不同芝麻種質資源對莖點枯病和枯萎病的雙抗鑒定

染路徑并穩定反映品種差異，因此更適用于抗性鑒定。不同接種方法對小麥籽粒脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON，Deoxynivalenol）含量有顯著影響，咸莉梅等[2以Fhb1近等基因系為材料，同時用3種方法進行赤霉菌接種，收獲后發現穗基部雙花滴注法DON含量在抗、感近等基因系間無顯著差異，基部穗軸注射法DON含量差異在抗、感近等基因系間達到了顯著水平，而在穗頂部雙花滴注法下抗、感材料間DON含量差異最大化，達極顯著差異水平。葉蕾[3]對大白菜根腫病發病情況進行研究，發現不同接種方法對接種濃度的要求不同，菌土法最佳濃度為 1×10⁶CFU/mL ，灌根法需 1×10⁷CFU/mL 才能引起根毛侵染和皮層病變。張志博等從不同培養基種類、碳源、氮源 ?^pH 值、溫度、光照以及致死溫度等方面研究禾谷鐮孢菌的生物學特性，結果表明供試禾谷鐮孢菌在 10～30^°C 之間均可以生長，最適生長溫度為 25°C ，最適生長 pH 值為8，最適生長條件為 12h/d 光暗交替培養，最好的碳源是葡萄糖。由此可見，優化接種方法需綜合考慮病原菌生物學特性、寄主生育階段、接種部位、菌液濃度、環境控制參數等，多方法聯合驗證，最終建立統一的操作規范，提高抗性評價的全面性和準確性。

莖點枯病和枯萎病是芝麻生產上常見的2種病害。芝麻莖點枯病是由病原真菌菜豆殼球孢（Macrophominaphaseolina（Tassi）Goid）侵染引起的土傳病害，可導致芝麻減產 20%～50% ，嚴重時絕收，且降低籽粒品質和土地可持續利用能力。芝麻枯萎病的侵染源是尖孢鐮刀菌芝麻專化型（Fusariumoxysporumf.sp.sesami），在芝麻整個生育期均可被侵染[5]。生產實踐表明，培育和利用抗病品種是病害綜合防治中最安全經濟且有效的關鍵技術。因此，系統鑒定抗性種質、合理利用抗病資源、培育抗病良種并在生產上合理利用，對于持續控制病害的發生和危害，確保芝麻安全生產具有重要的理論意義和實際應用價值。本研究早期收集到一批芝麻地方資源，經田間自然發病，初步鑒定出其中10% 以上的種質具有芝麻莖點枯病或枯萎病中等以上抗性，在此基礎上通過室內接種鑒定，旨在進一步確定并篩選出芝麻莖點枯病和枯萎病雙抗種質資源并用于芝麻抗病育種。

1材料與方法

1.1試驗材料47份芝麻種質資源（入庫保存均以編號命名）由湖南省作物研究所提供，為2019-2020年從湖南省各地收集的芝麻地方種質資源。芝麻莖點枯病病原菌菜豆殼球孢菌株（1份）和芝麻枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌芝麻專化型菌株（1份）均由河南省農業科學院芝麻研究中心提供。

1.2芝麻種質資源培育選取健康飽滿種子，經清水沖洗后，在超凈工作臺上分別用 70% 酒精處理30s.3% 次氯酸鈉處理 15min ，無菌水沖洗 3～5 次后，于 120r/min.25°C 條件下振蕩培養24h催芽。取無菌蛭石與無菌土混勻（比例 1：2 ），等份分裝于盆缽中。將催芽露白的無菌芝麻種子播種在盆缽中，每缽10粒，于 26°C，12h/d 光暗交替培養育苗，相對濕度為 80% ，水肥常規管理。

1.3菌種制備菜豆殼球孢的制備取菌落邊緣少許菌絲塊，轉接至新的馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板，28°C 條件下暗培養3d。將活化后的菌株接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂液體培養基中，于 160r/min.28% 條件下振蕩培養7d。取部分體積的菌絲懸浮液，加無菌水配制成20倍稀釋液（含1/10000吐溫），接種備用。

尖孢鐮刀菌芝麻專化型的制備取菌落邊緣少許菌絲塊，轉接至新的馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板，28°C 條件下暗培養3d。將活化后的菌株接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂液體培養基中，于 160r/min，28°C 條件下振蕩培養5d。將搖培物打碎，用2層無菌紗布過濾，制備出尖孢鐮刀菌芝麻專化型菌株分生孢子懸浮液。用無菌水稀釋配制成 1×10⁶CFU/mL 的分生孢子懸浮液（含 1/10000 吐溫），接種備用。

