基于超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱-高分辨質譜的4-氟異丁酰芬太尼體外代謝研究

近年來，全球范圍內由于阿片類毒品特別是芬太尼類物質的過量吸食導致的死亡人數大大增加。芬太尼類物質具有藥效強、起效快、成癮性弱和價格低等特點，特別是吸毒人員若不知道購買的毒品中添加了藥效更強的芬太尼類物質，更容易導致吸食過量而死亡。美國和澳大利亞等國家的統計資料顯示，自2015年起，吸食芬太尼類物質導致的死亡數量已經超過其它傳統毒品，躍居第一名。芬太尼類物質濫用已成為全球矚目的毒品問題，嚴重危害公共健康、安全和執法權威[1-6]。

4-氟異丁酰芬太尼（N-（4-Fluorophenyl）-N-（1-phenethyl piperidin-4-yl） isobutyramide， C₂₃H₂₉FN₂O 已于2018年9月列入管制目錄[7。4-氟異丁酰芬太尼與芬太尼具有相同的哌啶環及 N. -苯乙基結構，但在丙酰胺與苯胺結構部分，4-氟異丁酰芬太尼為異丁酰胺和4-氟苯胺[8-9]，如圖1所示。

探究毒品在生物體內的代謝轉化過程及其通路，可為闡明其毒性作用機制提供理論依據，而篩選具有診斷價值的特征性代謝標志物能有效擴展毒物分析的時效窗口并提升檢測靈敏度，這對濫用物質的法醫毒理學鑒定具有重要意義。結合體內外代謝模型的芬太尼轉化機制研究，可為該類藥物的檢測提供多維數據支撐。作為重要的研究手段，體外代謝模型可在受控實驗條件下再現藥物在生物體內的代謝動力學特征，主要優勢在于其相對簡單、快速、成本低且效益高，并且可以提供有關藥物代謝的有價值信息。常用的體外代謝模型有肝微粒體（Liver microsomes）和肝細胞（Hepatocytes）模型等。其中，人肝微粒體（Human liver microsomes，HLM）模型常用于研究新精神活性物質的體外代謝分析，其特點是易處理和成本低，主要用于I相代謝產物的研究[10-14]。2022 年，West Virginia 大學的Cooman 等[15]利用體內外代謝模型研究了戊烯芬太尼的代謝過程，確定其標志性代謝物為N-脫烷基化和羥基化代謝產物；2018年，日本國家警察科學研究中心的 Kanamori團隊[16-17]利用肝細胞模型對芬太尼和乙酰芬太尼的代謝過程進行了研究，證明兩種肝細胞均可有效用于濫用藥物的代謝研究；2017年，悉尼科技大學的Watanabe 等[18]利用肝細胞和陽性人尿液樣本，對乙酰芬太尼、丙烯酰芬太尼、呋喃芬太尼和4-氟異丁酰芬太尼這4種芬太尼類物質進行體內外代謝研究，確定了4種物質的標志性代謝物，體內外代謝模型實驗結果高度一致。然而，利用人肝微粒體模型對4-氟異丁酰芬太尼的體外代謝研究還未見報道。

超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱-高分辨質譜（UHPLC-Q-Exactive-HF-MS）憑借其高靈敏度、高分辨率、快速掃描和精確質量測定等優勢，已成為現代分析科學的重要工具，在代謝組學、蛋白質組學、食品安全、藥物研發和環境科學等領域的應用也不斷拓展，在復雜樣品的高通量分析和痕量組分檢測中表現尤為出色[19-22]。本研究利用UHPLC-Q-Exactive-HF-MS 對4-氟異丁酰芬太尼在人肝微粒體中的生物轉化進行檢測分析，確定了其代謝標志物和路徑，為4-氟異丁酰芬太尼濫用和致死案件中生物樣品的檢驗鑒定提供了思路和依據，也為其它新精神活性物質的代謝研究提供了參考。

