響應(yīng)面法優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵提取枇杷花中槲皮素工藝

摘要：本文以江西地區(qū)的枇杷花為原材料進(jìn)行青霉菌Penicillium固態(tài)發(fā)酵，優(yōu)選出江西枇杷花固態(tài)發(fā)酵的最佳工藝。本試驗(yàn)以槲皮素含量為因變量，采用響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件。根據(jù)所建模型得到發(fā)酵枇杷花的最佳工藝為溫度30.15℃，時間6 d，接種量5.73 mL，槲皮素預(yù)計(jì)含量為40.05 mg·g-1，在此基礎(chǔ)上調(diào)整發(fā)酵參數(shù)，實(shí)際含量為39.62 mg·g-1，與預(yù)測值相近。結(jié)果表明響應(yīng)面法優(yōu)化枇杷花發(fā)酵工藝合理，為該藥材的開發(fā)和利用提供參考。

關(guān)鍵詞：枇杷花；槲皮素；青霉菌；發(fā)酵工藝；響應(yīng)面法

枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）為薔薇科枇杷屬植物，枇杷花包括花及花蕾，花蕾被淺棕色或黃色絨毛，花味淡雅清香，花期長、花量大[1-2]。枇杷樹的80%～90%枝條都可形成花穗，并且單支花穗上花朵數(shù)為

70～260朵，其中僅有5%～20%的花可結(jié)成果實(shí)，30%～50%的花穗因疏花保果而被浪費(fèi)[3]。根據(jù)《本草綱目》記載，枇杷的葉、花等均可以入藥[4]，枇杷花富含類黃酮、類胡蘿卜素、三萜類等營養(yǎng)成分，姜帆等[5]篩選國內(nèi)外代表性枇杷種質(zhì)55份，采用分光光度法測定花中黃酮含量，發(fā)現(xiàn)不同枇杷種質(zhì)之間黃酮含有量在0.44%～2.28%，黃酮含量分布在0.98%～1.23%的種質(zhì)較多。

1 材料及設(shè)備

枇杷花（江西）；青霉菌（由桂林醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)院病原微生物實(shí)驗(yàn)室分離篩選）；槲皮素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號100081，含量99.1 %）；甲醇為色譜純，水為超純水；蔡氏培養(yǎng)基（上海博微生物科技有限公司）；分析天平（上海精天電子儀器廠）；高速多功能粉碎機(jī)（永康市鉑歐五金制品有限公司）；高效液相色譜儀（島津LC-20A，島津企業(yè)管理有限公司）；恒溫振蕩器（韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司）。

2 方法

2.1 種子液的制備

將菌種接種到斜面蔡氏培養(yǎng)基上，30℃恒溫條件下培養(yǎng)4～6 d，加入無菌水充分刮下孢子，制備孢子懸浮液，裝有100 mL種子液培養(yǎng)基的錐形瓶中，在30℃、160 r/min溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，得到種子液。

2.2 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)

將枇杷花干燥粉碎（過100目篩），稱取5 g枇杷花粉末，放入250 mL錐形瓶中，加入一定量的無機(jī)鹽蔡氏培養(yǎng)基，混合均勻，121℃高壓滅菌30 min。在無菌條件下，接入一定量的種子液后放于恒溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)一定時間。

2.3 槲皮素含量的測定

2.3.1 色譜條件

色譜柱：InterSustain C18（4.6×150 mL，5 μm），柱溫30℃，流速1 mL/min，檢測波長365 nm，進(jìn)樣量20 μL，流動相∶甲醇-水（60∶40）。

2.3.2 槲皮素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精準(zhǔn)稱取槲皮素對照品5 mL/g于50 mL容量瓶中，加色譜甲醇溶解，定容至刻度線，充分搖勻后置于4℃冰箱備用。精確稱量0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL上述對照品溶液分別置于5 mL容量瓶中，用色譜甲醇定容。按上述色譜條件進(jìn)樣并測定峰面積。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，槲皮素在2～12μg/mL呈良好的線性關(guān)系，回歸方程：Y=173.74X-106.53，R2=0.9997。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

