梨火疫病生防復合菌的篩選及發(fā)酵工藝優(yōu)化

庫爾勒香梨，簡稱香梨（Pyrussinkiangen-sis），在新疆栽培長達 1400a ，享譽國內(nèi)外，是新疆地理標志產(chǎn)品，也是庫爾勒及阿克蘇等地的經(jīng)濟支柱，具有強大的品牌效應(yīng)和市場競爭力，是新疆特色林果產(chǎn)業(yè)不可或缺的重要組成部分[1]。在當前的香梨種植過程中，多種病害接連不斷地出現(xiàn)，已經(jīng)嚴重影響到生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量[2]。梨火疫病是一種毀滅性的梨樹病害[3]，2016、2017年新疆伊犁、巴州等地相繼發(fā)生并迅速爆發(fā)流行，導致大批梨樹被砍，果園被毀，對香梨產(chǎn)業(yè)造成重創(chuàng)，并迅速向疆內(nèi)外擴散，對新疆乃至全國林果業(yè)帶來了巨大威脅和風險[4」。

目前，梨火疫病的防治在生產(chǎn)中主要依賴于化學農(nóng)藥，然而過度使用農(nóng)藥易導致果實中農(nóng)藥殘留超標，對消費者的健康帶來潛在風險，且易引發(fā)環(huán)境污染，破壞生態(tài)系統(tǒng)的平衡，長期使用農(nóng)藥容易導致病原菌產(chǎn)生抗藥性，從而增加防治的難度，形成惡性循環(huán)[5]。因此，尋求更加環(huán)保和可持續(xù)的梨火疫病防治方法顯得尤為迫切。

生物防治相較于化學防治在環(huán)保、安全性、持久性和維護生態(tài)平衡等方面具有顯著優(yōu)勢，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，生防菌的應(yīng)用逐漸走入市場，生防菌對植物病害的防病機制主要包括產(chǎn)生抗菌物質(zhì)、營養(yǎng)與空間競爭、溶菌作用以及誘導抗病性等多種方式，從而有效達到防治植物病害的目的[。大量研究表明，大多數(shù)芽孢桿菌因其良好的拮抗作用和對多種病原體的高效防控能力而成為生物防治的研究熱點[7-8]。然而單一菌株具有功能單一、防效不穩(wěn)定等現(xiàn)象，復合菌群能更好地適應(yīng)各種環(huán)境，在功能上也可以相互補充，作為生防菌具有更好的應(yīng)用效果[9-12]

生防菌在田間受到多種因素影響，發(fā)酵后的生防菌通常具有更好的生物相容性和適應(yīng)性，這使得它們在土壤或植物表面的定殖能力更強，從而有效提高防治效果，經(jīng)過發(fā)酵的生防菌，其代謝產(chǎn)物往往具有較好的穩(wěn)定性，這使其在存儲和運輸過程中不易失效。碳源、氮源是微生物生長的主要能源，不同類型的碳氮源在能量釋放和代謝途徑上存在顯著差異，這使得碳源的篩選成為發(fā)酵工藝優(yōu)化的重要步驟。無機鹽在發(fā)酵過程中參與細胞的滲透調(diào)節(jié)和代謝平衡，對微生物的生長和產(chǎn)物合成產(chǎn)生影響。適宜的溫度和pH不僅能提高菌株生長速率，還能提高菌株的穩(wěn)定性及活性，合適的轉(zhuǎn)速能夠增強氧氣的溶解和微生物的代謝功能。

為篩選出更多優(yōu)良的梨火疫病生防細菌資源，該研究從南疆鹽堿地采集土壤樣品，結(jié)合新疆特殊環(huán)境微生物重點實驗室前期篩選得到的1株具有廣譜抑菌效果的菌株貝萊斯芽孢桿菌JS6-1^[13] ，進行梨火疫病生防細菌的篩選及盆栽防效測定，通過對生防細菌進行促生性能研究及盆栽促生分析，篩選得到促生性能優(yōu)良的生防細菌，將防效優(yōu)良的生防細菌與促生性能優(yōu)良的生防細菌復配得到梨火疫病生防復合菌，并通過盆栽防效測試，系統(tǒng)評估該復合菌對梨火疫病的防效，從而達到生物防治以及促進植物生長的功效。以LB肉湯為初始發(fā)酵培養(yǎng)基，通過單因素篩選的方式，基于發(fā)酵液 OD_600nm 篩選碳源、氮源、無機鹽、溫度、 pH 、轉(zhuǎn)速，從而提高發(fā)酵效率及發(fā)酵液濃度。

1材料與方法

1.1 試驗材料

供試病原菌：梨火疫病菌Ea-1（Erwinia.amylovora），由從庫爾勒梨火疫病發(fā)病香梨樹分離、鑒定并保存。

供試生防細菌：JS6-1菌株，為新疆特殊環(huán)境微生物重點實驗室（以下簡稱本實驗室）前期從南疆鹽堿地土壤篩選獲得并保存，經(jīng)試驗測定對梨火疫病菌及多種病原真菌有廣譜性的抑菌效果[13]

供試培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂（NutrientAgar，NA）培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯（NutrientBroth，NB）培養(yǎng)基、LB（LBBroth）培養(yǎng)基，購自北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、PCR反應(yīng)試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；固氮菌改良阿須貝氏培養(yǎng)基（Ashby）、有機磷固體培養(yǎng)基、無機磷固體培養(yǎng)基，北京酷來搏科技有限公司；亞歷山鮑羅夫固體培養(yǎng)基，山東拓普生物工程有限公司；CAS檢測培養(yǎng)基、蛋白脈水液體培養(yǎng)基（蛋白陳 10.0g/L，NaCl10.0g/L） ：葡萄糖蛋白脈水培養(yǎng)基（葡萄糖 5g/L ，蛋白陳5.8g/L，KH₂PO₄2g/L） 。

