三峽水庫(kù)壩區(qū)底泥微生物群落組成及多樣性研究

0 引言

三峽工程建成后，形成了一個(gè)巨大的水庫(kù)，生成一種既不同于河流也不同于湖泊的新生態(tài)系統(tǒng)，改變了該區(qū)域的生境要素特征，導(dǎo)致水質(zhì)、水生態(tài)和水文要素出現(xiàn)顯著差異[1-4]。這種環(huán)境變化不僅影響了水體的物理和化學(xué)特性，還對(duì)水文條件和水生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生影響[5-7] 。

微生物在湖泊和河流生態(tài)系統(tǒng)中占據(jù)著不可或缺的地位，在維持生態(tài)平衡、調(diào)節(jié)生物地球化學(xué)循環(huán)方面發(fā)揮著重要作用[8-9]，其參與有機(jī)物的分解、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)及污染物的凈化等關(guān)鍵生態(tài)過(guò)程[10-11]。尤其是底泥微生物群落，其豐度和多樣性能夠反映出水體生態(tài)環(huán)境的健康狀況[12]。然而，目前關(guān)于三峽大壩底泥微生物的研究相對(duì)較少，特別是針對(duì)微生物群落組成及多樣性方面的系統(tǒng)性分析仍然不足。

底泥作為地球化學(xué)元素循環(huán)和微生物群落生存的場(chǎng)所[13-14]，在水生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。底泥微生物群落受水體的物理化學(xué)性質(zhì)（如pH、含水率和溶解性有機(jī)碳等[15]）的影響。這些因素不僅決定了微生物的豐度和分布，還可能在一定程度上影響微生物的生態(tài)功能[16]，微生物群落的多樣性和組成對(duì)于維持水體的生物多樣性和生態(tài)平衡具有不可替代的作用[17]因此，了解底泥微生物群落的組成及其多樣性，對(duì)于研究三峽庫(kù)區(qū)的生態(tài)環(huán)境變化具有重要意義。

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，宏基因組測(cè)序技術(shù)成為研究微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的重要工具[18-21]，可有效揭示水體微生物的多樣性及其與環(huán)境之間的復(fù)雜關(guān)系。本研究于2024年5～6月對(duì)三峽水庫(kù)壩區(qū)周邊5個(gè)斷面進(jìn)行微生物調(diào)查，采集50個(gè)河道底泥樣品，運(yùn)用宏基因組測(cè)序技術(shù)分析三峽大項(xiàng)上、下游底泥微生物群落的組成及其多樣性，旨在揭示三峽庫(kù)區(qū)底泥微生物群落的特征，為了解該區(qū)域的生態(tài)環(huán)境及未來(lái)的合理利用、治理及生態(tài)保護(hù)提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究區(qū)域與樣品采集

本研究選取三峽大壩上游官渡口（GDK）、香溪河（XXH）和廟河（MH）3個(gè)國(guó)家水質(zhì)采樣斷面；下游選取黃陵廟（HLM）和南津關(guān)（NJG）2個(gè)國(guó)家水質(zhì)采樣斷面，總計(jì)5個(gè)斷面（圖1）。每個(gè)斷面從左至右分別采集底泥上層和下層樣品，各層混勻，每個(gè)采樣點(diǎn)共采集10個(gè)生物學(xué)重復(fù)（上層5個(gè)，選取表層 0～10cm ，下層5個(gè)，選取 10～20cm， ），共計(jì)50個(gè)樣品；所采集的樣品分兩部分保存，一部分在自然條件下風(fēng)干， 密封保存，用于底泥理化性質(zhì)的測(cè)定；另一部分在 -80°C 保存，用于測(cè)定微生物指標(biāo)。采樣時(shí)間為2024年5～6月。采樣具體點(diǎn)位見(jiàn)表1。

