冷凍消融術聯合免疫療法在腫瘤治療中的研究進展

[摘要] 冷凍消融術是一種微創腫瘤治療方法，適用于早期腫瘤患者及無法接受手術切除治療的晚期腫瘤患者。冷凍消融術除引起腫瘤組織壞死和細胞凋亡外，還可促進腫瘤自身抗原釋放到血液中，包括損傷相關分子模式和腫瘤特異性抗原。這些抗原激活宿主免疫系統引發抗腫瘤免疫反應，導致原發腫瘤消退。但這種遠隔效應并不能有效抑制轉移腫瘤的生長。近年來，免疫療法是腫瘤治療的重要手段之一，可有效激活患者自身免疫系統。本文主要綜述冷凍消融術誘導的免疫效應及聯合免疫療法在腫瘤治療中的研究進展。

[關鍵詞] 冷凍消融術；免疫機制；免疫療法；聯合治療

[中圖分類號] R73" """"[文獻標識碼] A """""[DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2025.20.022

冷凍消融術是一種微創腫瘤治療方法，適用于早期腫瘤患者及無法接受手術切除治療的晚期腫瘤患者。冷凍消融術除引起腫瘤組織壞死和細胞凋亡外，還可促進腫瘤自身抗原釋放到血液中，包括損傷相關分子模式和腫瘤特異性抗原。本文主要綜述冷凍消融術誘導的免疫效應及聯合免疫療法在腫瘤治療中的研究進展。

1" 冷凍消融術的關鍵免疫機制

1.1" 腫瘤抗原的釋放

冷凍消融術通過低溫凍融循環導致腫瘤細胞內外形成冰晶，破壞細胞膜和細胞器，最終引發腫瘤細胞壞死和凋亡^[1]。在此過程中，腫瘤相關抗原從死亡腫瘤細胞中釋放，包括腫瘤特異性抗原及其他分子^[2]。腫瘤相關抗原的釋放在冷凍消融術誘導的免疫反應中發揮關鍵作用，其被樹突狀細胞（dendritic cell，DC）等抗原呈遞細胞捕獲并加工。通過主要組織相容性復合體，DC將這些抗原呈遞給T細胞，特別是CD8⁺細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL），激活特異性抗腫瘤免疫反應^[3]

1.2" 危險信號的釋放

冷凍消融術可誘導大量危險信號分子，即損傷相關分子模式的釋放。這些分子包括高遷移率族蛋白B1（high-mobility group box 1，HMGB1）、熱休克蛋白70、腺苷三磷酸和尿酸等^[4]。損傷相關分子模式通過與模式識別受體如Toll樣受體（toll-like receptor，TLR）結合，激活固有免疫系統。其中HMGB1與TLR4結合后可增強DC的抗原呈遞功能，并促進其向淋巴結遷移，進一步激活T細胞^[5]。這一過程對啟動有效的適應性免疫反應至關重要，有助于建立針對腫瘤細胞的持久免疫記憶^[6]。

1.3" 免疫逃逸的逆轉

腫瘤細胞通過多種機制逃避免疫系統的監視與攻擊，這一現象稱為免疫逃逸。常見的免疫逃逸機制包括上調程序性死亡受體配體1（programmed death-ligand 1，PD-L1）表達，分泌免疫抑制性細胞因子轉化生長因子-β和白細胞介素（interleukin，IL）-10，招募免疫抑制性細胞，如調節性T細胞（regulatory T cell，Treg細胞）和髓系抑制性細胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）^[7-8]。Treg細胞通過抑制免疫反應和免疫細胞活性發揮作用，MDSC通過產生抑制分子抑制T細胞功能，促進腫瘤逃避免疫監視。冷凍消融術通過破壞腫瘤微環境，部分逆轉這些免疫逃逸機制。首先，冷凍消融術可通過減少免疫抑制性細胞數量抑制PD-L1的表達，減弱程序性死亡受體1（programmed death-1，PD-1）/PD-L1介導T細胞抑制作用^[9]。其次，冷凍消融術可破壞Treg細胞和MDSC，增強抗腫瘤免疫反應^[10]。最終，冷凍消融術誘導的炎癥反應和抗原釋放有助于重塑腫瘤微環境，促進免疫激活和腫瘤清除^[11]