供試試劑：甲基紅MethylRed（S19031-25g），上海源葉生物科技有限公司；剛果紅GongoRed（DI0181-100g） ，天津永晟精細化工有限公司；2-（1-甲基胍基）乙酸（ （BD122358-25g） ，上海畢得醫(yī)藥科技股份有限公司； 10×CAS 檢測液（PM0821-2-100mL） ，上海金畔生物科技有限公司；Nessler試劑 （N823303-10mL ），上海麥克林生化科技股份有限公司；Salkowskis比色液（PH1941-50mL ），飛凈生物科技有限公司；革蘭氏染色試劑盒（G1060）、細菌基因組DNA提取試劑盒（D1600），北京索萊寶科技有限公司。

供試儀器：PCR擴增儀（BiometraTAd-vanced）、紫外分光光度計（SPECORD210）、PCR擴增儀（BiometraTAdvanced）德國耶拿分析儀器股份公司；凝膠成像系統(tǒng)（GelDocGO），Bio-Rad伯樂；全波長酶標儀（Epoch2），美國伯騰儀器有限公司。

供試土壤樣品：從南疆鹽堿地采集土壤樣品33份。

供試植株：香梨砧木—杜梨（Pyrusbetulaefolia）。

1.2方法

1.2.1土壤細菌的分離和純化將 5g 土壤樣品加人裝有 45mL 無菌水的 500mL 錐形瓶中，置于 ） 180r/min 搖床，振蕩培養(yǎng) 30min ，稀釋至 10^-3?10^-4 ，取 0.1mL 分別涂布于NA培養(yǎng)基上，置于 恒溫箱中培養(yǎng) 2～3d ，取出培養(yǎng)基，用竹簽挑取形態(tài)不同的單菌落于NA培養(yǎng)基，用平板劃線法對其進行分離純化。

1.2.2生防細菌的篩選梨火疫病菌種子液制備：挑取病原菌Ea-1單菌落接種于 100mL NB培養(yǎng)基中，置于 搖床，振蕩培養(yǎng)^18h ，用 g_mL 試管無菌水稀釋至 10⁵CFU/mL 取 100μL 涂布于NA平板。

生防細菌種子液制備：挑取單菌落接種于100mL NB培養(yǎng)基中，置于 37°C?180r/min 搖床，振蕩培養(yǎng) ^18h 。

生防細菌的初篩：將“1.2.1\"中分離純化得到的菌株點接至上述含病原菌Ea-1的NA平板，28^°C 培養(yǎng) 24～48h ，對產(chǎn)生抑菌圈的菌株采用三區(qū)劃線法進行甘油管保藏，測量抑菌圈直徑和菌落直徑，以抑菌圈直徑（ D ）與菌落直徑（d）的比值 （D/d ）代表抑菌能力。

生防細菌的復篩：利用打孔抑菌圈法對初篩獲得的生防細菌及新疆特殊環(huán)境微生物重點實驗室已有的JS6-1進行復篩，用打孔器（直徑 g_mm. ）在涂布了 100μL 病原菌 （10⁵CFU/mL ）的NA平板上打孔，每板打6個孔，每個孔滴入 50μL 生防細菌種子液，重復3次， 培養(yǎng) 24～48h ，測量抑菌圈直徑。

1.2.3生防細菌鑒定形態(tài)學鑒定：通過平板劃線法得到單菌落，觀察生防細菌形態(tài)，并對其進行染色鏡檢。

分子測序鑒定：生防細菌種子液制備同“1.2.2”，采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，步驟嚴格按照試劑盒操作說明進行。用細菌16SrRNA基因通用引物27F（ 5^′. AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3^′ ） .1492R（5^′- CGGTTACCTTGTTACGACTTC- 3^′ ）進行PCR擴增， 50μL 體系[14]詳見表1。循環(huán)條件為： 94^°C 變性 退火 30s，72^°C 延伸 45s，35 個循環(huán)， 72°C 保持 7min ，PCR擴增后使用 10g/L 瓊脂糖（ 10g 瓊脂糖， 1L1×TAE 凝膠進行電泳檢測，送至生工生物工程股份有限公司測序。所得序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫比對[15]。

表1PCR反應(yīng)體系Table1ReactionsystemofPCR

1.2.4生防細菌對梨火疫病的室內(nèi)防效測定梨火疫病菌、生防細菌種子液制備同“1.2.2”，將病原菌Ea-1和生防細菌菌液均稀釋5倍（約為10⁸CFU/mL） 。

杜梨苗為本實驗室自行培育，催芽后進行播種 （基質(zhì)：土：蛭石 =7：2：1] ，待生長至2月齡，進行預防性試驗，每個處理設(shè)置12盆重復。每盆杜梨苗接種生防細菌菌液（ 10⁸ CFU/mL），3d后接種病原菌 （10⁸CFU/mL） ，設(shè)置只噴施病原菌 （10⁸CFU/mL） 為對照，用手持式壓力噴壺將種子液噴至葉片與枝條完全濕潤。