1.2 研究方法

根據(jù)魯如坤的《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》對(duì)底泥的化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析[22]，底泥 pH 通過(guò)將 10g 干土與去離子水按2.5：1的比例混合后，快速攪拌 1min 并靜置 30min ，隨后使用玻璃電極進(jìn)行測(cè)定；含水率（SWC）通過(guò)采樣烘干法測(cè)定；底泥硝態(tài)氮（ NO₃^--N） 和銨態(tài)氮（ NH₄⁺-N） 用中性鹽（KCI）浸提后，利用全自動(dòng)連續(xù)流動(dòng)分析儀（SkalarSan +θ+θ System）測(cè)定，此過(guò)程需要 10g 濕土樣；底泥有機(jī)質(zhì)（SOM）采用重鉻酸鉀容量法測(cè)定，該方法需要使用 0.5g 干土樣；底泥溶解性碳（DOM）采用純水浸提-硫酸-重鉻酸鉀氧化法；全氮（TN）測(cè)定采用半微量開(kāi)氏法，使用 _0.2g 干土樣進(jìn)行分析;全磷（TP）采用碳酸鈉熔融法，而速效磷（AP）測(cè)定采用Olsen -P 法，鉬銻抗比色測(cè)定，分別需要 0.5g 干土和 2.5g 干土樣;有效磷（AP）采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法；全鉀（TK）和速效鉀（AK）分別用氫氧化鈉和醋酸銨作為提取劑，隨后通過(guò)火焰分光光度法進(jìn)行分析，每項(xiàng)測(cè)定均需要 0.5g 干土樣；陽(yáng)離子交換量（CEC）采用乙酸銨交換法進(jìn)行測(cè)定。

底泥DNA的提取按照MPbio試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，DNA質(zhì)量檢測(cè)通過(guò)以下兩種方法進(jìn)行： ① 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA完整性，要求電泳條帶清晰可見(jiàn)，無(wú)明顯拖尾； ② Qubit檢測(cè)基因組DNA濃度及質(zhì)量，要求濃度不小于 ，總量不小于 2μg 。微生物數(shù)據(jù)測(cè)定送至上海天昊生物科技有限公司進(jìn)行微生物PCR擴(kuò)增和16SrRNA高通量測(cè)序，擴(kuò)增引物為：515F（GTGCCAGCMGCCGCGG）；907R（CCGT-CAATTCMTTTRAGTTT），擴(kuò)增區(qū)間為V4～V5區(qū)[23-24]

1.3 數(shù)據(jù)處理

相關(guān)性分析、方差分析和線性回歸分析均采用R語(yǔ)言軟件（v4.0.2）進(jìn)行。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)法，而方差分析的事后檢驗(yàn)則使用LSD法進(jìn)行了顯著性的驗(yàn)證。研究還對(duì)微生物群落進(jìn)行了深入分析，包括MantelTest相關(guān)性分析、非度量多維尺度分析（NMDS）、微生物群落的 ∝ 多樣性指數(shù)分析、隨機(jī)森林分析（Randomforestanalysis）和網(wǎng)絡(luò)分析等。所有的統(tǒng)計(jì)分析和圖表的制作均借助于R軟件（v4.0.2）中的‘vegan’和‘ggplot2’數(shù)據(jù)包及Gephi等軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 底泥理化性質(zhì)

研究區(qū)域底泥的理化性質(zhì)見(jiàn)表2，通過(guò)比較研究其理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)底泥上層和下層理化性質(zhì)差異明顯，并且不同采樣點(diǎn)之間的理化性質(zhì)也存在一定的差異。進(jìn)一步利用非度量多維度（NMDS）排序?qū)Φ啄嗟睦砘再|(zhì)進(jìn)行了分析（圖2），結(jié)果顯示采樣地點(diǎn)和采樣分組的理化性質(zhì)存在顯著差異（應(yīng)力值Stress lt;0.2 ）。該結(jié)果與理化性質(zhì)的方差分析結(jié)果一致。

