齒蘭環斑病毒RT-RPA熒光實時檢測體系的構建與應用

摘" 要：齒蘭環斑病毒（Odontoglossum ringspot virus， ORSV）是危害蘭花的主要致病病毒之一，該病毒導致蘭花葉片黃化、出現斑塊，花朵畸形，對蘭花的觀賞性和商業價值影響極大。為實現ORSV的早期快速檢測，本研究根據GenBank數據庫中蘭花齒蘭環斑病毒外殼蛋白cp基因的保守區域設計、篩選RT-RPA引物和探針，優化擴增條件，建立基于RPA的ORSV快速檢測技術；對RT-RPA特異性和靈敏性進行測定，并通過開展田間樣品檢測試驗，以驗證該檢測技術在生產上的應用可行性。結果表明：RT-RPA的最佳擴增引物組合為F1/R1，熒光探針為P1，最佳擴增溫度為41 ℃，擴增時間為20 min；特異性良好，對建蘭花葉病毒、黃瓜花葉病毒無交叉反應；靈敏度較高，ORSV核酸最低檢測濃度達到2.8×10^–5 ng/μL。田間樣品檢測中，采用齒蘭環斑病毒為陽性對照，ddH₂O為陰性對照，20份蝴蝶蘭樣本均檢出ORSV，與TaqMan探針RT-qPCR （real time quantitative PCR）檢測結果一致。本研究建立的ORSV RT-RPA熒光實時檢測技術，具有快速、靈敏、準確和簡便的優點，且適用于田間樣品檢測，為蘭花病害預防、切斷感染源和控制ORSV的傳播提供有效方法，有助于蘭花產業的健康發展。

關鍵詞：蘭花；齒蘭環斑病毒；反轉錄-重組酶聚合酶擴增（RT-RPA）；檢測中圖分類號：S436.8 """""文獻標志碼：A

Construction and Application of RT-RPA Fluorescence Real-time Detection System for Odontoglossum Ringspot Virus

WU Jieqiu， ZHUANG Huacai， TAN Zhiyong， LI Zaowen， FAN Junqiang， FU Haiping， XU Cong^*

Dongguan Agricultural Science Research Center， Dongguan， Guangdong 523000， China

Abstract： Odontoglossum ringspot virus （ORSV）， one of the major pathogens affecting orchids， seriously degrade the ornamental and economic value of orchids by causing leaf chlorosis， mottling， and floral deformities. To enable early-stage diagnosis， this study developed a rapid reverse transcription-recombinase polymerase amplification （RT-RPA） assay targeting ORSV. Primers and a fluorescent probe were designed based on conserved regions of the ORSV coat protein （CP） gene. Specificity， sensitivity and field applicability of the assay were systematically validated in this study. Results identified F1/R1 as the optimal primer pair， enabling amplification within 20 minutes at 41 ℃. The method exhibited high specificity， distinguishing ORSV from Cymbidium mosaic virus and Cucumber mosaic virus， and achieved a detection limit of 2.8×10^–5 ng/μL total RNA. Practical verification result of 20 Phalaenopsis field samples showed 100% concordance with TaqMan qPCR results. The RT-RPA assay would provide a rapid， sensitive， and field-deployable tool for ORSV surveillance， supporting timely disease management and sustainable orchid cultivation. Its simplicity and reliability make it particularly valuable for large-scale screening in industrial orchid production systems.