1 實驗部分

1. 1 儀器與試劑

VanquishUHPLC四極桿/靜電場軌道阱聯用質譜系統、Legend Micro21R型高速冷凍離心機以及BarnsteadTMGenPureTM超純水制備系統（美國ThermoFisherScientific公司）。

4-氟異丁酰芬太尼鹽酸鹽（ 399% ，上海原思標物科技有限公司），以超純水配制成 1mg/mL 儲備液;乙腈和甲酸（色譜純，美國 Merck公司）。實驗用水為超純水（ （18.2MΩ^?cm） 。

1.2 肝微粒體體外實驗

參照文獻[23]的方法進行人肝微粒體體外孵育實驗。移取 10μL 6-磷酸葡萄糖二鈉（G-6-P）、10μL 氧化型輔酶Ⅱ鈉鹽（ ΔNADPNa₂ ）、 8μL 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-PDH）和 66μLMgCl₂ ，混合均勻，于 37^°C 金屬浴孵育 5min ，獲得還原型輔酶Ⅱ（NADPH）再生系統。移取 2μL1mg/mL 4-氟異丁酰芬太尼標準品溶液，加入 96μL 磷酸鹽緩沖液（PBS）和 10μL20mg/mL 肝微粒體，混合均勻，于 37^°C 金屬浴預孵育 5min 。加人NADPH再生系統，混合均勻，于 37^°C 金屬浴孵育 60min 。向孵育體系內加入200μL 乙腈并終止孵育，渦旋 2min ，以 10000r/min 離心 10min ，移取 200μL 上清液，待測。將未加入母藥和未加入肝微粒體的兩組孵育系統作為空白對照。

1.3 色譜和質譜條件

色譜柱為 ACQUITY UPLC HSS T3柱（ 150mm×2.1mm ， 1.8μm ，配有Waters公司VanGuard預柱）；流動相A和B分別為 0.1% 甲酸溶液和 0.1% 甲酸-乙腈溶液。梯度洗脫程序： 0～1.0min ， 1%B ：1.0～8.0min ， 1%～99% B； 8.0～10.0min ！ 99% B； 10.0～10.1min ， 99%～1%B ； 10.1～12.0min ， 1%B 。進樣量為 3μL ，流速為 0.3mL/min ，柱溫為 30^qC 。

采用電噴霧電離（ESI）源進行質譜分析。離子源參數設定如下：噴射電壓為 3.8kV ，碰撞氣體為氮氣，霧化溫度 320^°C ，霧化氣體壓力與輔助氣體壓力分別設為 38arb 和 15arb ，毛細管溫度 350‰ 。質譜采集為FullMS-ddMS2掃描模式，其中，全掃描數據采集參數為分辨率35000，掃描范圍 m/z70～1000 ，最大注射時間 100ms ；二級質譜（dd-MS2）參數為分辨率17500，采用階梯式碰撞能量（ 17.5% 、 35% 和52.5% ）以獲得更全面的碎片信息，從而提高代謝產物結構解析的靈敏度與準確性。

1. 4 數據分析和處理

使用UHPLC-Q-Exactive-HF-MS對待測上清液進行檢測，利用 Xcalibur 2.2.42軟件（美國 Thermo FisherScientific公司）進行數據處理和分析，根據相對分子質量、分子式、碎片離子、同系化合物的質譜斷裂規律以及文獻數據進行質譜解析，確定母藥及其代謝產物的保留時間、特征性碎片離子和質譜裂解規律等關鍵參數，再利用ChemDrawProfessional22.0.0.22軟件（美國PerkinElmer公司）對母藥裂解機制和代謝產物的特征碎片進行分析。

