杜仲葉片不同發育時期轉錄組及綠原酸相關基因分析

中圖分類號：S792.99 文獻標志碼：A 文章編號：1673-923X（2025）07-0174-14

Analysisof transcriptomeand chlorogenicacid related genesin Eucommia ulmoides leaves at different developmental stages

WANGSiran1，LIHui，Aricha’，JINMulan2，QINGJun1，BAIYu’e1 （1.CollegeofForestryInnerMongoliaAgriculturalUnversity，Hohhot Ooo19，Inner Mongolia，China; 2.UlanqabForestryand GrassandMonitoring andPlanning Station，UlanQab O120o，Inner Mongolia，China）

Abstract：【Objective】Chlorogenicacid isanindex componentforthequalityevaluationofEucommiaulmoides leaves，whichhas variousmeiciallusschtbactealdtamtorytiodanttacrdtptitieatio andexcaationofmetabolicpathwaysandgnesinvolvedinregulatingchlorogenicacidbiosynthesis inEucommiaulmoidesleaves willprovidefurtherevidenceforanalysisofthemolecularmchanismofchlorogenicacidformationinEucommiaulmoidesleaves. 【Method】Eucommialmoidesleavesrecectedfromotou，Iergoliautonomousgion，inpril，Julydctober 2023at diferetdevelopmenalperods，andwereclaifedaccordingtotecharacterationas：Aprilfreshlyunfoledyoungleaves; Julymatureleaves，withlighteathery;andctoberfullymatureaves，withthdarkestcoloroftelavesandompleteleathrye chlorogenicacidcontentofEucommiaulmoidesleavesatdiferentperiodswasdeterminedbyig-performanceliquidchromatography （HPLC），andthediferetiallexpressedgenesereidentifdbyrasiptomesequencing.【Result】Teloogniccidctet ofEucommiaulmoidesleavesrangesfromApriltoJulyandthentoOctober，showsanincreasingandthendecreasing trend withleaf development.Transcriptome sequencing yielded 58.06 Gbof clean data，enablingthe identification of11 689 genes.The numberof down-regulatedexpressdgnesisigherthanteumberofupregatedexpresedgenesinteompasonofsTTsand

T2vsT3hreegroups.KEGGenrichmentanalysisandGOenrichmentanalysis，bothofwhichdisplaychlorogenicacidsynthsis-related enrichments.FurtemoreKmeanstredexpreionividsteensinto0modles，inwhichtrendsofgeneexpressinlass4， Class8adClassareconsstentwithtrendsoforogenicacidotetadtwozsandegensareidentifdfroClass4 Class8andClass10tatarerelatedtoclorogenicacidbiosythsis.Tresultsofal-tiefuoreseequanitativePCR（-CR） are inaccordance withRNA-seqoutcomes.【Conclusion】ThechlorogenicacidcontentintheEucommiaulmoides leavesshowsa trend of increasing and then decreasing with the development of the leaves.

Keywords：Eucommiulmodesorogeniccid;trsiptoe;difrentiallyexpreedneDEGs）;iofoatiais