接種病原菌后采用棚布遮蓋保濕。發(fā)病后每天觀察發(fā)病情況，統(tǒng)計每盆杜梨苗枝條數(shù)、葉片數(shù)，待枝條出現(xiàn)發(fā)病癥狀，逐一進行統(tǒng)計。病斑長度 ?1/3 枝條長度，計為1級； 1/3 枝條長度 lt; 病斑長度 ?2/3 枝條長度，計為3級；病斑長度 gt;2/3 枝條長度，計為5級[16]。并計算病情指數(shù)、防效值。

病情指數(shù) =Σ （每處理各級病枝數(shù) x 該病級數(shù)）/該處理總枝數(shù) ×5 （最高病級）] ×100

防效 Λ=（CK 病情指數(shù)一處理病情指數(shù)）/CK病情指數(shù) ×100%

1.2.5生防細菌促生性能檢測菌株固氮能力測定：將純化后的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，于 搖床培養(yǎng) 24h ，取 5μL 菌液接種于阿須貝固氮培養(yǎng)基，每株菌重復接種3次，并于 恒溫條件下培養(yǎng)3d，觀察菌株生長情況。若菌株正常生長，則判斷其具有固氮能。菌株產(chǎn) NH₃ 能力測定：將菌株純化后接種于裝有10mL 蛋白陳水液體培養(yǎng)基的試管中， 37^°C.180 r/min 搖床培養(yǎng) ^48h 后加人 0.5mL Nessler試劑，有黃褐色沉淀出現(xiàn)，則表明其具有產(chǎn) NH₃ 能力。菌株解磷、解鉀產(chǎn)鐵載體能力：將純化后菌株接種于有機磷培養(yǎng)基、無機磷培養(yǎng)基、亞歷山鮑羅夫培養(yǎng)基、CAS檢測培養(yǎng)基中央， 倒置培養(yǎng)3～5d ，觀察菌落周圍是否有光圈產(chǎn)生，若有光圈則為陽性，若無光圈則為陰。菌株分泌吲哚乙酸（IAA）能力測定：將菌株調(diào)節(jié)為 OD_600nm 為1.0的菌懸液，按 1%（V/V） 接種量接種到含L-色氨酸（ 100mg/L） 的LB液體培養(yǎng)基中。于 37^°C，180 r/min 的條件下，持續(xù)培養(yǎng) 2d 。取 5mL 菌懸液加入 5mL 50mg/L 的Salkowski比色液。將未接菌的LB液體培養(yǎng)基加入等量比色液作陽性對照。于避光環(huán)境內(nèi)靜置 30min 后觀察。如果溶液變紅，則表明菌株能夠分泌 IAA^[17] 。

1.2.6生防細菌促生效果研究發(fā)芽促生試驗：生防細菌種子液制備同“1.2.2”，挑取飽滿的種子用 3% NaClO浸泡處理 10min ，隨后用無菌水攪動沖洗8次[18]。將清洗后的種子放人燒杯（每種處理各一個燒杯），每種處理90顆。將振蕩后的菌液取出并稀釋5倍（約為 10⁸CFU/mL ，分別倒入對應(yīng)燒杯，設(shè)置稀釋后的空白培養(yǎng)基對照（CK），浸泡 ⁴h 后將種子均勻攤開在鋪有紗布的種子發(fā)芽盒中，每個種子發(fā)芽盒30顆種子，每種處理3個重復。控制生長環(huán)境一致，第7天對種子進行發(fā)芽率、芽長進行測定分析。

穴盤促生試驗：將上述發(fā)芽的種子挑出，每個處理取8顆芽長一致（約 0.1mm ）的種子播入穴盤。生防細菌種子液制備同“1.2.2”，稀釋5倍（約為 10⁸CFU/mL） ，用手持式壓力噴霧器將菌液噴霧至葉片與枝條完全濕潤，第7天統(tǒng)計出苗率、苗高、根長、葉片數(shù)。

1.2.7梨火疫病生防復合菌復配及室內(nèi)防效測定將“1.2.4\"室內(nèi)防效篩選得到的防效最佳的菌株與“1.2.6”促生試驗篩選得到的促生效果最佳的菌株進行復配，并通過盆栽杜梨對其進行室內(nèi)防效測定，方法及計算公式同“1.2.4”。

1.2.8復合菌發(fā)酵工藝優(yōu)化制備生防細菌JS6-1、Z32-3種子液方法同“1.2.2\"種子液，初始發(fā)酵培養(yǎng)基選擇LB肉湯（蛋白陳 10g/L ，酵母膏5g/L，NaCl10g/L） ，通過單因素篩選進行優(yōu)化[19]。

碳源篩選：添加 10g/L 不同碳源（葡萄糖、蔗糖、糖蜜、白砂糖、乳糖、可溶性淀粉），滅菌后按1% 的比例接種JS6-1、Z32-3種子液，發(fā)酵初始條件為初始培養(yǎng)基 pH ，裝液量為 250mL 規(guī)格錐形瓶裝液量為 100mL ，在 28°C?180r/min 條件下振蕩培養(yǎng)2d，通過紫外分光光度法測發(fā)酵液OD_600nm 檢測發(fā)酵液濃度。

氮源篩選：添加 10g/L 不同氮源（酵母膏、牛肉浸粉、蛋白肺、大豆蛋白脈）滅菌后按 1% 的比例接種JS6-1、Z32-3種子液，發(fā)酵液濃度檢測方式及發(fā)酵初始條件同碳源篩選。

碳氮比篩選：將上述篩選得到的碳氮源按照表2配比添加入初始發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌后按 1% 的比例接種JS6-1、Z32-3種子液，發(fā)酵液濃度檢測方式及發(fā)酵初始條件同碳源篩選。