2 結果與討論

2.14-氟異丁酰芬太尼的分析

4-氟異丁酰芬太尼（ [M+H]⁺ ， m/z369.2337. 保留時間為 6.66min ，根據特征碎片（圖2）和芬太尼類物質的質譜裂解規律[15，24-25]，其質譜裂解路徑見圖3。與芬太尼相比，4-氟異丁酰芬太尼具有相同的哌啶環和苯乙基結構，因此，在 m/z 188 、146、134、105和84處存在相同的特征碎片，對應裂解路徑為m/z369?188?146?134 和 。異丁酰基和4-氟苯基作為其區別于芬太尼的特征官能團，對應的特征碎片為 m/z 299、248、150和71，裂解路徑為 及 m/z 337248 。

2.24-氟異丁酰芬太尼代謝產物的分析

本研究共發現并鑒定出4-氟異丁酰芬太尼的15種I相代謝產物，代謝產物的提取離子流圖見圖4，具體信息詳見電子版文后支持信息表S1。相較于Watanabe等[19]對4-氟異丁酰芬太尼的代謝分析，本研究不僅檢測到更全面的I相代謝產物譜，而且首次檢出二羥基、 N. -氧化及還原代謝產物，豐富了該化合物在體外代謝轉化的相關信息。

2.2.1 脫烷基化代謝產物

M1（ C₁₅H₂₁FN₂O; 的 [M+H]⁺ 為 m/z 265.1711 ，保留時間為 5.98min ，二級質譜特征碎片與母藥在 m/z71 、84和182處相同，而在 m/z 195 處比母藥 m/z299 少 104Da（-C₈H₈） ，這是哌啶環上的N原子發生了脫烷基反應，因此M1為母藥哌啶環 N. 脫烷基所形成的代謝產物，屬于芬太尼類物質典型代謝物，即去甲代謝物[15]。

2.2. 2 羥基化代謝產物

M2-1和M2-2是母藥脫烷基加羥基化代謝產物，M5-1、M5-2、M5-3和M5-4為母藥的單羥基化代謝產物，M7-1和M7-2是二羥基代謝產物。

M2（ C₁₅H₂₁FN₂O₂ ）為哌啶環上的N發生脫烷基加羥基化反應的產物，兩個異構體M2-1和M2-2的保留時間分別為5.44和 6.09min ，在 m/z281 處形成質子化分子離子 ?∣M+H∣⁺ 。通過分析 m/z 56、84和195處的特征碎片發現，M2與M1保持一致；在 m/z98 、87和198處，M2均比M1增加了 16Da（+0） ，表明M2-1的羥基化反應發生在異丁酰基側鏈；而M2-2則保留了M1在 m/z 71 和182處碎片，同時在 m/z 211和100處均多 16Da（+O） ，推斷羥基化修飾定位于哌啶環結構。

M5（ C₂₃H₂₉FN₂O₂ ）為羥基化產物，其保留時間M5-1＼～M5-4依次為6.14、6.25、6.37和 6.46min ，在 m/z385 處形成帶正電荷的分子離子 [M+H]⁺ 。M5-1與M5-2均在 m/z84 、105、188和299處呈現與母藥一致的特征碎片，而M5-1在 m/z59 和87處，以及M5-2在 m/z59 處的特征碎片，表明羥基化反應均發生在異丁酰基，二者的保留時間差異說明二者的羥基化位點并不相同。在M5-3的質譜分析中，觀察到 m/z 121 、204、315及162處的碎片離子相較于母藥增加了 16Da ，且未檢測到脫水形成的特征碎片，說明羥基化發生在苯乙基的苯環。M5-4于 m/z91 、144、174、186、204，297和367處存在特征碎片， m/z385367 、m/z 204186 的裂解是因脫水所致，根據質譜裂解規律[14]，再結合 α -碳的羥基化產物不穩定，推測羥基化反應優先發生在苯乙基烷基鏈的 β -碳上，因此M5-4為苯乙基烷基鏈的 β -碳發生單羥基化的產物。