杜仲Eucommiaulmoides落葉喬木，為杜仲科杜仲屬植物，是我國名貴藥材之一，亦是藥食同源植物。其有關記載可追溯到《神農本草經》，《中國藥典》收錄杜仲樹皮作為中藥入藥。隨著對杜仲研究的深入，現代藥理研究發現，杜仲樹皮與杜仲葉片的化學成分大致相同。杜仲中的主要化學成分包括木脂素類、環烯醚萜類、酚酸類、類黃酮等；其中，在2020版《中國藥典》中，將綠原酸（Chlorogenicacid，CGA）作為杜仲葉片質量評價的指標性成分，其質量標準不得少于0.08% 的限度[1-2]。苯丙烷代謝途徑作為植物重要的二級代謝途徑之一，在植物生長發育及調控中起到關鍵作用。苯丙烷代謝途徑衍生了許多下游代謝途徑，以苯丙氨酸為前體產生化合物，如類黃酮、木質素、花青素和有機酸等。其中綠原酸是一種苯丙類物質，在植物有氧呼吸過程中，通過莽草酸途徑（Shikimatepathway）由苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonialyase，PAL）轉化為肉桂酸（Aerobic respiration）[3-6]。在不同種類植物中，綠原酸合成主要有4種途徑，第1種途徑，肉桂酸通過4-香豆酸：輔酶A連接酶（4-coumarate：CoALigase，4CL）、肉桂酸-4-羥化酶（Cinnamic acid 4-hydroxylase，C4H）、莽草酸羥基肉桂酰基轉移酶（shikimate O-hydroxycinnamoyltransferase，HCT） 和 CYP98A 酶（5-O-（4-coumaroyl）-D-quinate 3^′ -monooxygenase）進行轉化，轉化為中間體咖啡酰輔酶A（Caffeoyl-CoA），然后通過羥基桂皮酰輔酶A羥基桂皮酰轉移酶（Hydroxycinnamoyl-Co A：quinate hydrox-ycinnamoyl transferase，HQT）催化咖啡酰輔酶A（Caffeoyl-CoA）和奎寧酸（Quinicacid）合成綠原酸；該途徑被認為是植物合成CGA的主要途徑，已在多個物種中進行了研究認證[6-12]。第2種途徑，羥基肉桂酰輔酶A：莽草酸/奎寧酸羥基肉桂酰轉移酶（HCT）和對香豆酸-3-羥化酶（C3H）發生催化反應，然后通過羥基化反應形成綠原酸[1l-2]。第3種途徑是對香豆酸能在對-香豆酸3-羥化酶和肉桂酸-4-羥化酶催化下轉化為咖啡酸，然后在4-香豆酸-輔酶A連接酶與羥基肉桂酰輔酶A奎寧酸羥基肉桂酰基轉移酶連續作用下生成綠原酸[13]。第四種途徑是僅在少量植物中合成，通過同位素示蹤在甘薯根部發現了HCGQT，咖啡酰-D-葡萄糖（Caffeoyl-D-glucose）和D-奎寧酸（D-quinic acid）催化綠原酸的形成[13-14]。所有這些合成途徑都涉及相同類型的羥基化和酯化反應[6-16]。

自20世紀50年代起，為獲得更高的經濟效益，抗生素開始作為生長促進劑被添加到動物飼料中，此做法逐步成為全球養殖業的普遍行為[17]。在沒有嚴格的監管制度和過度使用抗生素的情況下，不僅針對動物的病原菌產生耐藥性，而且在動物體內堆積的抗生素會隨著糞便等排泄物排出，一旦其被用作肥料進入土壤，進入地下水，就會影響人類的健康環境[18-19]。2020 年，我國農業農村部正式發布第194號公告，決定停止生產、進口、經營、使用部分藥物飼料添加劑，宣告著我國“全面禁抗”時代的到來；但是，其中仍然保留獸藥作為促生長類藥物的飼料添加劑品種[20]。早在2011年，我國就開始擬計劃全面禁止在飼料中添加任何抗生素。由此可見，抗生素替代產品的研究與發展，已經成為當前畜牧業生產領域不可忽視的問題。因此，植物來源的藥用提取物被人類所關注，因其具有長期接觸后不會誘發耐藥性等優勢，使得植物來源提取物成為當今研究主要熱點[21-22]。因此，本研究對不同發育時期的杜仲葉片進行轉錄組測序（RNA-seq），以期為杜仲葉片及其活性成分在養殖動物營養調控方面提供重要參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

研究中所用試驗材料來自內蒙古自治區包頭市甲爾壩村10年生種質資源，以4月、7月和10月采集不同發育時期的葉片，根據表征將葉片劃分為：4月剛展開的嫩葉（T1）；7月成熟葉片，輕微革質化（T2）；10月完全成熟葉片，葉片顏色最深，完全革質化（T3）（圖1）。采樣后用液氮速凍，放置于 -80^°C 超低溫冰箱中保存備用。