2.2底泥微生物群落組成及多樣性

研究區(qū)域微生物（古菌、細(xì)菌和真菌）群落的相對(duì)豐度圖見(jiàn)圖3（a），圖4（a），圖5（a），古菌群落的主要優(yōu)勢(shì)類群為熱變形菌門、熱原體門和鹽桿菌門；細(xì)菌群落以假單胞菌門、變形菌門和綠彎菌門為主導(dǎo)；真菌群落以毛霉門為優(yōu)勢(shì)類群。圖3（b），圖4（b），圖5（b）表明，古菌和細(xì)菌群落在不同的采樣分組和采樣點(diǎn)中存在顯著差異（ Stresslt;0.2 ），而真菌群落的差異不顯著 Stressgt;0.2） 。根據(jù)圖3（c），圖4（c），圖5（c），古菌的香農(nóng)-威納指數(shù)（Shannon.Wiener.B）、物種豐富度（Richness.B）均勻度（Eveness.B）;細(xì)菌的香農(nóng)-威納指數(shù)（Shannon.Wiener.B）辛普森指數(shù)（Simpson_index）以及真菌的香農(nóng)-威納指數(shù)（Shannon.Wiener.B）、物種豐富度（Richness.B）、均勻度（Eveness.B）、辛普森指數(shù)（Simpson_index）和Chaol指數(shù)等在三峽大壩上、下游均有顯著差異（ p?0.05 ），表明上、下游微生物群落由于理化性質(zhì)和水質(zhì)條件的差異也存在顯著變化。此外，微生物群落在不同的采樣點(diǎn)下也有一定的顯著差異（ p?0.05 。

通過(guò)構(gòu)建微生物群落的共生網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖3（d），圖4（d），圖5（d），發(fā)現(xiàn)細(xì)菌群落的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù)大于古菌和真菌群落，表明細(xì)菌群落較真菌和古菌群落更為復(fù)雜，且細(xì)菌群落之間的聯(lián)系更加緊密。整體上，微生物群落之間的關(guān)系以正相關(guān)為主，表現(xiàn)為更多的協(xié)同合作關(guān)系，具體網(wǎng)絡(luò)參數(shù)見(jiàn)表3。

2.3理化因子對(duì)微生物群落的影響

通過(guò)MantelTest分析（圖6），發(fā)現(xiàn)古菌群落與環(huán)境因子的相關(guān)性最高，其中SWC，DOC等是影響古菌和細(xì)菌群落的主要因素；對(duì)于真菌群落，SWC，AP是影響真菌群落的主要影響因素。此外，理化因子和微生物 ∝ 多樣相關(guān)參數(shù)的相關(guān)性分析表明，古菌的多樣性與理化因子呈顯著負(fù)相關(guān)，而細(xì)菌多樣性則表現(xiàn)為顯著正相關(guān)（ plt;0.01） 。通過(guò)隨機(jī)森林分析，發(fā)現(xiàn)TN，TK，AP，CEC和DOC是影響古菌 ∝ 多樣性的主要理化因子，SOC 和 NH₄⁺-N 是影響細(xì)菌alpha多樣性的關(guān)鍵因素，而古菌 ∝ 多樣性主要受 NH₄⁺"-N，TN 和CEC的影響（圖7）。

3底泥微生物群落比較

（1）底泥微生物相對(duì)豐度：細(xì)菌 gt; 古菌 gt; 真菌。在本研究中，水庫(kù)底泥微生物細(xì)菌的相對(duì)豐度最高，其次是古菌，真菌最低。這一結(jié)果可能有以下兩個(gè)主要原因： ① 微生物群落的環(huán)境適應(yīng)性。細(xì)菌的環(huán)境適應(yīng)性范圍較廣[24]，能夠適應(yīng)多種環(huán)境條件（如溫度、pH、溶解氧含量等）。水庫(kù)底泥中的環(huán)境復(fù)雜，細(xì)菌可以通過(guò)尋找合適的微環(huán)境來(lái)存活。相比之下，古菌通常更傾向于生活在極端環(huán)境中[25]，例如底泥中低氧、高鹽或高溫的區(qū)域可能成為古菌的理想棲息地。真菌的生長(zhǎng)和繁殖通常需要較高的濕度和氧氣條件[26]，但水庫(kù)底泥的高含水量和低氧環(huán)境可能抑制真菌的生長(zhǎng)；② 繁殖速度差異。一般情況下，細(xì)菌具有更快的繁殖速度，相比之下，真菌次之，古菌最慢。細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、代謝途徑多樣以及適應(yīng)力強(qiáng)，能快速繁殖。真菌的繁殖方式相對(duì)復(fù)雜，對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求相對(duì)較高。古菌由于其獨(dú)特的代謝機(jī)制和進(jìn)化特性，繁殖速度較為緩慢。然而，在水庫(kù)這個(gè)特殊的生態(tài)系統(tǒng)中，古菌可能由于其對(duì)極端環(huán)境的適應(yīng)性和生物競(jìng)爭(zhēng)壓力較小而維持高的豐度。