Keywords： Orchidaceae; Odontoglossum ringspot virus （ORSV）; reverse transcription-recombinase polymerase amplification （RT-RPA）; detection

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.07.021

蘭科（Orchidaceae）植物，也稱蘭花（orchid），是物種最豐富的植物之一，大約有30 000種，其花朵美麗獨特、顏色鮮艷，芳香四散，受到世界各地人們的喜愛，是國際花卉市場的熱銷花卉之一^[1-2]。除經濟效益外，蘭花還有生態、觀賞、藥用、美學和文化等諸多價值，廣泛用于食品、醫藥、化妝品、飲料、傳統工藝等領域^[3-4]。然而，蘭花在栽植過程中遭受病蟲等危害，尤其是病毒侵染引起的種質退化、產量和質量下降已經成為蘭花生產的一個棘手問題，目前尚無有效的防治措施，一旦感染病毒病則會造成很大的經濟損失。目前，全球蘭花病毒大約有57種^[5]，齒蘭環斑病毒（Odontoglossum ringspot virus，ORSV）作為蘭花的主要致病病毒之一，對蘭花的影響廣泛，危害嚴重。ORSV基因組是正義單鏈RNA病毒，全長6618 bp^[6-7]，為煙草花葉病毒屬（Tobamovirus），病毒顆粒直桿狀，大小約300"nm×18 nm^[7-8]。ORSV一般通過機械傳播，主要寄生在蘭花中，但不同蘭屬（種）感染病毒后癥狀表型不一，有的蘭株無明顯癥狀，難以發現，有的植株葉片有黃化條紋或褪綠斑塊、壞死斑、黑斑等，還有些花朵呈現褪色斑、畸形等癥狀，從而導致寄主植株觀賞性差甚至死亡^{[6， 9-15]}。目前，市場上尚無能徹底清除蘭花病毒病病原體的有效藥劑，因此，通過及時開展病毒檢測，隔離和清除病株，預防傳播，獲取脫毒種苗，對提高蘭花產品質量，減少經濟損失具有重要意義。

目前檢測ORSV的技術有自然接種形態學^[16]和電鏡鑒定^{[8， 17]}、血清學鑒定^{[9， 17-23]}及逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）法^{[13， 15， 22-27]}、實時熒光定量PCR法^{[12， 28-30]}、逆轉錄環介導等溫擴增（RT-LAMP）^[31-33]等分子生物學技術。RT-PCR、熒光定量PCR等分子檢測技術能準確檢測病毒，靈敏性高，但實驗操作不夠簡捷，如非恒溫熱循環擴增、逆轉錄和擴增需單獨開展等^[34]，PCR反應時間需約90 min以上^[35-37]，耗時較長；RT- LAMP技術操作簡單、成本低，但是引物設計復雜，靈敏性過高容易產生假陽性^[38-39]。PIEPENBURG等^[40]開發的重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification， RPA）是一種恒溫核酸體外擴增技術，在37～42 ℃恒溫條件下，重組酶、單鏈結合蛋白和DNA聚合酶聯合作用促使DNA指數級擴增，通過凝膠電泳、側向流動試紙、實時熒光定量PCR儀等手段將檢測結果可視化，該方法快速簡便，反應迅速（5～20 min），靈敏性高^[41]。目前已應用于大麥黃矮病毒GAV（Barley yellow dwarf viruses-GAV， BYDV-GAV）^[38]、菊花B病毒（Chry-santhemum virus B， CVB）和番茄不孕病毒（Tomato aspermy virus， TAV）^[42]、柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus， CTV）^[41]、鳳仙花壞死斑病毒（Impatiens necrotic spot virus， INSV）^[36]等多種病毒的檢測。采用RAP檢測ORSV的相關報道較少，SUN等^[43]以ORSV cDNA和質粒為模板進行RPA擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測產物，建立了RT-RPA檢測系統。國內尚無相關文獻報道。

本研究以ORSV外殼蛋白（coat protein， cp）基因序列保守區域為標靶設計RT-RPA特異性擴增引物和熒光探針，優化試驗條件，構建穩定的逆轉錄-聚合酶指數擴增（reverse transcription- recombinase polymerase amplification， RT-RPA）熒光實時檢測ORSV的方法，并開展田間樣品檢測。該方法能夠在30 min內有效檢測出齒蘭環斑病毒，達到快速、靈敏、準確和簡便的效果，實現“一步法”檢測ORSV，為蘭花病害檢測和防治提供新的有效方法。

