NLRP3炎癥小體在失血性休克大鼠腎臟損傷中的作用

張　強　譚　超，2　李阿興　賀彥平▲.西安一四一醫院外一科，陜西西安70089；2.第四軍醫大學西京醫院泌尿外科，陜西西安70032

NLRP3炎癥小體在失血性休克大鼠腎臟損傷中的作用

張強1譚超1，2李阿興1賀彥平1▲
1.西安一四一醫院外一科，陜西西安710089；2.第四軍醫大學西京醫院泌尿外科，陜西西安710032

目的探討失血性休克大鼠早期腎臟組織內NLRP3炎癥小體信號通路的表達及作用。方法將27只健康雄性SD大鼠按隨機分為假手術組（對照組）、失血性休克組（實驗組）、失血性休克優降糖干預組（干預組）。大鼠失血性休克模型完成后24 h監測血肌酐（Scr）和血尿素氮（BUN）水平，并分別采用Western blot和rt-PCR方法檢測腎臟皮質中NLRP3炎癥小體蛋白的表達和IL-1β、TNF-α的基因表達情況。結果①實驗組大鼠血清Scr、BUN含量顯著高于對照組（P＜0.01）；干預組大鼠血清Scr、BUN含量顯著低于實驗組（P＜0.01）。②實驗組大鼠腎臟皮質內NLRP3蛋白表達量顯著高于對照組（P＜0.01）；與實驗組比較，干預組大鼠腎臟皮質內NLRP3的蛋白含量明顯降低（P＜0.01）。③實驗組大鼠腎臟皮質內IL-1β、TNF-α的mRNA表達量顯著高于對照組（P＜0.01）；干預組大鼠腎臟皮質內IL-1β、TNF-α的mRNA表達量顯著低于實驗組（P＜0.01）。結論失血性休克大鼠早期腎功能受損，腎臟皮質內NLRP3炎癥小體活性增高，炎性反應明顯，使用炎癥小體抑制劑優降糖后，可顯著抑制NLRP3的活化，降低腎臟炎性反應，改善腎功能。

失血性休克；腎臟；炎癥小體；NLRP3；炎癥

失血性休克是臨床常見的急重癥病癥之一，常常由創傷、手術、交通事故和地震等引起，如治療不當或不合理，常常引起重要臟器功能與代謝障礙，而腎臟是最易受累的器官之一［1］。失血性休克后主要引起機體急性循環功能障礙，導致腎臟微循環灌注不足以及細胞功能代謝障礙，機體免疫功能受到抑制，腎臟受到各種因素刺激，很容易產生炎性反應，導致腎損傷。休克后快速液體復蘇是常用的治療方法，但腎臟灌注急劇增加，缺血再灌注反而會進一步加重腎臟的損傷［2-4］。缺血再灌注損傷導致活性氧（ROS）大量產生，進而進一步擴大炎癥反應，加重腎臟損傷［5-7］。據統計，在ICU病房，大約30%的失血性休克患者伴有腎臟功能損傷，因此闡明失血性休克早期腎臟損傷的機制成為研究重點。研究表明在失血性休克肺損傷的小鼠模型中發現血清中和肺組織中的IL-1β表達升高［8-10］，而NLRP3炎癥小體能夠促進IL-1β的活化，因此推測在失血性休克誘導的腎臟損傷早期NLRP3炎癥小體可能也參與介導了其發生發展過程。本研究采用經典的失血性休克模型，對失血性休克早期腎臟功能及腎臟皮質內NLRP3炎癥小體的表達及腎皮質炎癥水平進行研究。

1　材料與方法

1.1實驗動物

采用雄性成年SD大鼠，8～9周，體重200～250 g，由第四軍醫大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（軍2012-0007）。在SPF級的實驗條件下，12 h晝夜循環，室溫25℃左右，為其提供充足的飲水以及進食。