無機鹽篩選：將上述篩選得到的碳氮源及配比添加 0. 5g/L 不同無機鹽（ NaCl 、KCL、K₂HPO₄ 、 Na₂HPO₄ ： 12H₂O 、 FeCl₂ 、 MnCl₂ 、KH₂PO₄ （20 .MgSO₄?7H₂O，F(xiàn)eSO₄?7H₂O） 滅菌后按 1% 的比例接種JS6-1、Z32-3種子液，發(fā)酵液濃度檢測方式及發(fā)酵初始條件同碳源篩選。

pH 篩選：將上述優(yōu)化后的培養(yǎng)基配制成5個 pH 梯度，滅菌后再次檢測培養(yǎng)基 ΔpH ，將滅菌后培養(yǎng)基 ΔpH 分別調(diào)整為：3、5、7、9、11，確認 ΔpH 不受高溫滅菌影響后按 1% 的比例接種JS6-1、

Z32-3種子液。發(fā)酵液濃度檢測方式及發(fā)酵初始條件同碳源篩選。

溫度篩選：按照上述篩選得到的配方及pH配制搖瓶，滅菌后按 1% 的比例接種JS6-1、Z32-3種子液，置于不同溫度的搖床（28、30、33、35、37、40，45，50^°C 發(fā)酵，發(fā)酵液濃度檢測方式及發(fā)酵初始條件同碳源篩選。

轉(zhuǎn)速篩選：發(fā)酵搖瓶制備同上，滅菌后按 1% 的比例接種JS6-1、Z32-3種子液，置于不同轉(zhuǎn)速的搖床 （100，120，140，160，180，200r/min） 發(fā)酵，搖床溫度設(shè)置成上述篩選得到的溫度，發(fā)酵液濃度檢測方式及發(fā)酵初始條件同碳源篩選。

表2碳氮比設(shè)置

Table2 Carbon to nitrogen ratio settings

1.2.9發(fā)酵工藝優(yōu)化前后對比制備生防細菌JS6-1、Z32-3種子液方法同“1.2.2”， 1% 接種量接至“1.2.8\"篩選得到的培養(yǎng)基， 1% 接種量接至初始發(fā)酵培養(yǎng)基LB，按照“1.2.8”篩選得到的發(fā)酵條件培養(yǎng) 24h ，取出后通過紫外分光光度計測OD_600nm ，對比優(yōu)化前后發(fā)酵液濃度；接種量及處理同上，搖勻搖瓶后取 200μL 滴入96孔板，優(yōu)化前后兩組處理均設(shè)5個重復，將96孔板置于酶標儀進行 ^48h 生長曲線測定，對比優(yōu)化前后復合菌生長曲線。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運用Excel2019進行圖表繪制和數(shù)據(jù)整理，

數(shù)據(jù)采用SPSS27.0.1軟件進行顯著性檢驗[]，Origin 2021 制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1生防細菌的分離與篩選

從33份土壤樣品中分離純化得到80株細菌，結(jié)合本實驗室已有的JS6-1，采用平板對峙法，初步篩選獲得對梨火疫病菌有拮抗效果的菌株24株（表3），其中JS6-1的抑菌作用最強， D/d 值為2.86，與其他菌株差異顯著；其次為Z15-8、Z30-18，Z32-6，D/d 值分別為2.58、2.44、2.33。

表3梨火疫病生防細菌初篩抑菌效果

注： D. 抑菌圈直徑；d.菌落直徑。 D/d 值越大，說明抑菌效果越好。不同字母表示差異顯著（ Plt;0.05） 。Note：D is thediameter of inhibition zone; d is colony diameter;Thegreater the D/d value，the stronger the antagonism.Differ-entletters indicate significant difference（ Plt;0.05） ！

選取上述有抑菌作用的生防細菌進行打孔抑菌圈法復篩。結(jié)果如表4所示（抑菌圈直徑小于1.2cm 未放人表中），抑菌圈直徑代表抑菌效果。其中，實驗室已有的JS6-1抑菌效果最強，抑菌圈直徑為 2.48cm ，與其他菌株差異顯著；其次為Z32-3，抑菌圈直徑為 2.33cm ；其他菌株的抑菌能力依次為 Z15-8gt;Z32-6gt;Z10-4=Z30-18gt; Z20-1gt;Z27-6gt;Z23-2gt;Z23-14gt;Z13-16gt;Z10-3 部分平板對峙圖見圖1。

2.2 生防細菌鑒定

形態(tài)學鑒定見表5，如圖2所示12株生防菌菌落形態(tài)均為圓形，顯微形態(tài)呈桿狀，且均為革蘭氏陽性菌。分子生物學鑒定擴增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，所得序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫比對，鑒定結(jié)果見表6，其中Z10-3為植物乳桿菌，其余11株生防菌均為芽孢桿菌。

表4梨火疫病生防細菌復篩結(jié)果

Table4Screeningresultsofbiocontrol

2.312株生防細菌對梨火疫病的室內(nèi)防效測定

選取上述12株菌株進行盆栽葉噴防效測定，盆栽防效測定結(jié)果如表7所示。結(jié)果表明，貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis）JS6-1處理的植株病情指數(shù)（7.78）顯著低于其他處理，防效（2號 （74.07% ）顯著高于其他處理。防效大于 50% 的菌株有萎縮芽孢桿菌（Bacillusatrophaeus）Z10-4、暹羅芽孢桿菌（Bacillussiamensis）Z15-8、卡氏芽孢菌株（Bacilluscabrialesii）Z2O-1、多粘菌類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）Z23-2、枯草芽孢桿菌（Bacillusinaquosorum）Z27-6、耐鹽芽孢桿菌（Bacillushalotolerans）Z32-3和暹羅芽孢桿菌（Bacillussiamensis）Z32-6。

