基于線粒體D-loop區多樣性的四平葉赫蒼鷺種群動態研究

鳥類種群動態能夠直接揭示該物種的生存狀況，包括種群數量、分布、遷徙、繁殖等關鍵信息，這對于評估鳥類的健康狀況、預測種群變化趨勢以及制定保護策略至關重要，也是物種多樣性保護以及生態環境保護的重要數據來源[1]。除了傳統的生態學觀察之外，分子生物學也被廣泛應用到鳥類種群動態研究過程中[2]。遺傳多樣性是研究物種演化、遺傳結構和生態適應性的關鍵數據之一，可以評價物種適應性和生存能力的依據，在野生動物保護方面扮演重要角色[3-5]。線粒體DNA（mtDNA）因其母系遺傳、進化快、序列多樣性高等特性，常被用作研究種群遺傳多樣性的重要標記[6-7]。因此，探究線粒體DNA遺傳多樣性能夠較好地從母系方面揭示鳥類的種群動態。

蒼鷺（Ardeacinerea）屬于鷺科（Ardeidae）鷺屬（Ardea），是一種大型涉禽[8]，以魚類等水生動物為食，其分布于非洲、歐亞及東亞，在中國幾乎遍布全國[9]。蒼鷺多棲息于淺水區域，作為濕地生態系統的指示物種，長期以來備受人們關注。

在其種群分布[10-12]、生境選擇[13-15]、環境重金屬監測[16-17]以及寄生蟲[18]等方面已經取得了一定進展。然而，目前對蒼鷺的生態學研究多集中在特定的地理區域，且大多基于傳統的野外觀測方法，很少采用分子生物手段，導致諸如遺傳多樣性、遺傳分化程度、種群擴張演替等方面缺乏明確的研究結論，而這些對于探究蒼鷺種群動態具有重要意義。

本研究采用無損取樣法收集蒼鷺孵化后的卵殼，通過測定卵殼尿囊膜中mtDNAD-loop區序列，從母系方面探究遺傳多樣性，從而深入了解蒼鷺的生存和繁衍現狀，為制定科學合理的保護策略提供理論依據。

1材料與方法

1. 1 樣品采集與DNA提取

2021年4月至2024年5月期間，在距吉林省四平市區 30km 的葉赫風景區 （42^°14^′N～ 42^°57^′N，124^°34^′E～124^°37^′E） 收集從蒼鷺筑巢樹上掉落的孵化后卵殼。為保證所收集樣本不重復，選擇那些具有完整尖端的卵殼為試驗材料，共收集209個樣本，其中2021年樣本 20個，2022年樣本91個，2023年樣品提取DNA未能成功，2024年樣本98個。使用DNA提取試劑盒（北京莊盟國際生物基因科技有限公司）提取卵殼尿囊膜總DNA，置于 -20^°C 保存，備用。

1. 2 引物設計與擴增測序

根據Genebank中登錄號為NC_025900.1的序列為模板設計引物，序列為Acin-CR1-S（ 5^′ AAACAAGGCTACCATCATCCC - 3^′ ）和Acin-CR1-A（ 5^′ -GGACCGAGTGCTAAGTCAACC -3^′ ），擴增mtDNAD-loop區序列片段長約750bp。使用 50μL 擴增體系，包含DNA模板為3μL ，上、下游引物各 1μL，2×U Taq PCR Mix（北京莊盟國際生物基因科技有限公司） 25μL 。擴增條件： 95°C 預變性 5min ：94^°C 變性 1min，55^°C 退火 1min，72^°C 延伸2min ，共30個循環； 72°C 延伸 10min，4^°C 保存。取PCR擴增產物 5μL 用 1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將產物膠回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.3 數據分析