1.2動物分組及大鼠失血性休克模型的建立

實驗前禁食12 h。將領取的動物按照隨機數表法分為假手術組（對照組）、失血性休克組（實驗組）、失血性休克優降糖干預組（干預組），每組各9只。三組試驗用大鼠提前1 d于右側腹股溝部位脫毛備皮，采用腹腔注射1%戊巴比妥鈉（50mg/kg）的麻醉方式麻醉動物，檢測大鼠角膜反射確定大鼠麻醉完好。失血性休克采用經典模型［11］，大鼠仰臥放置于恒溫（37±1）℃的工作臺上，用碘酒進行消毒，經右側腹股溝部切口，鈍性分離皮下組織，暴露股動脈、股靜脈和股神經，分離出股動脈和股靜脈，用導管PE-50分別對股動脈和股靜脈進行插管，此導管經傳感器直接與數據采集系統連接（AD Instruments，Colorado Springs，CO，USA）。

對照組在完成上述手術后不做相關失血處理，觀察1.5 h后，結扎股動脈和股靜脈，拔出導管，縫合切口。

實驗組大鼠在完成上述手術和檢測后，進行失血處理：通過股靜脈放血，股動脈讀取平均動脈血壓（MAP），從股靜脈放血，放血量為全身的60%左右，10min內MAP降到40mmHg，并將血壓控制在35～40mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），維持1.5 h，然后進行復蘇：股靜脈輸液（林格液），液體量為失血量的3倍，時間約為30min。然后結扎股動脈和股靜脈，拔出導管，縫合切口，放回動物房正常飼養。

干預組大鼠在實驗組大鼠失血的基礎上，在補液過程中同時腹腔注射優降糖［格列苯脲（SigmaAldrich，MO，USA］30 mg/kg。

1.3腎靜脈血和腎臟皮質的提取

三組試驗大鼠正常飼養24 h后采用腹腔注射1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg），經側腹部（距離腹正中線2 cm）切口，暴露雙側腎蒂，分離出腎靜脈，取腎靜脈血，后快速取下雙側腎臟皮質，凍存于-80℃冰箱。靜脈血提取后離心，取上層血清，-80℃冰箱凍存。

1.4血清血肌酐（Scr）和血尿素氮（BUN）的檢測

取靜脈血后，3000 r/min，4℃環境下離心10min，分離血清。去各組凍存血清，采用干化學法測定血清中的血肌酐（Scr）和血尿素氮（BUN），操作按照血肌酐和血尿素氮試劑盒說明書進行。

1.5蛋白質免疫印跡（W estern blot）測定炎癥小體NLRP3蛋白水平

取凍存腎臟組織50mg，加組織細胞裂解液500μL勻漿，提取蛋白，BCA法蛋白定量，SDS-PAGE電泳，濕轉，1%BSA室溫封閉1 h。4℃過夜孵育NLRP3（1∶400）抗兔一抗。洗膜后37℃孵育HRP標記山羊抗兔IgG二抗（1∶3000）1 h。再次洗膜后化學發光、顯影，凝膠成像分析系統行灰度掃描分析，結果以目的蛋白條帶灰度值與內參蛋白GAPDH灰度比值表示。

1.6RT-PCR測定腎臟皮質IL-1β、TNF-α的mRNA表達

取各組凍存標本，采用實時熒光定量PCR法檢測各組腎臟皮質IL-1β、TNF-α的mRNA表達。大鼠IL-1β、TNF-α、GAPDH基因引物序列如表1。

表1　大鼠IL-1β、TNF-α、GAPDH基因引物序列

按照SYBR Green熒光定量試劑盒說明書進行PCR，反轉錄體系20μL：SYBR 10μL、上下游引物各1μL、cDNA 1μL、蒸餾水8μL。反應條件：初始變性95℃30 s；PCR反應變性95℃維持15 s；退火60℃維持30 s；重復40個循環。結果處理采用2-ΔΔCt相對量的方法。

1.7統計學方法

使用統計作圖軟件GraphPad Prism6進行分析及作圖，正態分布的計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1血肌酐和血尿素氮含量變化