2.412株生防細菌促生性能分析

2.4.112株菌促生性能檢測如圖3所示，萎 縮芽孢桿菌（Bacillusatrophaeus）ZlO-4、暹羅芽 孢桿菌（Bacillussiamensis）Zl5-8、卡氏芽孢桿菌 （Bacilluscabrialesii）Z2o-1、枯草芽孢桿菌（Bacillusinaquosorum）Z27-6、解淀粉芽孢桿菌（Bacillusammyloliguefaciens）Z3o-18、耐鹽芽孢桿 菌（Bacillushalotolerans）Z32-3、暹羅芽孢桿菌 （Bacillussiamensis）Z32-6、貝萊斯芽孢桿菌 （Bacillusvelezensis）JS6-1具有分泌IAA功能;

12 株菌均可產(chǎn) NH₃ 和鐵載體，12株菌只有植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）Z10-3、耐鹽芽孢桿菌（Bacillushalotolerans）Z32-3、貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis）JS6-1具有解

圖1打孔抑菌圈法結(jié)果

Fig.1Biocontrol bacteria fermentationbroth against Erwinia amylovora

表5梨火疫病生防細菌形態(tài)學鑒定結(jié)果

2.4.212株菌發(fā)芽促生檢測如表8所示，試驗第7天Z10-4、Z27-6、Z32-3、JS6-1四組處理發(fā)芽率最高，均為 43.33% ，與其他菌株相比，差異顯著，但四者間無顯著差異。Z32-3處理下的芽長最長，為 2.96cm ，顯著長于其他處理，其次是JS6-1處理的芽長為 2.68cm 。

圖2梨火疫病生防細菌形態(tài)觀察

Fig.2Morphological observation of biocontrol bacteria for fire blight of pear

表6梨火疫病生防細菌分子生物學鑒定結(jié)果

Table6Molecularidentificationofbiocontrolbacteria againstErwiniaamylovora

表7生防細菌盆栽防效測定

Table7Evaluation ofbiocontrol efficacyof bacteriainpotexperiments

2.4.3生防細菌穴盤促生檢測選取上述發(fā)芽率在 25% 以上的8 株菌（Z10-4、Z15-8、Z20-1、Z27-6、Z30-18、Z32-3、Z32-6、JS6-1）進行試驗。如表9所示，播種后第7天Z32-3、JS6-1兩組處理的出苗率顯著高于其他處理，分別是 71.00% 和

72.00% ，二者間無顯著差異；通過分析葉片數(shù)發(fā)現(xiàn)Z27-6、Z32-3、JS6-1三組處理的葉片數(shù)顯著多于其他處理，三者間無顯著差異；通過分析株高發(fā)現(xiàn)Z15-8、Z32-3、JS6-1四組處理的苗高顯著高于其他處，三者間無顯著差異；通過分析根長發(fā)現(xiàn)JS6-1處理的苗根長顯著長于其他處理。后續(xù)試驗將選取Z32-3與JS6-1進行復配，獲得梨火疫病生防復合菌。

圖312株菌促生性能檢測結(jié)果

Fig.3 Resultsof12 strainsofbacteria forgrowth promotion performance

表812株菌發(fā)芽促生檢測結(jié)果

Table 8Results of germination promotion assay for12strainsofbacteria

2.5梨火疫病生防復合菌室內(nèi)防效測定

將上述篩選得到防效最優(yōu)良的生防細菌JS6-1與促生效果最優(yōu)良的生防細菌Z32-3復配得到生防復合菌。通過盆栽防效試驗，結(jié)果如表10所示，復合菌處理的植株病情指數(shù)顯著低于單一菌劑處理的植株，防效相較于單一菌處理的植株有顯著提升，且防效更為穩(wěn)定。

2.6生防復合菌發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.6.1碳源篩選通過篩選碳源，結(jié)果見圖4，糖蜜組發(fā)酵液濃度（2.46）顯著高于其他碳源組，其他碳源組發(fā)酵液濃度依次為蔗糖 gt; 葡萄糖 gt; 白砂糖 gt;CK ，后續(xù)試驗中的碳源選擇糖蜜。

2.6.2氮源篩選通過篩選氮源，結(jié)果見圖5，酵母膏組發(fā)酵液濃度（2.41）顯著高于其他氮源組，其他氮源組發(fā)酵液濃度依次是大豆蛋白陳 gt; 蛋白陳 gt;CKgt; 牛肉浸粉，值得注意的是牛肉浸粉組發(fā)酵液濃度顯著低于CK組，推測是因為初始培養(yǎng)基中原本就含有牛肉浸粉，再次加入牛肉浸粉導致該營養(yǎng)過剩，從而導致抑制菌株生長，后續(xù)試驗中的氮源選擇酵母膏。

2.6.3碳氮比篩選碳氮比篩選結(jié)果如圖6所示，CN12處理下發(fā)酵液 OD_600nm 顯著高于其他碳氮比處理，后續(xù)選擇 1.5% 糖蜜、 2% 酵母膏進行試驗。值得注意的是，如圖4所示，在碳含量0.5%～1.5% 且碳源含量不變的情況下，發(fā)酵液OD_600nm 隨氮源的升高而升高，但是當碳源達到2% 時，發(fā)酵液 OD_600nm 隨氮源的升高而降低。

表98株菌穴盤促生檢測結(jié)果"