M7-1和M7-2與M5-4的裂解模式類似，均存在苯乙基 β -碳原子上的羥基化位點（圖5）。此外，M7-1在 m/z59 、264和297處的特征碎片表明另一個羥基化反應發生在異丁酰基上。相較之下， m/z 119 、137、178、202、220和313處的特征碎片表明，M7-2的另一個羥基化反應也發生在苯乙基，結合 α 碳羥基化產物不穩定的特點，推測該羥基化位點在苯環上。

2.2.3N原子氧化代謝產物

N原子氧化代謝產物有M4、M6、M8和M9。首先，母藥哌啶環N原子氧化生成M6，M6發生還原反應生成M4。M8-1和M8-2是單羥基化加N原子氧化的代謝物，M9是二羥基化加N原子氧化的代謝物。M 5（C₂₃H₂₉FN₂O₂ [M+H]⁺ ， m/z385.2286^? 的保留時間為 6.78min ，其二級質譜（圖6）顯示，在 m/z105 、150 和248處的特征碎片離子與母藥相同，而在 m/z100 和 204處的特征碎片比母藥增加了 16Da（+0） ，說明羥基化發生在哌啶環上。進一步結合由哌啶環上的N原子羥基脫水而成的 m/z186 、207和277特征碎片，推測M6是母藥哌啶環N原子氧化的產物。

M4（ C₂₃H₂₇FN₂O₂ [M+H]⁺ ， m/z 383.2129 ）保留時間為 6.67min 。如圖7所示，M4與M6在 m/z91 、100、105、186及204處的特征碎片相同，但在 m/z246 和275處，M4比M6均少了 2Da（-H₂） ，又因為m/z 69 特征碎片的存在，故推斷M6在異丁酰基團的烷基部分發生還原脫氫形成了M4。

M8（ C₂₃H₂₉FN₂O₃ [M+H]⁺ ，m/z401.2235）為單羥基化加N原子氧化的產物。M8-1的保留時間為6.37min ，與M6在 m/z 100、 105 、204和207處的特征碎片相同，在m/z264和293處的特征碎片分子量增加 16Da（+0） ，且存在 m/z59 的特征碎片，推測在異丁酰基側鏈上，M8-1較M6多經歷了一次羥基化修飾過程。M8-2的保留時間為 6.61min ，與M6在 m/z91 、100、207和277處的特征碎片相同，在 m/z 121 、202和220處分子量增加 16Da（+0） ，同時未檢測到由于脫水產生的特征碎片，推測在苯乙基的苯環上M6進一步發生羥基化反應形成了M8-2。

M9 （C₂₃H₂₉FN₂O₄ ， [M+H]⁺ ，m/z 417.2184）的保留時間為 6.18min ，相較M8分子量增加了 16Da（+O） ，通過比較二者的特征碎片可知，M9是在M8的基礎上多發生了一次羥基化反應，因此M9是母藥發生了一次哌啶環 N. 氧化和兩次羥基化反應的產物，兩次羥基化反應的位點分別位于苯乙基的苯環和異丁酰基的烷基。

2.2.4 基化代謝產物

M3（ C₂₃H₂₇FN₂O₂ ！ [M+H]⁺ ，m/z383.2129）的保留時間為 6.56min ，與母藥在 m/z248 處的特征碎片一致，但在 m/z148 、202和313處的特征碎片均較母藥增加了 14Da（+O，-H₂） ，符合炭基化修飾特征。進一步分析，根據 m/z105 和174處的特征碎片結構，參考Feasel等[26]檢出的卡芬太尼的炭基代謝物，推測M3是母藥在苯乙基側鏈上的 β -碳原子上發生羰基化反應的產物。