實驗組大鼠血肌酐、血尿素氮含量顯著高于對照組（P＜0.01），干預組大鼠血肌酐、血尿素氮含量與實驗組相比顯著降低（P＜0.01）。實驗結果提示：缺血性休克對腎臟造成了損傷，而使用炎癥小體抑制劑優降糖可以改善失血性休克后腎功能的降低。見表2、圖1。

表2　三組大鼠腎臟功能檢測結果比較（±s）

表2　三組大鼠腎臟功能檢測結果比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與實驗組比較，#P＜0.01；BUN：血尿素氮；Scr：血肌酐

組別動物只數BUN（mmol/L）Scr（μmol/L）對照組實驗組干預組9 9 9 5.23±0.54 22.89±1.23*10.19±0.89#30.76±3.88 98.56±13.54*51.08±1.83#

圖1　三組大鼠腎臟功能檢測結果

2.2失血性休克大鼠雙側腎皮質NLRP3的蛋白表達情況

失血性休克模型24 h后，取材腎臟皮質。采用Western blot方法對各組腎臟皮質的NLRP3的蛋白水平進行檢測。結果表明，實驗組腎皮質中NLRP3蛋白相對含量（0.43±0.12）顯著高于對照組（0.09±0.04），差異有高度統計學意義（P＜0.01），干預組腎臟皮質的NLRP3蛋白含量（0.19±0.02）明顯低于實驗組，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。結果提示炎癥小體NLRP3可能參與了失血性休克造成的腎臟損傷，同時優降糖處理可以抑制失血性休克后炎癥小體的活化。見圖2。

圖2　三組大鼠失血性休克后24 h腎臟中NLRP3的蛋白表達

2.3失血性休克大鼠雙側腎皮質中IL-1β、TNF-α的mRNA表達

實驗組大鼠腎皮質中IL-1β、TNF-α的mRNA表達量分別為（2.75±0.23）、（2.01±0.34），顯著高于對照組的（1.00±0.09）、（1.00±0.10），差異有高度統計學意義（P＜0.01），干預組大鼠腎臟皮質內IL-1β、TNF-α的mRNA表達量［（1.57±0.09）、（1.21±0.07）］明顯低于實驗組，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。說明NLRP3炎癥小體可能是通過促進IL-1β的活化，促進炎性反應的發生，而參與失血性休克后腎損傷的。抑制NLRP3炎癥小體活化對大鼠失血性休克后腎功能保護作用可能是通過降低腎皮質的炎癥水平所介導的。

3　討論

失血性休克是一種病情兇險、并發癥多、易導致多器官功能衰竭的急性危重病癥，其中腎臟是休克時最易受損害的器官之一，常發生急性腎損傷，甚至是腎功能衰竭。失血性休克后引起腎損傷的原因多種多樣，但失血性休克早期因組織的缺血缺氧和炎性反應導致細胞因子和炎癥介質的大量活化，是引起失血性休克早期腎損傷的重要原因［12］。NLRP3炎癥小體是一種由多種蛋白構成的復合體，它能使半胱天冬肽酶-1（caspase-1）活化，促進IL-1β由其前體向活化狀態轉變。研究表明其還能夠調節caspase-1依賴的細胞凋亡，誘導細胞在炎癥和應激的病理條件下死亡［13］。在心肌組織，之前的研究表明，缺血再灌注損傷后，心肌組織的炎癥小體NLRP3信號通路大量活化［14］。在肺組織，炎癥小體NLRP3參與了失血性休克后的全身炎性反應綜合征（SIRS）［8］。多種因素可以激活NLRP3炎癥小體，如內源性危險信號，包括線粒體損傷［15］、溶酶體損傷、ATP等，以及病原相關分子模式［16-17］。與此同時，多種損傷如缺血再灌注損傷、膿毒癥損傷誘導的腎損傷模型中，均發現NLRP3炎癥小體在其中發揮重要作用［18-19］。因此筆者根據之前的研究進行推測炎癥小體NLRP3信號通路有可能參與了失血性休克早期的腎臟損傷。本研究采用經典的失血性休克模型，對休克后24 h的大鼠進行研究，發現休克組大鼠血肌酐和血尿素氮的水平較對照組明顯升高，表明失血性休克對腎臟的功能造成了損傷，而使用優降糖進行干預，則對失血性休克后腎損傷有保護作用。同時失血性休克組大鼠腎臟皮質內的NLRP3蛋白表達較對照組顯著升高，使用優降糖進行干預的失血性休克大鼠的腎臟皮質內NLRP3的蛋白表達明顯較未干預組降低，證明NLRP3可能參與了失血性休克早期腎損傷的過程。而利用優降糖進行干預，能夠顯著降低NLRP3炎癥小體的活化，說明抑制NLRP3炎癥小體的活化對失血性休克后腎損傷有保護作用。