Table9 Results of 8 strains of bacterial burrow promotion assays

表10復合菌室內(nèi)防效測定"

Table10Determinationofindoor efficacy of compositefungi

圖4碳源篩選柱狀圖

Fig.4 Carbon source sreening histogram

2.6.4無機鹽單因素篩選無機鹽單因素篩選結(jié)果如圖7所示， FeCl₂ 處理下發(fā)酵液 OD_600nm 顯著高于其他無機鹽處理，其次依次是 KH₂PO₄gt; MgSO₄?7H₂Ogt;MnCl₂gt;NaClgt;K₂HPO₄gt; 1 FeSO₄?7H₂Ogt;KCLgt;Na₂HPO₄?12H₂O 后續(xù)選擇前4個進行試驗。最終發(fā)酵配方為：蛋白肺 5g/L （源自初始培養(yǎng)基）、 NaCL1g/L （源自初始培養(yǎng)基）、糖蜜 15g/L. 酵母膏 25g/L （含 5g 初始培養(yǎng)基中的酵母膏）、 FeCl₂ 0.5 g/L、KH₂PO₄ 0. 5g/L 、 MgSO₄ ·7H₂O 0. 5g/L 、MnCl₂ 0.5g/L 。

圖6碳氮比篩選柱狀圖

Fig.6Carbon to nitrogen ratioscreeninghistogram

2.6.5發(fā)酵條件單因素篩選發(fā)酵條件單因素篩選結(jié)果如圖8所示，培養(yǎng)基初始 ΔpH 為7.0時，發(fā)酵液 OD_600nm 顯著高于其他 pH 處理，5組處理中，復合菌均可正常生長，推測菌株JS6-1、Z32-3可耐 pH 3. 0～11. 0 ，后續(xù)選擇 pH 7. 0 進行試驗； 處理發(fā)酵液 OD_600nm 顯著高于其他溫度處理，10組溫度處理下，復合菌均可正常生長，且40～50^°C 條件下發(fā)酵液 OD_600nm 顯著高于 28^°C 條件下的發(fā)酵液 OD_600nm 值，后續(xù)選擇 進行試驗；轉(zhuǎn)速 180Δr/min，200Δr/min 處理發(fā)酵液OD_600nm 顯著高于其他轉(zhuǎn)速處理，分別是3.78、3.63，其中 180r/min 處理發(fā)酵液 OD_600nm 略高于200r/min 處理的發(fā)酵液 OD_600nm 值，但二者間并無顯著差異，后續(xù)選擇 180r/min 進行試驗。最終篩選得到發(fā)酵條件： pH7.0.37^°C.180r/min 。

圖8發(fā)酵條件篩選

Fig.8Screening of fermentation conditions

2.7發(fā)酵工藝優(yōu)化前后濃度對比

如圖9-A所示，優(yōu)化后發(fā)酵液 OD_600nm 值達到3.60，是優(yōu)化前（1.55）的2.32倍，顯著提高了發(fā)酵液濃度。如圖9-B所示，優(yōu)化后的生長速率顯著提升，發(fā)酵前 ^12h 內(nèi)， OD_600nm 值迅速上升，表明復合菌在優(yōu)化后的條件下能夠更快地適應(yīng)環(huán)境并開始增殖，在約 30h 后趨于平穩(wěn)，進入穩(wěn)定期的時間較早且維持較高的生物濃度。優(yōu)化前的生長曲線增長較為緩慢， OD_600nm 值在整個生長過程中上升幅度有限。發(fā)酵工藝的優(yōu)化顯著提高了復合菌的生長速率和濃度，縮短了適應(yīng)期并延長了穩(wěn)定期，推測是由于優(yōu)化后的配方改善了營養(yǎng)供給，從而促進了菌體的快速增殖和高效生長。

圖9發(fā)酵前后對比

Fig.9Comparison before and after fermentation

3討論

與復合菌相比，單一菌具有功能單一、適應(yīng)能力較差及防效不穩(wěn)定等問題。發(fā)掘不同功能菌株，復配后獲得防效更強、功能更穩(wěn)定的微生物復合菌劑，是未來發(fā)展微生物菌劑的趨勢[20]。新疆地理位置特殊，具有多種逆境脅迫，為獲得高適應(yīng)性和定殖能力強的菌種，該研究選擇新疆本土土壤樣品，結(jié)合試驗室現(xiàn)有菌種，篩選獲得抗性強、穩(wěn)定性好的生防菌與促生性能優(yōu)良的菌株，復配得到復合菌，并對其進行發(fā)酵工藝優(yōu)化。

閻春蘭等[21]以大麗輪枝菌為指示菌，從新疆阿克蘇鹽堿地土樣中篩選得到一株耐鹽芽孢桿菌SF-18，采用牛津杯法發(fā)現(xiàn)其在 -20°C～80°C 對棉花黃萎病病原菌有穩(wěn)定的抑制能力；有研究報道菌株可通過直接作用，如固氮、產(chǎn) NH₃ 、溶磷、解鉀、產(chǎn)生鐵載體、分泌吲哚乙酸（IAA）等生長調(diào)節(jié)劑，促進植物生長發(fā)育[17]，梁振普等[22]從新疆喀什地區(qū)鹽堿地篩選得到一株喜鹽芽孢桿菌Bachu85，經(jīng)玉米盆栽試驗發(fā)現(xiàn)其具有較為優(yōu)良的促生能力。本研究通過平板對峙初篩出對梨火疫病菌具有明顯抑制作用的菌株12株，通過溫室防效測定，復篩得到綜合防效最好的貝萊斯芽孢桿菌JS6-1，其防效可達到 74.07% ，通過促生試驗篩選得到綜合促生能力最強的耐鹽芽孢桿菌Z32-3，將二者復配得到梨火疫病生防復合菌。通過室內(nèi)防效測定發(fā)現(xiàn)復合菌防效相比單一菌顯著提高，且防效更為穩(wěn)定，具有進一步研究和開發(fā)應(yīng)用的潛力。