選擇發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、接種量3個因素為自變量，槲皮素含量為響應(yīng)值。根據(jù)Box-Benhnken設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面法分析試驗(yàn)，因素水平設(shè)計(jì)見表1。采用Design Expert 8.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出最佳發(fā)酵工藝，試驗(yàn)重復(fù)3次。

3 結(jié)果與分析

3.1 響應(yīng)面結(jié)果與分析

3.1.1 回歸方程的建立與分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以發(fā)酵溫度、時間、接種量作為主要因素，根據(jù)BOX-Behnkendesign設(shè)計(jì)原理，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果見表2。利用Design-Expert8.0軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次元回歸分析，可得出影響因素的關(guān)聯(lián)方程，多元回歸擬合分析得到模型的擬合方程為Y=+39.15+0.47A+0.52B+2.13C－0.20AB+0.26AC+0.27BC－2.92A2－0.71B2+0.48C2。

由表3可知：回歸方程顯著（P模型lt;0.05），失擬項(xiàng)不顯著（Pgt;0.05），表明試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械亩?xiàng)式方程較符合實(shí)際發(fā)酵情況，較好反映了發(fā)酵溫度、時間、接種量對槲皮素含量的交互作用具有高度顯著影響。

3.1.2 響應(yīng)面交互作用分析

圖1顯示在發(fā)酵溫度和時間處于中間水平時槲皮素含量達(dá)到最大值。圖2顯示在發(fā)酵溫度和接種量處于中間水平時槲皮素含量達(dá)到最大值。圖3顯示在時間和接種量中間槲皮素含量達(dá)到最大值。

3.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)Box-Behnken優(yōu)化試驗(yàn)和回歸模型分析，得出枇杷花最佳發(fā)酵條件為接種量5.73 mL、發(fā)酵溫度30.15℃、發(fā)酵時間6 d，在此優(yōu)化條件下槲皮素含量預(yù)計(jì)為40.05 mg·g-1。

4 討論

為了獲得最佳發(fā)酵工藝，本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法，與傳統(tǒng)優(yōu)化方法相比，響應(yīng)面法能通過直觀、精準(zhǔn)度較高的數(shù)學(xué)模型對最佳工藝進(jìn)行優(yōu)化，將因素和結(jié)果的關(guān)系進(jìn)行多項(xiàng)式擬合，優(yōu)化出最佳青霉菌固態(tài)發(fā)酵枇杷花轉(zhuǎn)化槲皮素的發(fā)酵工藝，為了便于試驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上調(diào)整發(fā)酵參數(shù)，最佳發(fā)酵工藝為接種量6 mL、發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵時間6 d，此條件下槲皮素含量為39.62 mg·g-1。該試驗(yàn)建立的數(shù)學(xué)模型可靠、合理，提高了工作效率，而且為進(jìn)一步開發(fā)枇杷花提取槲皮素提供了參考。

參考文獻(xiàn)

[1] 應(yīng)躍躍，張蕾蕾，王喜周.枇杷花利用價(jià)值和產(chǎn)品的綜合開發(fā)[J].現(xiàn)代園藝，2013（8）：171-172.

[2] 郭文場，劉佳賀，李悅.中國枇杷屬種質(zhì)資源、品種和栽培管理（1）[J].特種經(jīng)濟(jì)動植物，2017，20（9）：49-52.

[3] 文衛(wèi)華.枇杷疏花疏果技術(shù)及對產(chǎn)量品質(zhì)影響研究[J].湖南林業(yè)科技，2007，34（6）：17-19.

[4] 楊必坤.枇杷花藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[D].成都：四川師范大學(xué)，2010.

[5] 姜帆，周丹蓉，高慧穎，等.枇杷種質(zhì)花中黃酮含量分析與評價(jià)[J].植物遺傳資學(xué)報(bào)，2016，17（6）：1031-1035.