測序圖譜經Chromas（v2.6.6）查看后，用Snapgene（v6.0.2）同參照序列（NC_025900.1）比對并記錄突變位點。分別使用MEGA11.0和DnaSP6.12軟件統計蒼鷺mtDNAD-loop區序列的平均堿基組成以及多態位點數、簡約信息位點數、單倍型數、核苷酸多樣性、單倍型多樣性和平均核苷酸差異，并定義單倍型。基于線粒體DNA母系遺傳的特點，本研究以年為分組單位，將同一巢中共享同一單倍型的樣本合并為一個樣本，使用Arlequin3.5（Pairwisedifference）計算3a樣本的遺傳分化系數（ Fst 值）并進行AMOVA分析（analysisofmolecularvariance），計算公式為 Fst=（H_T-H_S）/H_T ，其中 ΔH_T 為整個種群的預期雜合度， H_s 為亞種群在哈迪一溫伯格平衡下的預期雜合度，最后利用Popart1.7軟件繪制單倍型NJ網絡圖。

2 結果與分析

2.1 遺傳多樣性分析

成功獲得209條長度為750bp的線粒體高可變區序列。堿基組成分析發現堿基T、C、A和

G的平均含量分別為 27.99%.26.54%.25.63% 和 19.84% ， A+T（53.62%） 的平均含量高于G+C（46.38%） ，表現出了一定的堿基偏好性。共檢測到55個突變位點，占所分析位點總數的9.95% ，其中多態位點52個。多態性位點中單一多態位點37個，簡約性信息位點15個（表1）。這52個多態位點中，C-T轉換有11處，A-G轉換16處，G-C顛換3處，A-C顛換5處，G-T顛換12處，A-T顛換5處。

經單倍型統計分析，從蒼鷺209個樣本中共定義了33種單倍型（表1）。各單倍型的網絡關系如圖1所示，2021年20個樣本共享10種單倍型，其中Hap12為特有單倍型；2022年91個樣本共享12種單倍型，Hapl、Hapl3、Hapl7和Hap33為特有單倍型；2024年98個樣本共享24個單倍型，其中19種為特有單倍型。綜合來看，2021一2024年的單倍型種類數量、特有單倍型數量都呈上升趨勢，表明該地區蒼鷺種群遺傳多樣性不斷增長（圖2）。另外，圖1中包含單倍型Hap2、Hap3、Hap27和Hap3O的節點面積大于其他單倍型，在所有單倍型中占比分別為 16% 、9%.12% 和 15% ，表明這些單倍型為該地區優勢單倍型，且Hap2、Hap3 和Hap30 在 2021-2024 年內均有出現，推斷蒼鷺在棲息地選擇方面表現出一定的忠實性。遺傳多樣性分析（表2）可知，蒼鷺mtDNAD-loop區2021年、2022和2024年種群的單倍型多樣性（Hd）皆為1，核苷酸多樣性指數（Pi）分別為0.00726，0.00659和0.00615，平均核苷酸差異數（K）分別為5.444、4.939和4.616。3a整體單倍型多樣性（Hd）為0.989，核苷酸多樣性（Pi）為0.00716，平均核苷酸差異數（K）為5.373。中性檢驗結果（表2）顯示各年度的Tajima'sD值為 -1.797 03～-1.945 82 Fu'sFs值為 -6.913～-26.5. ，整體數據整合后，Tajima’sD為—2.24579、Fu’sFs達-31.662，均小于0，中性檢驗值皆顯著（ Plt; 0.05），表明群體可能經歷擴張或正向選擇。

2.2 遺傳分化分析

將 2021-2024 年每年所得單倍型歸為一個組進行遺傳分化系數分析（圖3）。結果顯示不同年份間遺傳分化指數為 0. 01～0. 03 ，其中，2021一2022的群體遺傳分化程度最小， Fst 值為0.01，檢驗結果為不顯著水平！ （Pgt;0.05），2021- 2024，2022-2024 的群體遺傳分化程度最大， Fst 值均為0.03，檢驗結果為顯著水平（ Plt;0.01） L3a整體 Fst 值為 0.0293（Fstlt;0.05） ，檢驗結果達到顯著水平 P 為0.0088（ Plt;0. 05） 。AMO-

VA分析（表3）顯示，在總體遺傳變異中，來源于群體內的變異占 97.07% ，明顯高于群體間（2.93%） 。

表1蒼鷺mtDNAD-loop區變異位點及單倍型類型

Table1Mutation sites and haplotype types in mtDNA D-loop region of Grey Heron

注：“d\"表示缺失，“i\"表示插人。 Note：\"d\"indicates a deletion，\"i\" indicates an insertion.