發(fā)酵過程不僅是微生物菌劑生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是實現(xiàn)高效、經(jīng)濟化制造的重要保障。代亞西[23]通過單因素及響應(yīng)面方法篩選得到發(fā)酵工藝條件，顯著增強了鮮食玉米抗氧化活性；白冬紅等[24]利用單因素試驗對枯草芽孢桿菌BX1-12進行發(fā)酵工藝優(yōu)化，經(jīng)驗證，優(yōu)化后芽孢產(chǎn)量為7.25×10⁹CFU/mL ，是優(yōu)化前的3.67倍；劉婷婷[25]通過單因素及響應(yīng)面試驗法優(yōu)化了菌株JI6發(fā)酵工藝，優(yōu)化后的培養(yǎng)基的 OD_600nm 達到3.101，是優(yōu)化前的1.54倍；該研究以LB肉湯為初始發(fā)酵培養(yǎng)基，通過單因素篩選的方式，基于發(fā)酵液 OD_600nm 篩選碳源、氮源、無機鹽、溫度、 pH 、轉(zhuǎn)速，最終篩選得到： 1.5% 糖蜜、 2% 酵母膏、0.05%FeCl₂?0. 05%MnCl₂， 0.05% （204 KH₂PO₄ 、0.05% （20 MgSO₄?7H₂O，pH 7. 0. 溫度 、轉(zhuǎn)速 180min ，優(yōu)化后發(fā)酵液 OD_600nm 值達到3.60，是優(yōu)化前（1.55）的2.32倍，顯著提高了發(fā)酵液濃度。

4結(jié)論

通過本研究篩選獲得12株梨火疫病生防細菌，其中耐鹽芽孢桿菌Z32-3與前期篩選獲得的貝萊斯芽孢桿菌JS6-1復配，得到較單一菌劑防效更高的復合菌，在田間應(yīng)用中具有較大的應(yīng)用潛力，值得進一步研究。對發(fā)酵工藝進行優(yōu)化后，發(fā)酵液菌體濃度為優(yōu)化前的2.32倍，顯著提高了復合菌的生長速率和濃度。

參考文獻 Reference：

[1］古麗孜熱·曼合木提，徐琳贊，李燕，等.庫爾勒香梨腐爛病拮抗菌的篩選及其防效測定[J].中國農(nóng)學通報，2020，36（19）：127-134.

[2] 徐琳贊，古麗孜熱·曼合木提，韓劍，等.香梨內(nèi)生拮抗細菌的篩選及對梨火疫病的生防潛力[J].西北植物學報，2021，41（1）：132-141.

[3] 胡白石.梨火疫病菌的風險分析及檢測技術(shù)研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2000.

[4] 王俊，高建誠，巴音克西克，等.利用電加熱自動消毒修枝剪阻斷梨火疫病田間傳播[J].植物檢疫，2022（2）：25-28.

[5] 馬婷.防治梨腐爛病高效，低毒化學藥劑的室內(nèi)篩選及田間應(yīng)用[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2014.

[6] 賀旭，韓劍，盛強，等.梨火疫病拮抗細菌FX1及其抑菌物質(zhì)的防病作用[J].園藝學報，2023，50（5）：1118-1129.

[7]ARKHIPOVA，CARVALHAISL C，SCHENKPM.PG-PRcontrol Phytophthora capsici in tomato through in-duced systemic resistance，early hypersensitive response anddirect antagonism in a cultivar-specific manner[J] EuropeanJournalofPlantPathology，2023，167（4）：811-832.

[8] BARRERA-ORTIZS，BALDERAS-RUZKA，LPEZ-BU-CIOJ S，et al.Bacillus velezensis strain improves growthand root system development in Arabidopsis thalianathrough cytokinin signaling [J] Rhizosphere，2O23，28（1）：

103-182.

[9]LIUXJ，DUANXJ，MAN，et al.Impact of microbial inoculantson microbial quantity，enzyme activity and availablenutrient content in paddy soil [J].Journal of NortheastAgriculturalUniversity，2015，22（4）：7-14.

[10]郭良棟.中國微生物物種多樣性研究進展[J].生物多樣性，2012，20（5）：572-580.

[11] 李鳴雷，商鴻生，谷潔，等.促進農(nóng)業(yè)廢棄物腐解的復合微生物菌劑的篩選[J].西北農(nóng)業(yè)學報，2005，14（2）：101-104.

[12] 秦韻婷.紅棗根際復合功能菌的研制及肥效研究[D].烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學，2016.

[13]何亞芳，包慧芳，王寧，等.甜瓜鐮刀菌果腐病菌拮抗菌篩選及其拮抗性研究[J].園藝學報，2023，50（10）：2257-2270.

[14]耿源濛，孫權(quán)，顧欣，等.干旱區(qū)土壤中西瓜專化型尖孢鐮刀菌拮抗菌的篩選及分類[J].河南理工大學學報（自然科學版），2016，35（4）：526-532，567.

[15] 魯晏宏，郝金輝，羅明，等.梨火疫病拮抗菌篩選及溫室防效測定[J].微生物學通報，2021，48（10）：3690-3699.