在失血性休克早期，單核/巨噬細胞等炎癥效應細胞迅速被激活，可促進多種前炎癥細胞因子的釋放，觸發一系列的級聯信號反應，進一步釋放炎癥介質，導致多個臟器的損害［20］。NLRP3是一種重要的炎癥因子的啟動子，可活化多種細胞因子前體使其激活，釋放更多的炎癥介質和細胞因子，使組織損傷加重，抑制NLRP3的活化可以改善失血性休克后的炎癥。為了探究優降糖對失血性休克后腎功能的保護作用機制，我們進一步檢測了失血性休克后腎皮質的炎癥水平。

本研究結果表明，失血性休克后腎皮質NLRP3的表達顯著升高，優降糖可明顯降低NLRP3的信號通路活化，并逆轉腎功能，NLRP3信號通路參與了失血性休克腎損傷的過程，抑制NLRP3信號通路可改善腎臟損傷。因此，本研究為臨床上治療失血性休克早期腎臟損傷提供了新的思路和實驗依據。

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Effect of NLRP3 inflamm asome in kidney injury of rats after hemorrhagic shock

ZHANG Qiang1TAN Chao1，2LIAxing1HE Yanping1
1.First Department of Surgery，Xi＇an 141st Hospital，Shaanxi Province，Xi＇an 710089，China；2.Department of Urology，Xijing Hospital，Fourth Military Medical University，Shaanxi Province，Xi＇an 710032，China

Ob jective To study the expression and effect of NLRP3 inflammasome in hemorrhagic shock rats kidney. Methods 27 ratswere randomly divided into three groups：sham group（control group），hemorrhagic shock group（experiment group），glybenclamide treatment group（intervention group）.Experimental rats were made into hemorrhagic shock model.Serum creatinine（Scr）and blood urea nitrogen（BUN）weremeasured after successfulmodeling 24 h.The protein expression of NLRP3 were examined byWestern blot and themRNA expression of IL-1βand TNF-αwere examined by RT-PCR in the cortex of kidney.Resu lts①The value of Scr and BUN in serum of experiment group were higher than those of control（P＜0.01）.The value of Scr and BUN in serum of intervention group were lower than those of experiment group（P＜0.01）.②The protein expression of NLRP3 in the cortex of kidney of experiment group were significantly higher than that of control group（P＜0.01）.The protein expression of NLRP3 in the cortex of kidney of intervention group were lower than those ofexperiment group（P＜0.01）③ThemRNA expression of IL-1βand TNF-α in the kidney cortex of experiment group were significantly higher than those of control group（P＜0.01）；the IL-1β and TNF-αmRNA expression in the kidney cortex of intervention group was significantly lower than those of experiment group（P＜0.01）.Conclusion Rats with hemorrhagic shock have renal damage，with NLRP3 inflammasome activites and increases inflammatory reaction in the kidney cortex.The use of NLRP3 inflammasome inhibitor glibenclamide，significantly inhibites the activation NLRP3，reduces kidney inflammation，improves kidney features.

Hemorrhagic shock；Kidney；Inflammasome；NLRP3；Inflammation

R459.7

A

1673-7210（2016）06（c）-0029-04

賀彥平（1965.9-），男，主任醫師；研究方向：腔鏡泌尿外科學。

（2016-03-25本文編輯：蘇暢）