1" 材料與方法

1.1 "材料

齒蘭環斑病毒（ORSV）、建蘭花葉病毒（Cymbidium mosaic virus， CymMV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）購自美國Agdia公司。從花卉市場購買20株蝴蝶蘭，采集葉片進行ORSV田間檢測。

RNA恒溫快速擴增試劑盒（熒光型）購自安普未來生物有限公司，SteadyPure Virus DNA/ RNA Extraction Kit購自艾瑞科生物有限公司。

1.2" 方法

1.2.1" RT-RPA擴增引物和探針設計" 從GenBank數據庫中搜索齒蘭環斑病毒基因序列，進行對比分析找到保守區域，并在NCBI上設計上游引物（F1、F2、F3）、下游引物（R1、R2、R3）各3條以及1條熒光探針（P1），引物序列見表1。引物和探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2" RT-RPA熒光檢測體系優化及引物篩選" 以齒蘭環斑病毒RNA為模板，使用上游引物F3分別與下游引物R1、R2、R3配對，加入熒光探針P1，進行擴增檢測，根據擴增曲線情況篩選出最佳下游引物R_n。然后將下游引物R_n分別與上游引物F1、F2、F3組合，加入熒光探針P1進行第2次RT-RPA，篩選出最佳上游引物F_n，進而確定最佳引物組合作為后續檢測引物。

RT-RPA熒光檢測反應體系（50 μL）：A為29.4"μL buffer，B為2.5 μL buffer，上下游引物（10"μmol/L）各2 μL，熒光探針（10 μmol/L）0.6"μL，模板RNA 1 μL，ddH₂O 12.5 μL。反應程序：41 ℃條件下反應20 min，每30 s收集1次熒光信號，在QuantStudio1實時熒光定量PCR儀（Thermo scientific，美國）中，41 ℃恒溫擴增30 s，40個循環。

1.2.3" 引物特異性檢測" 以齒蘭環斑病毒、建蘭花葉病毒和黃瓜花葉病毒RNA為模板，ddH₂O為陰性對照，進行擴增檢測，評估其特異性。反應體系、條件和程序同1.2.2。

1.2.4" 引物靈敏性檢測 "對齒蘭環斑病毒RNA以10倍梯度（10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷）進行稀釋，以上述稀釋液為模板進行擴增，然后基于實時熒光定量PCR數據解析擴增曲線，評估靈敏度。反應體系、條件和程序同1.2.2。

1.2.5" 蘭花葉片總RNA提取" 稱取蝴蝶蘭嫩葉100"mg，加入液氮研磨成粉末狀，按照SteadyPure Virus DNA/RNA Extraction Kit試劑盒說明書，并根據實際情況作適當修改。抽取總RNA，經NanoDrop Life超微量分光光度計（Thermo Scientific）測定和調整濃度后，置于–80"℃保存，備用。

1.2.6" 蘭花齒蘭環斑病毒田間檢測" 隨機抽取20個蝴蝶蘭葉片樣品RNA為模板，以齒蘭環斑病毒RNA為陽性對照，ddH₂O為陰性對照（NC），按照所建立的RT-RPA熒光檢測體系和TaqMan探針RT-qPCR法進行檢測，分析RT-RPA熒光檢測法對田間樣品的適用性。RT-RPA熒光檢測方法同1.2.2。

TaqMan探針RT-qPCR法檢測ORSV采用Luna^?通用探針一步法RT-qPCR試劑盒（manual-E3006， New England Biolads， USA），擴增引物（ORSV TF和ORSV TR）和探針（ORSV 探針）序列從文獻[44]獲得（表1），送生工生物工程（上海）股份有限公司合成。20 μL擴增體系：Luna Universal Probe One-Step Reaction Mix （2×） 10"μL，Luna WarmStart RT Enzyme Mix （20×） 1"μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，熒光探針0.4 μL，模板RNA 1 μL，ddH₂O 6 μL。反應條件：55 ℃反轉錄10 min；95 ℃變性1 min；95 ℃退火10 s；60 ℃延伸30 s，40個循環。