1.4接種鑒定浸根法芝麻幼苗4～5對真葉期，剔除弱苗及死苗后，采用稀釋的菌絲懸浮液進行浸根接種，將待接種芝麻盆栽幼苗放置于盛有菌液的塑料方盒中，按每盆 30mL 菌液進行定量浸根，菌液從育苗盆底部通過幼苗根自行吸收和侵染。清水處理作對照，每個處理20株苗，3次重復。 26°C 、15h/9h 光照/黑暗交替培養，濕度為 80% 。5～7d澆灌1次營養液，隨時觀察植株生長情況。

灌根法芝麻幼苗4～5對真葉期，剔除弱苗及死苗后，采用稀釋的菌絲懸浮液進行滴灌接種，將待接種芝麻盆栽幼苗放置于塑料方盒中，按每盆

30mL 菌液進行定量處理，菌液沿著育苗盆植株幼苗莖基部緩慢滴灌，菌液自土層滲透下沉，使土層中芝麻幼苗主根和須根吸收和侵染。清水處理作對照，每個處理20株苗，3次重復。 26°C，15h/9h 光照/黑暗交替培養，濕度為 80% 。 5～7d 澆灌1次營養液，隨時觀察植株生長情況。

1.5綜合抗性評價根據芝麻苗期莖點枯病發生癥狀，參考高樹廣等的方法，將芝麻苗期莖點枯病發生等級劃分為0～4級。根據植株的根部癥狀和莖稈病斑發生長度進行分級，計算各處理病情指數（DI）和抗性指數（RI），根據《芝麻種質資源描述規范和數據標準》[]中的抗性指數劃分抗性等級。

根據芝麻苗期枯萎病發生癥狀，參考仇存璞等[8]的方法，將芝麻苗期枯萎病發生等級劃分為0～2級。根據植株的根部癥狀和莖稈病斑發生長度進行分級，計算各處理病情指數（DI）和抗性指數（RI），根據《芝麻種質資源描述規范和數據標準》[7]中的抗性指數劃分抗性等級。

評價47份芝麻種質資源對莖點枯病和枯萎病的綜合抗性水平，并進行大致分類。I類資源抗或高抗莖點枯病和枯萎病，Ⅱ類資源感或高感莖點枯病、抗或高抗枯萎病，Ⅲ類資源抗或高抗莖點枯病、感或高感枯萎病，V類資源感或高感莖點枯病和枯萎病。

1.6數據分析采用MicrosoftOfficeExcel2010軟件統計數據，計算平均值、標準差等。

2 結果與分析

2.1芝麻種質資源對莖點枯病的抗性表現對47份湖南芝麻種質資源進行莖點枯病抗性鑒定（表1、表2）。結果表明：浸根法接種28d后病株率為0～57.73% ，平均病株率為 18.83% ，變異系數為 75% ：病情指數為 0～15.84 ，平均病情指數為5.33，變異系數為 75% ；選擇抗病性中等的種質資源HN091-1作為2種方法的對照材料進行抗性指數的計算，可將47份芝麻種質資源劃分為3種抗性類型，有3份資源為高抗，15份資源為抗病，27份資源為感病， 無癥狀或可能沒有接種成功。灌根法接種28d后病株率為 72.60%～100% ，平均病株率為 93.56% ，變異系數為 7% ;病情指數為21.10～72.79，平均病情指數為38.47，變異系數為31% ；抗性類型分為2種，有24份資源為抗病，23份為感病。2種接種方法均表現抗病或高抗的資源有12份，同時表現感病的資源有16份，17份芝麻種質在2種接種方法中抗、感類型顛換。從2種方法抗病表現較為一致的材料中篩選，芝麻莖點枯病綜合抗性較強的資源是HN094-1、HN012，綜合抗性較弱的資源是 HN011，HN014 。

灌根法接種后平均病株率和病情指數更高、變異系數更小，說明在同等條件下采用灌根法接種，芝麻發病程度更加充分和穩定。雖然浸根法接種的病株率極差和標準差高于灌根法接種，但因為有2份資源無癥狀表現，可能存在接種不成功的情況，而灌根法接種的病情指數極差和標準差都遠高于浸根法接種，更能分辨出不同芝麻種質資源對莖點枯病的抗性水平。