2" 影響冷凍消融術免疫效果的因素

2.1" 冷凍速率和解凍速率

冷凍速率和解凍速率是冷凍消融術的關鍵參數。冷凍速率決定冰晶的形成速度和大小，直接影響腫瘤細胞的物理破壞程度。快速冷凍可在細胞內形成小型冰晶，有效破壞細胞膜和細胞器；而緩慢解凍則通過引發滲透失衡和機械應力造成更大細胞損傷，誘導更多細胞壞死^[12]。快速冷凍與緩慢解凍的組合可誘導更強的免疫原性細胞死亡，進而增強抗腫瘤免疫反應。

2.2" 冷凍循環次數

目前，主流的冷凍循環次數為2次。冷凍消融腫瘤周圍灌洗液中的IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12b、γ干擾素和腫瘤壞死因子-α水平顯著升高，表明兩輪冷凍消融可有效激活促炎性細胞因子，增強遠端腫瘤免疫細胞活性，產生最強遠端效應。SOLSTICE研究中，128例患者接受冷凍消融術，術后12個月和24個月的局部無復發生存（relapse free survive，RFS）率分別為85.1%和77.2%。二次冷凍消融術后復發腫瘤的局部RFS率分別提高至91.1%和84.4%^[13]。

2.3" 壞死凋亡面積比例

冷凍消融術后，腫瘤組織中壞死與凋亡細胞的比值是評估治療效果的關鍵指標。壞死是由急性損傷引起的細胞死亡，主要發生在冷凍區域中心；凋亡則是程序性細胞死亡，集中在冷凍區域邊緣。二者引發的抗腫瘤免疫效應存在顯著差異。壞死腫瘤細胞釋放DNA、RNA、熱休克蛋白70、尿酸和HMGB1，這些免疫原性分子作為“危險信號”激活免疫反應，進而激活T細胞^[14]；相較之下，凋亡通常誘導免疫抑制。大量凋亡細胞在缺乏共刺激信號情況下可導致外周耐受，而吞噬凋亡細胞的DC成熟度不足，無法有效產生細胞因子，進而引發T細胞失能或克隆缺失^[15-16]。因此，壞死與凋亡細胞的比值對免疫效應有重要影響^[17]。

3" 腫瘤免疫治療

免疫療法通過調控機體免疫系統識別并殺傷腫瘤細胞，已成為腫瘤治療的重要手段。免疫療法核心機制包括解除免疫抑制、增強抗原呈遞、激活效應細胞及重塑腫瘤微環境^[18]。①免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitor，ICI）：腫瘤細胞通過表達PD-L1等免疫檢查點分子，與T細胞表面的PD-1等結合，抑制T細胞活化，促進腫瘤免疫逃逸。ICI可阻斷此類信號通路，恢復T細胞功能^[19]。②過繼性細胞療法（adoptive cell therapy，ACT）：通過基因工程改造患者T細胞或擴增自然殺傷細胞（natural killer cell，NK細胞），增強其靶向殺傷能力。嵌合抗原受體T細胞免疫治療（chimeric antigen receptor T cell immunotherapy，CAR-T）通過識別腫瘤表面抗原（如CD19）直接攻擊腫瘤；NK細胞則通過釋放穿孔素和顆粒酶誘導腫瘤凋亡^[20]。③腫瘤疫苗：腫瘤疫苗通過遞送腫瘤特異性抗原（如新抗原、共享抗原），激活DC并呈遞抗原至T細胞，誘導特異性免疫應答。個體化新抗原疫苗可精準靶向突變蛋白^[21]。④細胞因子療法：免疫刺激性細胞因子（如IL-2、α型干擾素）直接激活T細胞和NK細胞；粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulooyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）促進DC成熟和抗原呈遞^[22]。