2" 結果與分析

2.1" RT-RPA熒光檢測體系優化及引物篩選

采用齒蘭環斑病毒RNA作為模板，以F3為上游引物，分別與下游引物R1、R2、R3組合反應，結果如圖1A所示，F3/R1引物組合的擴增曲線熒光起峰時間最早，信號響應值最大，其次為F3/R2引物組合，F3/R3引物組合熒光信號相對較弱。

進一步以R1為下游引物，篩選最佳上游引物。結果如圖1B所示，F1/R1引物組合的擴增曲

線熒光信號最強，強度響應值高于F2/R1和F3/R1引物組合。F2/R1引物組合的熒光起峰時間晚于F3/R1，但F2/R1引物組合的熒光強度響應值高于F3/R1。綜上，RT-RPA熒光檢測體系擴增的最佳溫度為41 ℃，擴增時間為20 min。選擇F1/R1引物組合以及熒光探針P1進行后續測試。

2.2" RT-RPA熒光檢測體系特異性分析

采用ORSV、CymMV及CMV 3種不同病毒RNA為模板，以ddH₂O為陰性對照，按照優化的RT-RPA熒光檢測體系分析擴增特異性。結果如圖2所示，以ORSV為模板的RT-RPA擴增線型及熒光信號強度響應值顯著，而CymMV、CMV以及ddH₂O所在的擴增曲線未見起峰。結果表明，優化的RT-RPA熒光檢測體系及其擴增引物組合F1/R1和熒光探針P1與其他病原體無明顯交叉反應，能特異性檢測出ORSV。

2.3" RT-RPA熒光檢測體系靈敏性分析

以10倍梯度稀釋的齒蘭環斑病毒RNA為模板，分別進行RT-RPA熒光實時檢測。擴增結果如圖3所示，稀釋10¹～10⁵倍的ORSV在反應中均產生熒光信號，其中稀釋10倍的ORSV擴增曲線峰值最高，稀釋10⁵倍的ORSV峰值最低，而稀釋10⁶和10⁷倍的ORSV擴增信號接近0。說明利用RT-RPA檢測的齒蘭環斑病毒RNA濃度最低為2.8×10^–5 ng/μL。

2.4" RT-RPA熒光檢測體系田間樣品檢測

以20份蝴蝶蘭葉片總RNA為模板，分別進行RT-RPA擴增。田間樣品檢測結果如圖4A所示，22條擴增曲線中，除陰性對照ddH₂O（NC）無熒光信號外，陽性對照ORSV和20份樣本均有陽性擴增，熒光信號強度響應值良好。利用該批樣品進行TaqMan探針RT-qPCR檢測（圖4B），分析熔解曲線可知，ORSV陽性對照及20份田間樣品的C_t值在13～23之間，△Rn（熒光強度）gt;1，ORSV基因陽性擴增明顯，而ddH₂O的C_t值為35，△Rnlt;1，無擴增。2種檢測方法結果一致，表明RT-RPA熒光實時檢測技術能準確檢測ORSV，具有較高的可靠性。

3" 討論

蘭科植物花朵美麗、顏色鮮艷、香氣宜人，全身均可入藥養生，具有極大的觀賞和經濟價值，然而隨著蘭花進出口貿易的發展，病蟲害傳播也愈加嚴重，尤其病害，嚴重降低了其價值，造成很大的經濟損失。ORSV是危害蘭科植物的重要病毒病源之一，以蘭花為主要自然宿主，在蘭花中廣為流行，造成病株葉片黃化、產生斑塊，花朵畸形，部分蘭株癥狀不明顯致使潛伏病毒交叉感染，導致蘭花品質不佳甚至死亡^{[9， 15， 18]}。ORSV的早期檢測有利于及時采取防治措施，減少ORSV為害和傳播，對提高蘭花產品質量、種質保存尤為重要。