1.2 HPLC法測定綠原酸含量

使用HPLC測定3個不同發育時期葉片的綠原酸含量，使用1260InfinityII高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），LunaHPLC/UHPLCC18色譜柱（飛諾美phenomenex）；GM-0.33M循環水式多用真空泵（津騰）；SKE-3（72S）超聲波清洗機（寧波市鄞州碩力儀器有限公司）。綠原酸標準品（津騰）。色譜條件：柱溫 25^°C ，流動相A為 0.4% 甲醇，流動相B為磷酸水，以洗脫梯度 0～3 min，30%～33%B ： 3～10min ， 33%～35%B ； 10～ 13min ， 35%～ 62%B ； 13～23min ， 62%～ 65%B ； 23～25min ， 65%～100%B ； 30～ 45min ， 30%～33%B 。

標準溶液制備：分別稱取綠原酸對照品10mg ，用甲醇水定容至 10mL ，冷藏待用。供試品稱取綠原酸粉末 5g ，用 60% 乙醇定容至 100mL 后，恒溫水浴鍋加熱、過濾、濃縮。綠原酸含量根據峰面積計算，3個技術性重復，通過SPSS軟件進行統計學分析[23]。

1.3 轉錄組測序及數據分析

1.3.1RNA提取、cDNA文庫構建及轉錄組測序

使用CTAB法提取3個不同發育時期杜仲葉片總RNA，3個不同發育時期總RNA送至武漢邁特維爾生物科技有限公司進行高通量RNA-Seq測序。利用IlluminaNovaseq6000 測序平臺對cDNA文庫進行測序；Unigene序列利用BLAST軟件在KEGG和GO數據庫進行比對。

1.3.2轉錄組測序質量評估

測序reads經過fastp過濾后得到cleanreads，測序數據的準確度以Q20和Q30的大小評估，通常 ?85% 數據質量較好。將質量較好的cleanreads與杜仲參考基因組比對，進行基因結構注釋、基因表達分析和基因功能預測等[24]。利用軟件HISAT2將CleanReads與杜仲參考基因組進行序列比對，獲得在基因組或參考基因組上的位置信息，以及測序樣品特有的序列特征信息。

1.3.3 差異表達基因（DEGs）鑒定與功能注釋分析

采用HISAT軟件構建基因組索引，并將cleanreads比對到參考基因組。隨后，使用featureCounts軟件對基因比對情況進行計算，并根據基因長度計算每個基因的FPKM（FragmentsPerKilobase of transcript per Million mapped reads）。基于表達量定量結果，以FDR lt;0.05 且 （foldchange） ?1 作為顯著性閾值，篩選不同發育時期間表達水平顯著差異的基因（Differentiallyexpressedgenes，DEGs）。最后，將篩選出的DEGs 進行 KEGG（Kyoto encyclopedia of genesand genomes）和GO（Gene ontology）富集分析。

1.4 Kmeans表達趨勢

基于篩選獲得的DEGs并集，提取其FPKM表達矩陣，使用R語言中的scale函數進行標準化處理，采用Kmeans聚類分析，將具有相似的變化趨勢的基因進行歸類分析。

1.5 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

根據杜仲葉片轉錄組數據，篩選綠原酸合成通路中的DEGs，進行qRT-PCR測定，驗證轉錄組數據的真實性及可靠性。使用Primer3.0設計各基因的特異性qRT-PCR引物，Actin和GADPH為內參基因（表1）。總RNA的提取使用試劑盒（OminiPlantRNAKit），反轉錄使用試劑盒（PrimeScriptTMRT-PCRkit）合成，使用LightCycler480II實時熒光定量PCR儀上進行實時熒光定量PCR反應。每個基因重復3次，表達量的計算采用 法[25]。