2.3 代謝標志物分析

根據檢出的15種代謝產物的絕對峰面積，哌啶環 N. 脫烷基代謝物M1的峰面積最大，其次為單羥基化代謝物M5-4和哌啶環 N. 氧化產物 M6 。哌啶環 N. -脫烷基代謝物也稱為諾代謝物，屬于芬太尼類物質，被認為是其代謝標志物；羥基化和哌啶環 N. -氧化產物都完整地保留了母藥的原始結構。依據代謝產物的豐度和結構特性，優先選用M1、M5-4和M6作為4-氟異丁酰芬太尼的代謝標志物，未來還可通過實際案件中的陽性生物檢材進行驗證。

2.4 代謝通路分析

通過分析4-氟異丁酰芬太尼的體外代謝產物，推斷其具體的代謝通路，如圖8所示。根據代謝產物

的豐度，4-氟異丁酰芬太尼生物主要的3條轉化路徑分別為哌啶環 N. -脫烷基化、苯乙基 β -碳羥基化和哌啶環N-氧化反應。

3 結論

對代謝產物的分析研究可以有效擴展毒品分析的時效窗口，提升檢測靈敏度，為芬太尼類物質濫用和致死案件的檢驗鑒定提供重要參考。本研究采用UHPLC-Q-Exactive-HF-MS研究了4-氟異丁酰芬太尼在人肝微粒體中的代謝產物和通路，共鑒定出15種I相代謝產物，推導出 N. 脫烷基化、羥基化、 N. 氧化、羰基化和還原等代謝路徑。根據代謝產物的豐度和結構特性，推薦將 N. -脫烷基化、苯乙基 β -碳單羥基化和N-氧化產物作為4-氟異丁酰芬太尼的代謝標志物。后續研究可以通過代謝物標準品及實際案件中的陽性生物檢材進行驗證，進一步為相關案件提供更精準的技術支持。

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In Vitro Metabolism Identification of 4-Fluoroisobutyrfentanyl by Ultra-High-Pressure Liquid Chromatography Q-Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometry

LIU Meng ^*1，2 ， ZHAO Sen1， HUANG Jian3， ZHOU Hong3， LIU Yao ^*2，3 1（Key Laboratory of Drug Prevention and Control Technology of Zhejiang Province， Zhejiang Police College， Hangzhou 310053， China） （204號 ² （Colege of Ivestigation，People's Public Security University of China，Beijing 1Oo038， China） 3（Institute of Forensic Science，Ministry of Public Security， Beijing 10oo38， China）

AbstractResearch on the metabolism of fentany analogues is significantly beneficial in prolonging the examination period and enhancing the eficiency of detectionand can ofer insights and guidance for examination and identificationof illgallyabused substances.In this work，human liver microsomes were used to identifythe metabolitesand metabolic pathwayof 4-fluoroisobutyrfentanyl by ultra-high-pressure liquid chromatography Q-exactive HF hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometry （UHPLC-Q-Exactive-HF-MS）. A total of 15 kinds of phase I metabolites were detected through various metabolic pathways， including N. -dealkylation，hydroxylation， N- -oxidation，carbonylation and reduction，and the N -oxidized， dihydroxylated and reduced metabolite were reported for the first time.Upon comparing the peak areas of metabolites， the N -dealkylatedmetabolite （M1）， monohydroxylated metabolite on the phenethyl side chain （M5-4） and N -oxidized metabolite （M6）were recommendedas the metabolic biomarkers of 4-fluoroisobutyrfentanyl.This study offred valuable insights and supporting evidence for investigationand identification of 4-fluoroisobutyrfentanyl in biological samples in forensic cases.

KeyWords4-Fluoroisobutyrfentanyl; In vitro metabolism; Metabolite;Metabolic pathway; Human liver microsomes （Received 2023-11-01; accepted 2025-06-09） Supported bythe National Key Ramp;DProgram of China （No.2023YFC3303903-3）， theResearch Funding Support Program

byAcademicianLiuYao（No.2O-YZ-2），andtheOpenProjectof Zhejiang ProvincialKeyLaboratoryofDrug Preventionand

Control Technology （No.2020013）.