目前應對蘭花病毒病的手段主要是通過早期檢測、銷毀和隔離病源，做好預防措施。近年來采用的PCR、RT-LAMP等檢測技術耗時較長，要求較高，操作復雜，雖然靈敏性高，但假陽性機率也高^[38]。而RT-RPA在恒溫條件下，反應體系的逆轉錄酶以RNA為模板直接合成cDNA第1鏈后進行重組酶擴增反應，反應迅速、靈敏，特異性高^{[39， 42]}，已被應用于多種病原體的檢測。本研究優化、建立了檢測齒蘭環斑病毒的RT-RPA熒光實時檢測方法，能在30 min內有效檢出齒蘭環斑病毒，具有良好的特異性、高效性和靈敏性，成本低、操作簡便等優點，為ORSV檢測提供一種更加方便快捷的方法。

RT-RPA引物設計簡單，利用PrimerPremier等常用設計軟件即可獲得合適的核酸擴增引物^[45]，謝錦^[46]設計的3種病原體各4對（共12對）引物均可擴增出條帶。張藝林等^[38]指出，植物RNA病毒檢測以總RNA（含有大量RNA鏈）為模板，但其引物設計是以病毒基因序列為模板，難以估測其他序列對擴增產生的影響，因此，在RT-RPA引物設計時，可嘗試增加引物數量，通過RT-RPA反應篩選最優的引物組。本研究設計了3對RT-RPA擴增引物和1條熒光探針，首先用上游引物F1篩選到最佳下游引物R1，進而使用R1篩選上游引物，各組合均具有良好的擴增效果，2次RT-RPA擴增結果一致，確定F1/R1為最佳引物組合。采用該引物組合和探針的RT-RPA熒光實時檢測體系對ORSV具有良好的特異性，與CymMV和CMV無明顯交叉反應。

高靈敏性的病毒檢測方法有助于病原體的早期檢測。通過對柑橘衰退病毒^[41]、鳳仙花壞死斑病毒^[36]、蝴蝶蘭尼潤潛隱病毒^[47]、梨樹蘋果褪綠葉斑病毒^[48]、魚類弗氏檸檬酸桿菌^[49]等研究發現，RPA的靈敏性約為PCR反應的100～1000倍。采用RT-RPA-LED在柑橘中最低可檢測到2.12× 10¹ copies/μL柑橘衰退病毒^[41]，而RT-RPA- CRISPR/ Cas12a技術對蝴蝶蘭尼潤潛隱病毒的檢測濃度最低可達到10"zg/μL^[47]。本研究設計的RT-RPA擴增引物組合F1/R1的RNA濃度最低檢測下限為2.8×10^–5 ng/μL。這些研究結果均表明RT-RPA技術具有較高的特異性和靈敏性，但RT-RPA靈敏度在不同的病原體、植物宿主及可視化方法中存在一定差異，這有待進一步深入研究比較。采用本研究建立的RT-RPA檢測技術在隨機抽取的20份蝴蝶蘭樣本中均檢測到ORSV，檢出率達到100%。表明齒蘭環斑病毒是蘭花的流行病原體之一，早期病毒檢測對病害防控意義重大。

本研究建立了RT-RPA熒光實時檢測齒蘭環斑病毒的方法，田間樣品均能檢測到ORSV，這與TaqMan探針RT-qPCR法檢測田間樣品ORSV獲得的結果一致。RT-RPA熒光實時檢測方法穩定可靠，靈敏性高，操作簡單，耗時短，RNA逆轉錄與RPA擴增在同一體系和條件下完成，實現ORSV“一步法”快速檢測。相對于常規RT-PCR技術，RT-RPA熒光實時檢測方法能夠快速精準檢測田間樣品，有助于及時消除病源，極大降低ORSV的傳播擴散，在齒蘭環斑病毒早期快速檢測中具有廣泛的應用前景。

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