[16] CABREFIGA J，BONATERRA A，MONTESINOSE.Mechanisms of antagonism of Pseudomonas fluorescensEPS62e against Erwinia amylovora，the causal agent offireblight[J]. InternationalMicrobiology，20o7，10（2）：123-132.

[17]王晶，李波，黎柳萍，等.廣西亞熱帶植物根際促生菌的篩選、鑒定及促生作用研究［J].南京農(nóng)業(yè)大學學報，2024，47（3）：468-476.

[18] 趙夢娟.耐鹽促生菌的篩選及其對鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗的促生研究[D].山東青島：青島科技大學，2023.

[19]易子霆，羅志威，徐滔明，等.1株耐鹽枯草芽孢桿菌TG-Bio-1433發(fā)酵工藝優(yōu)化[J].江西農(nóng)業(yè)學報，2016，28（6）：105-108.

[20]李俊，姜昕，李力，等.微生物肥料的發(fā)展與土壤生物肥力的維持[J].中國土壤與肥料，2006（4）：1-5

[21]閻春蘭，余福燕，王藝霏，等.耐鹽芽孢桿菌SF-18的生防潛能與基因組學分析［J].華中農(nóng)業(yè)大學學報，2024，43（4）：192-203.

[22]梁振普，賈俊卿，王秋云，等.檉柳根際喜鹽芽孢桿菌 Ba-chu85的分離及耐鹽促生功能鑒定[J].河南農(nóng)業(yè)大學學報，2025，59（3）：444-454.

[23］代亞西.鮮食玉米乳酸菌發(fā)酵工藝優(yōu)化及產(chǎn)品開發(fā)[D].長春：吉林大學，2024.

[24]白冬紅，孫尹雙，張?zhí)鹛穑?枯草芽孢桿菌BX1-12 搖瓶和擴大發(fā)酵工藝優(yōu)化研究［J].廣東飼料，2024，33（5）：29-35.

[25］劉婷婷.菌株JI6發(fā)酵工藝優(yōu)化及對人參促生作用的研究[D].長春：吉林農(nóng)業(yè)大學，2023.

Screening and Fermentation Process Optimization of Composite Biocontrol Bacteria for Fire Blight

WU Zifei ^1，2 ，WANG Xingwen ^1，2 ，DONG Yutao1，HU Baishi ³ ，GUO Wenchao ⁴ ，LIU Baochang ^1，2 ，WANG Ning1'2，SHI Yingwu1， ZHAN Faqiang1 ，YANG Rong' and BAO Huifang

（1.Instituteof Microbiology，Xinjiang Uygur AutonomousRegion Academyof Agricultural Sciences，XinjiangKeyLaboratory of Special EnviromentalMicrobiology，Urumqi83091，China;2.Colegeof Agriculture，Xinjiang Agricultural University， Urumqi830o52，China；3.ColegeofPlantProtection，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing21o095，China;4.Istitute of PlantProtection，Xinjiang Uygur Autonomous Region Academyof Agricultural Sciences，Urumqi830o91，China）

Abstract The fire blight caused by Erwinia amylovora is a destructive disease affecting Rosaceae plants such as pear，apple，begonia and so on.It is highly detrimental and dificult to control. To screen more excellent biocontrol bacterial resources against fire blight，soil samples were collcted from saline-alkaline lands in southern Xinjiang.In combination with the Bacillus velezensis JS6-1， which was previously screened by our team and exhibited broad-spectrum antibacterial activity，a series of experiments were conducted， including the screening of biocontrol bacteria，evaluation of pottrial control eficacy，and assessment of growth-promoting effects.The most effective strains in terms of control eficacy and growth promotion were combined to formulate a biocontrol bacterial complex against fire blight. The control eficacy of this complex was evaluated using pot-grown Pyrus betulaefolia seedlings.Additionally，the fermentation medium and conditions were optimized through singlefactor experiments using LB broth as the basal medium. As a result of this study，12 strains with good biocontrol effecs were identified.Among them，the Bacillus velezensis JS6-1 showed the the best control efficiency，reaching 74.07% . Through the growth-promoting experiment，the Bacillus halotolerans Z32-3 exhibited best growth-promoting effect.Subsequently， Bacillus velezensis JS6-1 and Bacillus halotolerans Z32-3 were combined to obtain acomposite biocontrol bacteria for fire blight. The control efficacy reached 82.51% ，which was significantly higher than that of either single strain. The optimal fermentation medium was obtained as follows：peptone 5g/L ， NaCl1g/L ，molasses 15g/L ， yeast extract 25g/L ， FeCl₂ （20 0.5g/L ， KH₂PO₄ （20 0.5g/L ， MgSO₄?7H₂O0.5g/L ，and MnCl₂ 0. 5 （204號 g/L . The optimal fermentation conditions were： pH7.0 ， ，and 180r/min . After optimization， the OD_600nm value of the fermentation broth reached 3.6O，which was 2.32 times that pre-optimization （1.55）.

Key Words Fire blight;Composite biocontrol bacteria; Screening； Fermentation process

Received 2024-11-26 Returned 2025-03-18

Foundation item Major Special Project of Xinjiang Uygur Autonomous Region （No.2023A0200604- 03）.

First author WU Zifei， female，master student. Research area： plant pathology. E-mail：1192429737 （204號 qq. com

Corresponding authorBAO Huifang， female，research fellow. Research area： plant pathology. E-mail ： bbhf777 ② xaas. ac. cn

（責任編輯：史亞歌 Responsible editor：SHI Yage）