2.2芝麻種質資源對枯萎病的抗性表現對47份湖南芝麻種質資源進行枯萎病抗性鑒定（表3、表4）。結果表明：浸根法接種28d后病株率為14.12%～97.32% ，平均病株率為 48.86% ，變異系數為 37% ；病情指數為 10.19～75.83 ，平均病情指數為37.64，變異系數為 39% ；選擇抗病性中等的種質資源HN062作為2種方法的對照材料進行抗性指數的計算，可將47份芝麻種質資源劃分為4種抗性類型，有1份資源為高抗，15份抗病，30份感病，還有1份為高感。灌根法接種28d后病株率為 17.31%～98.48% ，平均病株率為 72.41% ，變異系數為 27% ;病情指數為9.45～97.73，平均病情指數為63.14，變異系數為 36% ；抗性類型分為4種，3份資源高抗，9份抗病，27份感病，8份高感。2種接種方法均表現抗病或高抗的資源有8份，同時表現感病或高感的資源有27份，12份種質資源在2種接種方法中抗、感類型顛換。從2種方法抗病表現較為一致的材料中篩選，芝麻枯萎病綜合抗性較強的資源是 HN094-1.HN094 ，綜合抗性較弱的資源是HN008-1，HN021 。

灌根法接種的平均病株率和病情指數更高、變異系數更小，表明此方法接種可使芝麻發病更加充分。灌根法接種與浸根法接種的病株率極差和標準差相當，但灌根法接種的病情指數極差和標準差高于浸根法，可見通過灌根法接種，芝麻種質資源的發病嚴重程度差異更大，更能反映出對枯萎病的抗性水平。

表147份湖南芝麻種質資源對莖點枯病的抗性表現

表2芝麻莖點枯病2種接種方法的主要參數比較

表347份湖南芝麻種質資源對枯萎病的抗性表現

表4芝麻枯萎病2種接種方法的主要參數比較

2.3芝麻抗莖點枯病與枯萎病的種質資源篩選與評價根據47份芝麻種質資源對莖點枯病和枯萎病的抗病表現，篩選出22份在2種接種方法中抗感表現較為一致的資源（抗感表現稍有不同的以灌根法的結果為準），并對其綜合抗性水平進行分類（表5）。1類資源有2份，Ⅱ類資源有3份，IⅢ類資源有9份，V類資源有8份。22份資源中，抗莖點枯病的資源占 50.0% ，抗或高抗枯萎病的資源占 22.7% 。I類資源可作為首選抗源用于芝麻育種（圖1）。

3 討論與結論

3.1芝麻枯萎病抗性鑒定方法芝麻莖點枯病和枯萎病發生周期長，發病程度受多種因素的影響，根據病害類型、寄主生長階段、資源條件選擇匹配的接種技術，并通過標準化操作與多方法驗證可確保鑒定結果的可靠性。王文泉等[將帶菌棉籽大量擴繁，田間播種時開溝接菌，盛花期分2次調查，以小區為單位計算芝麻枯萎病病情指數、擴展速度和平均嚴重度。仇存璞等[將催芽露白的無菌芝麻種子播種在紙缽中，采用 1×10⁶CFU/mL 分生孢子懸浮液與無菌蛭石和無菌土壤按體積 1：2：6 比例混合接菌（最終接菌濃度為 1.4×10⁵CFU/g 土壤），于 25^°C，12h/d 光暗交替培養，相對濕度為 80% ，幼苗在接菌后第7天開始出現枯萎病癥狀，調查菌株致病性的最佳時間為接菌后第25～28天。朱強賓等[將適量菌株濾液加入MS培養液，使鐮刀菌酸濃度分別為 1μg/mL，5μg/mL 和 10μg/mL ，然后在MS培養液中加入瓊脂粉 5g/L，121^qC 高壓滅菌后冷卻待用；挑選露白的無菌芝麻種子分別接種在上述MS固體培養基上， 25^°C?14h/10h 光照/黑暗下培養；2周后調查，發現芝麻幼苗隨著菌液濃度的增加生長受抑制程度越明顯。苗紅梅等[進行營養生長時期（2對真葉至現蕾期）芝麻種質對尖孢鐮刀菌芝麻專化型菌株的抗性水平鑒定，結果表明，1×10⁶～5×10⁶CFU/mL 濃度下，植株蘸根接菌處理1～2周即可發病，第4周樣本枯萎病病情指數趨于穩定。本研究中采用浸根法和灌根法鑒定芝麻枯萎病抗感類型，發現采用灌根法接種的發病程度差異更大，更能反映出芝麻種質資源對枯萎病的抗性水平。

