel vaccinesagainst TMUV infection.

Keywords：Duck tembusu virus;E protein;Lactic acid bacteria