圖1蒼鷺樣本單倍型網絡圖

Fig.1Haplotypenetwork diagram of Grey Heron samples

圖2蒼鷺mtDNAD-loop區單倍型占比率

Fig.2Proportion of haplotypesinmtDNA D-loop region of Grey Heron 表2蒼鷺mtDNAD-loop區序列的多態性分析

圖3蒼鷺樣本遺傳分化系數熱圖

Fig.3Heatmap of genetic differentiation coefficient of Grey Heron samples

表3蒼鷺AMOVA分析

Table3AMOVAanalysisofGreyHeron

3討論

線粒體DNA是研究物種遺傳多樣性的常用標記，廣泛應用到鳥類群體的遺傳差異、遺傳關系、進化歷程和生物多樣性的形成等多個方面的研究。從單倍型組成發現，在 2021-2024 年，Hap2、Hap3和Hap3O這3種單倍型均有出現，且在3a間的蒼鷺種群中均為優勢單倍型，說明四平葉赫蒼鷺主體種群遺傳結構相對穩定。陳晨等[19]利用環志和衛星跟蹤數據對黑頸鶴的棲息地忠實性進行了研究，發現其棲息地忠實度達63.3% ，表明黑頸鶴具有一定的棲息地忠實性。蒼鷺與黑頸鶴同屬于棲息于沼澤地、湖泊及河灘等濕地環境的大型涉禽，對棲息地選擇相似，由此推測蒼鷺在棲息地選擇上可能存在一定程度的忠實性。

然而，基于線粒體DNAD-loop區序列的蒼鷺遺傳多樣性評估結果表明，單倍型多樣性（Hd）為0.989，大于0.5，核昔酸多樣性（Pi）為0.00716，大于0.005。一般認為，Hd和Pi數值均處于較低水平 .Hdlt;0.5，Pilt;0.005） 時，種群近期經歷了遺傳瓶頸；當Hd較高（ Hd?0.5） 而Pi較低（ Pilt;0. 005） 時，推測種群可能在經歷衰退之后發生了快速擴張；當Hd較低（ ：Hdlt;0. 5 1而Pi較高 （Pi）?0.005） 時，可能由于彼此隔離的種群發生了二次接觸，或大而穩定的群體正經歷強烈的遺傳瓶頸；當二者均處于較高水平（ Hd? 0.5，Pi?0.005） 時，表明該物種經長期進化形成了穩定的種群[20]，這樣的種群遺傳多樣性豐富，并具有良好的環境適應能力，以及面對氣候變化的生存能力。由此推測四平葉赫轉山湖地區蒼鷺的遺傳多樣性豐富，同樣，3a間蒼鷺群體單倍型數量逐年增加，由10個增加到12個直至24個，AMOVA分析表明遺傳變異來源于群體內占97.07% ，而來源于不同年份種群間僅為 2.93% 。中性檢驗結果顯示Tajima’sD為—2.24579、Fu'sFs為-31.662。Tajima'sD值持續顯著小于0，其在進化歷程中極有可能歷經種群擴張事件；Fu'sFs值大幅負值，進一步佐證這種擴張現象。野外觀察數據同樣支持這一結果，自2014年葉赫風景區首次出現少量蒼鷺以來，蒼鷺種群數量、巢穴數量逐年遞增（數據未發表），表現出其種群向大而穩定發展的趨勢。