3.2芝麻莖點枯病抗性鑒定方法李麗麗等[12]在蒴果發育期至成熟期間調查芝麻莖點枯病的發病情況，田間自然誘發鑒定設置在多年連作地塊，或在播種溝內均勻撒入芝麻病稈粉促進病害發生，要求對照平均發病率達到 40% 以上；人工接種鑒定除了在播種溝中撒病稈粉，還在現蕾期和盛花期各噴布1次分生孢子和小菌核的懸浮液，要求對照平

表5芝麻種質資源對莖點枯病和枯萎病的抗性表現

圖1雙抗資源HN093、HN094-1的抗性表現

a～c 分別為HN093、HN094-1、HN091-1（CK）浸根法接種莖點枯病菌;d-f分別為HN093、HN094-1、HN091-1（CK）灌根法接種莖點枯病菌；g～i分別為HN093、HN094-1、HN062（CK）浸根法接種枯萎病菌;j-1分別為HN093、HN094-1、HN062（CK）為灌根法接種枯萎病菌

均發病率達到 50% 以上。張秀榮等[13]發明了一種鑒定芝麻莖點枯病和枯萎病病原菌致病性的方法，在培養瓶中加入滅菌培養基，凝固后鋪放一層無菌濾紙，添加少量無菌水浸潤濾紙，然后沿濾紙邊緣均勻擺放芝麻無菌種子，再在濾紙中央接種菌餅，密閉黑暗培養5d，調查芝麻幼苗的發病情況。劉莉銘等[4采用菌絲懸浮液灌根侵染芝麻幼苗，該接種方法能夠保證每個單株充分發病，并且發病重復性較好。閆文慶[1在 100mL 菌絲懸浮液中加人 100mL 蒸餾水，然后與 200g 無菌的草炭土（草炭土：蛭石 =3：1 ）攪拌混勻得到帶菌土壤，將3對真葉的芝麻植株從生長缽中移栽到制備好的菌土中，觀察發病情況。本研究中浸根法接種芝麻莖點枯病有2份資源無癥狀表現，可能存在接種不成功的情況，灌根法則使芝麻植株發病更加充分和穩定，篩選出對莖點枯病的抗性穩定且較強的芝麻種質資源。

3.3芝麻莖點枯病和枯萎病抗性品種的選育針對我國芝麻品種產量低、抗病性差等突出問題，育種家們致力于高產、抗病芝麻新品種的創制與選育，促進了芝麻品種改良和產業進步。生產上已有大量抗病性強的品種投入使用，如鄂芝1號在湖北省區域試驗中平均發病率在 10% 左右，病情指數5.8；湖北省生產示范中發病率僅 5% 左右，災害年份不超過15%^[16] ;中芝12莖點枯病和枯萎病病情指數分別為6.56和 1.62^[17] ；中芝35病情指數分別為6.27、3.12，抗病性均較好[18];周芝12號莖點枯病和枯萎病病情指數分別為7.75、4.74，屬高抗枯萎病和抗莖點枯病品種[19]。本研究從47份芝麻種質資源中篩選出22份在2種接種方法中抗感表現較為一致的資源，其中HN093（大廣白芝麻）對2種病害均表現抗病，HN094-1（石橋白芝麻）對莖點枯病表現抗病，對枯萎病表現高抗，這2份雙抗資源可作為中間材料，用于芝麻抗病育種。

芝麻莖點枯病和枯萎病均為土傳病害，主要從寄主根部侵染，防治難度大，尤其是枯萎病，只通過土壤傳播，種子藥劑處理往往只在芝麻生長初期有效，隨著植株的生長，藥劑不再發揮作用。研究表明，芝麻莖點枯病病原菌只存在于種皮上，而不存于子葉和胚軸上，通過溫湯浸種的方法可以有效殺菌[20]。盡管如此，莖點枯病和枯萎病仍然是芝麻最嚴重的兩大病害，目前研究最多的是通過拮抗菌進行生物防治，研究人員對曲霉屬[21-22]、木霉屬真菌[23-24]，芽孢桿菌[25-26]等細菌，甚至病原菌的內源病毒的拮抗作用進行了大量體外測試，均有較好的效果，但在生產上仍存在應用瓶頸，抗病育種依然是芝麻病害防治的主要手段。研究人員通過抗病性鑒定篩選出抗病種質、開發抗病相關分子標記，利用抗病基因、抗病蛋白研究抗病機制，選育出了具有持久、廣譜抗病性的芝麻新品種，提高了我國芝麻產區的整體抗性水平。

致謝：特別感謝河南省農業科學院芝麻研究中心苗紅梅研究員為本研究提供試驗用菌株。

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