2 結果與分析

2.1 杜仲葉片不同發育時期綠原酸含量變化

在葉片發育過程中，綠原酸含量呈現先升高后降低的趨勢（圖2）。具體而言，從T1階段 42.20% 到T2階段 79.51% ，綠原酸含量增加了 37.31% ；而在T2至T3階段，含量則顯著下降57.63% 。結果表明，綠原酸含量隨葉片發育呈現先升高后降低的動態變化趨勢。

2.2 測序數據質量評估

本試驗選取杜仲葉片3個不同發育時期的9個樣品為研究對象進行轉錄組分析，經嚴格過濾后共獲得58.06GbCleanData。將質控后的cleanReads與參考基因組進行比對，得到的比對率均高于90.00% 以上。其中Q30堿基百分比在 94.00% 以上，序列GC含量為 47.13～48.90 （表2）。以上結果均表明本實驗測序質量較好，可用于后續分析。

2.3 樣本間相關性分析

對杜仲葉片在3個發育時期的樣本轉錄組數據進行主成分分析（PCA），結果顯示，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）可分別解釋 49.35% 和22.94% 的方差，累計貢獻率為 72.29% 。同時，各時期內的3個生物學重復具有高度相似性，且不同時期樣本間存在明顯分離，表明轉錄組數據質量良好。此外，基于FPKM的聚類熱圖證實了樣本的組內相似性（圖3）；進一步驗證了數據的可靠性。值得注意的是，3個月份樣本明顯分離，說明3個發育時期存在差異。

2.4 杜仲葉片不同發育時期DEGs的鑒定與分析

篩選杜仲葉片3個發育時期的DEGs，比較基因表達水平及鑒定不同發育時期中DEGs。

T1vsT2產生8192個DEGs，其中上調基因個數為3523個，下調基因數量為4669個；T1vsT3產生9350個DEGs，其中上調基因個數為3927個，下調基因數量為5423個；T2vsT3產生3963個DEGs，其中上調基因個數為1679個，下調基因數量為2284個（圖4A）。可以看出，T1vsT3之間的差異表達基因最多，這些差異表達基因可能與杜仲葉片代謝產物活性較強有關。進一步通過韋恩圖分析，展示出不同比較組特有的差異表達基因和組間共有的差異表達基因。通過對比3個比較組，發現共存上調基因336個，共存下調基因652個（圖4B）。根據兩兩比較的差異表達基因數目，發現3個比較組中下調DEGs數目均高于上調DEGs數目，這意味著葉片發育過程中代謝物積累的變化可能受到差異表達基因的嚴格調控。

2.5 差異表達基因KEGG富集分析

2.5.1 KEGG上下調差異表達基因（DEGs）氣泡圖

通過KEGG數據庫對杜仲葉片在3個不同發育時期中DEGs參與的代謝通路進行注釋和分析。對3個不同發育時期的差異表達基因進行對比分析發現（圖5），3組比較中，與綠原酸合成的相關代謝途徑DEGs在6個途徑中顯著富集（ ?Plt;0.05） ：花青素生物合成（Anthocyaninbiosynthesis）、單萜生物合成（Monoterpenoidbiosynthesis）、苯并惡嗪生物合成（Benzoxazinoidbiosynthesis）、苯丙素生物合成（Phenylpropanoid biosynthesis）、萜類骨架生物合成（Terpenoidbackbonebiosynthesis）、苯并嗪類生物合成（Benzoxazinoidbiosynthesis）。這表明綠原酸積累的變化可能是由參與這些生物代謝過程的DEGs引起。

2.5.2KEGG上調差異表達基因富集分析

對上調差異表達基因進行KEGG柱狀圖分析（圖6），發現T1vsT2主要富集在單萜生物合成（Monoterpenoidbiosynthesis）、苯并嗪類生物合成（Benzoxazinoid biosynthesis）、花青素（Anthocyaninbiosynthesis）。T1vsT3主要富集在Isoflavonoidbiosynthesis（異黃酮生物合成）、Benzoxazinoidbiosynthesis（苯并嗪類生物合成）、Caffeinemetabolism（咖啡因代謝）。T2vsT3上調差異表達基因主要富集在苯丙素生物合成（Phenylpropanoidbiosynthesis）、異黃酮生物合成（Isoflavonoidbiosynthesis）、類胡蘿卜素生物合成（Carotenoidbiosynthesis）。由此發現，在3個比較組中，均出現與綠原酸合成相關通路，說明綠原酸差異表達基因在杜仲葉片整個發育時期均有所變化。