Fst 值可以反映種群遺傳分化水平，本研究發現， 2021-2024 年蒼鷺種群間的 Fst 值為0.0293（Fstlt;0.05） ，依據Freeland[21]劃分標準，其呈現出輕度的遺傳分化，但分化程度相對較低，顯示不同年份間蒼鷺群體在遺傳結構上仍具有較高的相似性和一定程度的基因交流。然而，檢驗結果達到顯著水平 （P=0.0088lt;0. 05） ，這意味著盡管遺傳分化程度較輕，但差異并非隨機偶然產生，而是具有統計學上的顯著意義?？赡苁怯捎谏n鷺作為候鳥在遷徙過程中產生了基因流，使得種群間基因頻率產生了雖小但顯著的變化。Lim等[22]追蹤在同一地區捕獲的蒼鷺時發現其選擇了不同的棲息地越冬，為種群間基因的交流提供了可能。這表明四平葉赫蒼鷺種群可能正經歷擴張或者替換。結合四平葉赫建立蒼鷺保護站，向水庫承包者補貼確保蒼鷺覓食不受影響等舉措，說明蒼鷺種群的棲息環境得到一定程度改善，種群數量不斷增加，也可能吸引周邊其他地區蒼鷺種群到此繁殖。當然，這種遺傳結構的差異究竟是由于蒼鷺種群擴張時選擇葉赫隨機加入原有種群還是在遷徙過程中形成集群然后重新組合導致的，還需要后期更深人的研究。

4結論

本研究揭示了吉林省四平市葉赫風景區蒼鷺種群的遺傳多樣性豐富，且遺傳分化程度較低，呈現輕度分化特征。盡管遺傳差異較小，但具有顯著性。表明蒼鷺具有較強的環境適應性，能夠在多變的環境條件下維持相對穩定的種群規模，并呈現出向更大群體擴展的趨勢。

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Population Dynamics of Grey Herons in Yehe，Siping Based on Diversity of Mitochondrial D-loop Region

ZHANG Shiyu，TIAN Ran，LI Donghong，LIU Shu， YI Guodong and ZHAO Yongbin （College of Life Sciences，Jilin Normal University，Siping Jilin 136ooo，China）

AbstractTo explore the population dynamics of the breeding population of grey herons，2O9 allantoic membrane samples of grey heron eggshells were colected during 2021 to 2024 in the Yehe Scenic Area，Siping，Jilin Province. Genomic DNA was extracted，and the mitochondrial DNA D-loop region sequences were amplified and sequenced. The base composition and content，variable sites，number of haplotypes，genetic diversity，and genetic differentiation coeficient of the 2O9 grey heron mtDNA D-loop region sequences were analyzed to assess the degree of sequence variation，and a haplotype network diagram was constructed. The results showed that the mitochondrial D-loop region sequences were successfully obtained for all samples. Analysis of base composition revealed that the average percentages of T，C，A，and G were 27.99%， 26.54% 25.63% ，and 19.84% ，respectively. A total of 55 mutation sites were identified，forming 33 haplotypes. Genetic diversity analysis showed that the haplotype diversity （Hd），nucleotide diversity （Pi），and average number of nucleotide differences （K） were O. 989，O.007 16 and 5. 373，respectively，suggesting high genetic diversity （ Hd?0.5，Pi? 0.005）. The genetic differentiation analysis showed that the overall Fst value was O.0293（ Fstlt; 0.05），indicating a slight genetic differentiation，although the result was statistically significant （ ?Plt; 0.05）.As migratory birds，grey herons may experience gene flow during migration. The AMOVA analysis showed that among the overall genetic variation，the variation within the population accounted for 97.07% ，which was significantly higher than that between populations （2.93%） .The results of the neutral test showed that Tajima's D was -2.245 79 and Fu s Fs was -31.662 ， strongly suggesting a recent population expansion. Field observations also indicated a year-by-year increase in grey heron numbers in the Yehe Scenic Area. It is speculated that grey herons have strong environmental adaptability and development of a larger and more stable population.

Key WordsGrey Heron；Mitochondrial DNA；Genetic diversity； Haplotype;Genetic diferentiatiorcoefficient

Received 2024-12-09 Returned 2025-03-12

Foundation item Project of Jilin Provincial Department of Science and Technology （No. 20220101331JC）.

First author ZHANG Shiyu，female，master student. Research area： biochemistry and molecular biology. E-mail： 18844276847@163.com

Corresponding authorZHAO Yongbin，male，professor. Research area： population genetics. E-mail： Syding@jlnu. edu. cn

（責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor：GU Yulan）