4" 冷凍消融術聯合免疫療法

4.1" 冷凍消融術聯合ICI

ICI[如PD-1/PD-L1、細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）]通過解除免疫系統中的抑制信號恢復T細胞的抗腫瘤活性。免疫檢查點由效應淋巴細胞表達的共抑制分子組成，防止其過度激活。腫瘤組織通過在腫瘤細胞和基質細胞中表達相應配體逃避免疫監視。常見的共抑制受體包括CTLA-4、PD-1、T細胞免疫球蛋白和黏蛋白結構域-3、淋巴細胞活化基因-3等^[23]。CTLA-4由活化T細胞、尤其是Treg細胞表達，抑制效應T細胞的激活，并作為Treg細胞的效應分子^[24]。臨床前研究表明CTLA-4的阻斷可導致免疫原性腫瘤（如51Blim10結腸癌和SA/1N纖維肉瘤）被排斥^[25]。前列腺癌小鼠模型研究表明CTLA-4抑制劑與手術切除或腫瘤疫苗聯合使用，可有效減少轉移灶并降低原發腫瘤的發生率^[26-27]。在前列腺癌TRAMP C2小鼠模型中應用冷凍消融術聯合CTLA-4阻斷抗體觀察到繼發性腫瘤被CD4⁺T細胞和CD8⁺T細胞高度浸潤，腫瘤內T效應細胞與CD4⁺FoxP3⁺T調節細胞的比例顯著增加^[28]。在非小細胞肺癌小鼠模型中，冷凍消融和PD-1阻斷通過STING依賴性Ⅰ型干擾素信號通路促進抗腫瘤作用^[29]。在乳腺癌冷凍消融術聯合伊匹單抗臨床研究中，輔助性T細胞1的活化和增殖及治療后促進增殖的效應T細胞相對腫瘤床內Treg細胞持續升高^[30]。

4.2" 冷凍消融術聯合腫瘤疫苗

腫瘤疫苗通過引入腫瘤特異性抗原，激活并增殖T細胞，從而靶向殺傷腫瘤細胞。冷凍消融術過程中產生的腫瘤抗原為腫瘤疫苗提供更多靶點，可顯著增強疫苗效果。DC作為重要的抗原呈遞細胞在冷凍消融術后被激活，進一步增強T細胞效應反應^[29]。基于自體腫瘤開發的腫瘤疫苗為個體化免疫治療帶來新希望。靶向淋巴結原位腫瘤冷凍介導的納米疫苗（包裹黃芪多糖）通過馬來酰亞胺修飾的Pluronic F127-殼聚糖納米顆粒捕捉冷凍消融術過程中釋放的免疫原性腫瘤抗原，特異性靶向淋巴結，促進溶酶體逃逸，激活遠端DC，并通過交叉呈遞調節T細胞分化，打破腫瘤免疫抑制微環境，實現持久的腫瘤特異性免疫^[31]。在一項三陰性型乳腺癌肺轉移研究中，Meriva作為腫瘤疫苗可減少腫瘤微環境中的IL-6刺激T細胞，冷凍消融術聯合Meriva積累并激活CD8⁺T細胞，形成多種腫瘤相關抗原^[32]。