2.6 差異表達基因GO注釋分析

為探究杜仲葉片發育過程中DEGs的主要生物學功能，對DEGs進行GO注釋分析，從而確定差異表達基因主要的生物學功能，包括生物過程（Biological process）、細胞組成（Cellularcomponent）和分子功能（Molecularfunction）三大類。對DEGs進行GO第二層級分類統計，按照注釋將基因數量從大到小進行排序，分別取BP、CC和MF三大類的前15個GOTerm（圖7）。分析過程中，主要關注差異表達基因參與綠原酸生物合成。

T1vsT2與綠原酸相關的DEGs富集在萜類化合物生物合成過程（Terpenoidbiosyntheticprocess）、單萜生物合成過程（Monoterpenoidbiosyntheticprocess）、單萜代謝過程（Monoterpenoidmetabolicprocess）。T1vsT3與綠原酸相關的DEGs富集在萜類化合物生物合成過程（Terpenoidbiosyntheticprocess）、苯丙素代謝過程（Phenylpropanoidmetabolicprocess）、單萜生物合成過程（Monoterpenoid biosynthetic process）、單萜代謝過程（Monoterpenoid metabolicprocess）。T2vsT3與綠原酸相關的DEGs富集在苯丨丙烷代謝過程（Phenylpropanoidmetabolicprocess）、苯丙烷生物合成過程（Phenylpropanoidbiosyntheticprocess）、三萜生物合成過程（Triterpenoidbiosynthetic proces）、異黃酮代謝過程（Isoflavonoid metabolic process）、異黃酮生物合成過程（Isoflavonoidbiosynthetic process）。GO注釋分析表明，綠原酸積累的變化可能是由參與這些生物代謝過程的DEGs引起的。

2.7 表達趨勢分析

為解析差異基因在杜仲葉片發育過程中的表達趨勢，將差異基因并集的FPKM使用R語言scale函數進行標準化處理，并進行Kmeans聚類分析，最終獲得10個不同表達模塊（圖8）。基于表達模式與綠原酸含量變化的相關性分析，篩選出Class4、Class8和Class10中的基因進行深入研究，以挖掘調控綠原酸合成的關鍵基因。

2.8 杜仲葉片綠原酸生物合成相關基因篩選

現有研究表明，綠原酸生物合成主要涉及苯丙烷生物合成途徑（ ）。在上述分析中，Class4、Class8和Class10中共有20個基因富集在苯丙烷生物合成途徑（ ko00940 ）。然而，與綠原酸相關且與綠原酸含量變化一致的基因有9個，2個PAL基因和7個HCT基因。基于其他植物苯丙烷合成相關研究及差異基因的KEGG代謝通路分析，本研究建立了杜仲葉片綠原酸的合成通路（圖9）。

2.9 qRT-PCR驗證RNA-seq數據可靠性

為了驗證轉錄組數據結果的準確性，本研究選取了在綠原酸生物合成（ ko00940 ）中4個與綠原酸合成相關的基因進行qRT-PCR驗證，結果顯示EU01211331、EU0122731、EU0122730、EU0122732的表達量從T1至T3呈現先上升后下降趨勢，與RNA-seq結果基本一致（圖10）。此外，與HPLC法測定3個不同發育時期綠原酸含量變化結合分析，發現不同發育時期綠原酸合成相關基因的表達趨勢與綠原酸含量變化趨勢一致，均隨著葉片發育過程中呈現先增加后降低趨勢。