（2）底泥微生物細(xì)菌群落在河道生態(tài)系統(tǒng)中可能發(fā)揮著更大的作用。在本研究中，細(xì)菌的相對(duì)豐度顯著高于古菌和真菌群落，表明細(xì)菌可能在水庫(kù)底泥生態(tài)系統(tǒng)中扮演著更為重要的角色。細(xì)菌具有多樣化的代謝途徑，能夠利用多種有機(jī)和無(wú)機(jī)物質(zhì)作為營(yíng)養(yǎng)來(lái)源[27-28]。水庫(kù)底泥中含有豐富的有機(jī)物和無(wú)機(jī)物，細(xì)菌能夠在多樣的營(yíng)養(yǎng)條件下生存并與環(huán)境緊密聯(lián)系。古菌則具有獨(dú)特的代謝方式和遺傳機(jī)制，使其能夠在極端環(huán)境中發(fā)揮著重要作用。例如，在湖泊等水生生態(tài)系統(tǒng)中，古菌參與甲烷代謝與氨氧化等重要代謝過(guò)程，這使得它們?cè)谝恍┨囟ǖ纳鷳B(tài)系統(tǒng)中具有重要的作用[29]。相比之下，真菌對(duì)復(fù)雜有機(jī)物的需求較高，且對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的質(zhì)量和數(shù)量要求較高[26]。雖然水庫(kù)底泥中存在一定量的有機(jī)物，但這些有機(jī)物可能并不完全符合真菌的生長(zhǎng)需求，因此其相對(duì)豐度較低。此外，微生物群落之間的相互關(guān)系對(duì)其分布和生態(tài)系統(tǒng)功能具有重要影響[30-31]。網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)湫再|(zhì)（例如聚類系數(shù)和網(wǎng)絡(luò)密度）可以反映群落的穩(wěn)定性或其功能多樣性[32]。在本研究中，細(xì)菌群落的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù)明顯高于古菌和真菌，表明細(xì)菌在微生物網(wǎng)絡(luò)中的連接性更強(qiáng)，可能在河道生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮更為關(guān)鍵的作用。

4結(jié)語(yǔ)

三峽水庫(kù)壩區(qū)微生物群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不同采樣點(diǎn)底泥理化性質(zhì)及微生物群落豐度存在顯著差異。本文通過(guò)分析三峽水庫(kù)壩區(qū)底泥微生物分布特征及其群落結(jié)構(gòu)差異，旨在揭示其潛在的生態(tài)功能及環(huán)境響應(yīng)特征。研究結(jié)果有助于加深對(duì)三峽庫(kù)區(qū)水生態(tài)系統(tǒng)和水環(huán)境質(zhì)量狀況的認(rèn)識(shí)，并為庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境的評(píng)估與治理提供理論依據(jù);未來(lái)研究應(yīng)系統(tǒng)地比較三峽大壩上、下游微生物群落，深入探討環(huán)境因子、微生物群落及其功能之間的聯(lián)系。

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（編輯：李晗）

Study on composition and diversity of sediment microbial community in Three Gorges Reservoir dam area

ZHENGKaikai，YANHaitao，PENGChunlan

（ThreeGorgesHydoogndWaterResoucesSureyureauureauofHydrologyfangangWaterResourcsCommisionicg 443000，China）

Abstract：Inorder to explore themicrobial situation ofthesedimentin the Three Gorges Reservoirdam area，reveal its ecological functions and environmental response characteristics，we conducted microbial sampling and surveyon five areas around the dam from Mayto June2O24，collected 5O iver sediment samples，and analyzed thecomposition and diversityof thesediment microbial communitybymetagenomic sequencing technology.Theresults showed that the abundance of microbial communities was bacteria gt; archaea gt; fungi，with Pseudomonadota being the main bacterial community， Thermoproteota being the main archaeal community，and Mucoromycota being the most abundant fungal community.Sediment Water Content（SWC）and Disslved Organic Carbon（DOC）were the main factors afecting archaeal and bacterialcommunities，whileSWC hadthe most significant efectonfungal communities.The microbialand bacterial communities of sediment may play a greater role than fungal and archaeal communities in river ecosystems.

Key words： Three Gorges Reservoir;sediment microrganisms；metagenomic sequencing；microbial community diversity；ecological environment