4.3" 冷凍消融術聯合ACT

ACT通過體外擴增和改造患者自身免疫細胞（如T細胞或NK細胞）增強其抗腫瘤能力。常見ACT包括CAR-T和NK細胞療法等。回輸擴增的特異性T細胞或NK細胞可增強對腫瘤的免疫反應。冷凍消融過程中釋放的腫瘤抗原為ACT提供額外靶點，可顯著提高療效^[33]。嵌合抗原受體T細胞由抗原結合區（單鏈可變區抗體，scFv）、跨膜區和信號轉導區組成。該細胞識別腫瘤抗原（如CD19）后，激活T細胞并啟動細胞毒性反應，釋放穿孔素和顆粒酶B，誘導腫瘤細胞凋亡。冷凍消融術誘導的抗原釋放可進一步增強嵌合抗原受體T細胞效力^[34]。冷凍消融術聯合CAR-T為難治性B細胞惡性腫瘤的治療提供機會^[35]。T細胞受體-T細胞通過識別主要組織相容性復合體Ⅰ類分子呈遞的腫瘤抗原肽，激活磷脂酰肌醇3激酶、核因子κB信號通路，導致T細胞活化和細胞毒性反應^[36]。與嵌合抗原受體T細胞不同，NK細胞無需事先免疫即可識別并殺傷腫瘤細胞，尤其是在腫瘤細胞下調主要組織相容性復合體Ⅰ時。NK細胞還可與DC相互作用，增強腫瘤抗原呈遞。冷凍消融術聯合同種異體NK細胞治療肝細胞癌，可顯著降低患者腫瘤標志物甲胎蛋白水平，延長無進展生存期，提高患者生活質量^[37]。研究顯示冷凍消融誘導基因與NK細胞活化和白細胞介導的毒性有關，包括IL11ra1和Pfr1基因^[38]。在冷凍消融術聯合同種異體NK細胞免疫治療晚期腎細胞癌的研究中發現，該方法可增強患者免疫功能，改善患者生活質量，臨床療效良好^[39]。對消融后的肝細胞癌患者應用過繼性細胞免疫輔助治療，患者的RFS和總生存期得到改善，證實其是安全的^[40]。冷凍消融術聯合ACT可延長腫瘤患者的生存時間。

4.4" 冷凍消融術聯合免疫刺激性細胞因子療法

免疫刺激劑通過與模式識別受體、C型凝集素受體、NOD樣受體和視黃酸誘導基因-Ⅰ樣受體結合，激活促炎信號通路，啟動DC的抗原呈遞功能，觸發適應性免疫反應。TLR9識別病毒或細菌DNA，可誘導促炎性細胞因子的釋放。研究顯示TLR9刺激與消融術的結合導致VX2腫瘤模型中抗腫瘤T細胞反應和細胞毒性增強^[41]。未甲基化單鏈DNA（CpG- ODN）為TLR9識別的分子。研究表明在冷凍消融術聯合DC和CpG-ODN治療中，最佳給藥時機為DC注射后12h內^[42]。GM-CSF是另一免疫刺激劑，通過與髓系祖細胞受體結合誘導粒細胞增殖和分化。研究顯示GM-CSF在膽管癌中通過驅動腫瘤相關巨噬細胞發揮抗腫瘤免疫作用^[43]。在一項前列腺癌前瞻性研究中，GM-CSF可廣泛提高針對前列腺特異性和非特異性抗原的抗體水平，為前列腺癌治療提供可能^[44]。冷凍消融術聯合GM-CSF被認為是轉移性激素難治性前列腺癌的替代療法，可誘導腫瘤特異性T細胞反應^[45]。小鼠模型研究顯示冷凍消融術與GM-CSF聯合治療可增加小鼠脾臟DC數量和激活率，增強腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞功能，顯著降低肺轉移率^[46]。此外多糖、激素和膽汁酸等其他免疫刺激物也展現出促進免疫反應的潛力。冷凍消融術聯合蛋白多糖制劑在小鼠模型中可預防殘留腫瘤生長，抑制IL-4和IL-10的產生，并略增脾細胞中NK細胞和細胞毒性T細胞的數量^[47]。總之，冷凍消融術通過促進腫瘤抗原釋放，并聯合免疫刺激性因子提高抗腫瘤免疫效應。

5" 小結與展望

冷凍消融術聯合免疫療法為腫瘤療法提供新的協同策略，其通過局部消融釋放腫瘤抗原并重塑免疫微環境，與系統性免疫干預形成互補效應，展現出顯著應用潛力。然而，該領域仍面臨諸多挑戰。未來研究可從冷凍消融術誘導的免疫激活機制、與ICI的協同機制及利用納米載體靶向遞送冷凍消融釋放的抗原，或結合基因編輯技術增強嵌合抗原受體T細胞/NK細胞的腫瘤歸巢能力，提升治療精準性，最終實現從“局部消融”到“系統免疫激活”的全面突破，為腫瘤患者帶來更持久的生存獲益。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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• 2025–02–18）

（修回日期：2025–03–20）

基金項目：昆明醫學大學2024年碩士研究生創新基金項目（2024S384）

通信作者：李立，電子信箱：qgyzlili@163.com