3討論

3.1 杜仲葉片綠原酸含量

評價藥用植物的質量標準，主要取決于有效藥用化學成分含量，其與品種、地域、栽培環境和采收季節等有較大關系，其中采收季節是不可忽略的重要因素。早前，確定藥用植物最佳采收季節，多來自人類生產實踐中的經驗總結；隨著藥用植物研究的發展，需要考慮有效藥用成分在植物體內積累動態的變化規律[25]。關于不同種類藥用植物中有效藥用成分積累變化有較多研究，如郝巖等[2測定了不同采收時期五味子葉片中總黃酮、總黃酮醇和總酚酸含量的動態變化，結果發現藥用成分含量大致趨勢為先升高至6月下旬到達最大值，后逐漸降低并有微小浮動。戚仁潔等[27]在苦瓜皂苷的研究中發現，在子房期（T1）、幼果期（T2）、商品果期（T3）和完全成熟期（T4）中，苦瓜內源皂苷含量隨著果實發育而呈現顯著下降的趨勢。杜仲中將綠原酸作為質量評價的指標性成分，為了明確杜仲綠原酸在發育過程中的合成規律，本研究測定了杜仲葉片3個不同發育時期綠原酸含量，結果表明杜仲葉片中綠原酸含量會隨著發育過程出現先增加后降低趨勢，在夏季杜仲中綠原酸含量高于其他時期，這與黃琛斐等[28]、魏銳[29]、何希瑞等[30]研究結果一致。魏銳[27]進一步研究發現6月是綠原酸含量最高的月份，與之不同的是何希瑞等[30研究發現8—9月是綠原酸含量最高的月份。這一現象可能是地域差異和樣品處理方式的不同導致[29-32]。

3.2 杜仲葉片綠原酸生物合成相關基因

本研究中發現，在3個不同發育時期對比數據中，下調基因數目均高于上調基因數目，這說明杜仲葉片發育過程中，某些生物合成相關基因作用是逐漸減弱的，推測可能與代謝產物轉運相關。該現象在其他植物中也出現類似現象，如苦瓜不同時期果實皂苷合成存在變化，在組間對比差異中，下調基因數目均高于上調基因數目，這表明苦瓜果實成熟過程中，皂苷合成相關基因的作用是逐漸減弱的[30]。本研究的Class4、Class8 和Class10中的差異基因的表達量呈現先升高后降低的趨勢，與測定的綠原酸含量變化規律相一致。由此推測，該模塊中的基因可能與杜仲葉片綠原酸生物合成相關。進一步分析發現，苯丙烷生物合成通路與杜仲葉片綠原酸化合物合成相關，鑒定出2個關鍵酶及9個差異表達基因。這一結果與Ye等[31]研究結果相似，但與綠原酸合成通路中的關鍵酶有部分差異，這可能由于不同基因型、采樣時間和地理位置等因素所影響。植物綠原酸化合物主要是通過苯丙烷途徑合成[13]，對苯丙烷途徑不同變化趨勢的DEGs進行分析，發現部分DEGs變化趨勢與綠原酸含量變化不一致。這一現象原因尚不明確，推測可能與葉片發育過程中的部分次生代謝產物會向種子轉運和積累這一現象有關。

4結論

本研究發現杜仲葉片綠原酸含量隨著葉片發育成熟呈現先上升后下降的趨勢。通過轉錄組分析，按照表達模式將這些基因分成10個模塊，其中Class4、Class8和Class10中基因的表達趨勢與杜仲葉片綠原酸含量變化規律相一致。從中進一步鑒定出，苯丙烷合成通路兩個關鍵酶PAL和HCT，包含9個與綠原酸合成相關基因。目前對于杜仲葉中綠原酸合成途徑的研究不足，制約了對杜仲葉片的合理利用與發展。本研究從分子生物學的角度，闡明影響杜仲葉中綠原酸形成的主導內在遺傳因素，對實現藥材質量“安全、有效、穩定、可控”的目標有重要意義，可為杜仲資源合理利用，合理采收等提供參考依據。

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[本文編校：吳毅]