肝細(xì)胞癌腫瘤微環(huán)境相關(guān)基因與預(yù)后的關(guān)系

肝癌是高發(fā)病率、高致死率的惡性腫瘤，占全世界癌癥發(fā)生率的 6%^[1] ，肝細(xì)胞癌（hepato-cellularcarcinoma，HCC）是全世界最高發(fā)的肝癌類型，約占原發(fā)性肝癌總數(shù)的 75%～90%^[2] 是肝癌研究的重點[3]。HCC 的發(fā)生發(fā)展主要由復(fù)雜的因素協(xié)同作用共同促進(jìn)肝炎-肝硬化-肝癌的轉(zhuǎn)變效應(yīng)，其中腫瘤微環(huán)境（tumormicroenvironment，TME）是近幾年研究癌癥發(fā)生及耐藥機制比較熱門的因素之一[4]。TME 是腫瘤細(xì)胞所處的細(xì)胞環(huán)境，其在腫瘤的生長和進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用主要組成包括細(xì)胞外基質(zhì)、可溶性分子和腫瘤基質(zhì)細(xì)胞還有眾多免疫細(xì)胞[5]，免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞是其兩種主要類型的非腫瘤組分，并且已被提出對于腫瘤的診斷和預(yù)后評估是有價值的[6-7]。在這篇文章中，使用基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（geneexpressionomnibus，GEO）分析在癌旁組織與HCC組織中腫瘤微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞與免疫細(xì)胞的表達(dá)差異，探討其與HCC患者臨床表征和預(yù)后的相關(guān)性，為研究肝細(xì)胞癌的靶向藥物聯(lián)合治療提供新思路和理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1數(shù)據(jù)下載及注釋

從GEO數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds）下載公共原始數(shù)據(jù)，包括探針矩陣文件（GSE76427_ series_ matrix.txt.gz）和平臺文件（GPL10558_HumanHT_12_V4_0_R1_15002873_B.txt），其中樣本總數(shù)167個（癌旁組織樣本52個，HCC組織樣本115個）。將平臺文件探針矩陣轉(zhuǎn)化成基因矩陣，根據(jù)ESTIMATE算法繼而得到腫瘤微環(huán)境的打分結(jié)果[8]，將免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞分為高評分組和低評分組，并取上調(diào)和下調(diào)基因的交集，對基因集進(jìn)行基因功能注釋。本研究使用的所有數(shù)據(jù)均從GEO下載，數(shù)據(jù)的收集和使用均按照GEO的出版指南和數(shù)據(jù)訪問政策進(jìn)行，無需獲得當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會的額外批準(zhǔn)。

1.2基因富集分析

通過R包clusterprofiler對DEGs進(jìn)行功能富集分析以識別GO（geneontology，GO）類別。利用聚類分析器參照京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）路徑進(jìn)行路徑富集分析，以 FDRlt;0.05 作為分界點。

1.3蛋白-蛋白相互作用

在 STRING 10.5 平臺（https：//string-db.org）構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用（protein-proteininteraction，PPI）網(wǎng)絡(luò)模型，將蛋白種類設(shè)置為“Homosapiens”，將最低相互作用閾值設(shè)置為“highest confidence”（ gt;0.96） ，其他參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，以獲得PPI網(wǎng)絡(luò)效果。

1.4DEGs體外實驗驗證

培養(yǎng)L-02正常肝細(xì)胞和HePG2肝癌細(xì)胞，對數(shù)生長期的HePG2細(xì)胞分別用阿霉素（Adria-mycin，ADR）不同濃度（7.5、15.0、 30.0mg/ L）處理 24h ，觀察細(xì)胞生長情況，計算IC50值，并用于后續(xù)RNA收集。以總RNA約 1μg 為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。在ABIQuantStudioDx系統(tǒng)上使用TrantStartGreenqPCRSuPerMix（北京，中國）評估靶基因表達(dá)水平，以GAPDH表達(dá)水平作為內(nèi)參，然后，采用 2^-ΔΔCT 方法計算目標(biāo)基因的相對表達(dá)量。PCR所用引物由生工生物技術(shù)公司合成（見表1）。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析

采用Perl軟件對數(shù)據(jù)文本進(jìn)行預(yù)處理。SPSS（IBMCorP.Armonk，NY，USA），R語言（R-Project.org），Bioconductor項目提供的軟件包（www.bioconductor.ORG）進(jìn)行統(tǒng)計分析和制圖。使用R軟件包“survival”進(jìn)行生存分析，然后使用“survminer”軟件包繪制生存曲線。采用Wilc-oxon秩和檢驗法測定HCC樣本組織及鄰近組織中的DEGs。采用R軟件分析免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞之間的DEGs。根據(jù)得分，將模型擬合到“l(fā)imma”包框架中，并使用配對 χ_t 檢驗對感興趣的假設(shè)進(jìn)行檢驗[10]。 p 值已針對多重假設(shè)檢驗進(jìn)行校正，并以FDR值表示（ plt;0.05） ， p 值由雙側(cè)檢驗得出。

2結(jié)果

2.1評分和生存及臨床性狀的關(guān)系

從GEO數(shù)據(jù)庫下載了115名HCC患者的基因表達(dá)圖譜和臨床信息。基于ESTIMATE算法，免疫評分分布在 -808.82～2623.22 之間，基質(zhì)評分范圍分別為-1556.65＼～1076.46，綜合評分分布在-2365.48～3014.57 之間。HCC腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞評分和臨床性狀（性別、T分期等）沒有相關(guān)性（圖1）。總生存期（overallsurvival，OS）與免疫評分具有潛在相關(guān)性，Ka-PlaneMeier生存曲線（圖2B）顯示免疫評分低評分組的中位OS的病例數(shù)低于高評分組（對數(shù)秩檢驗 p=0.013 。

A免疫評分與BCLC分期的關(guān)系；B免疫評分與性別的關(guān)系；C免疫評分與T分期的關(guān)系；D基質(zhì)評分與BCLC分期的關(guān)系；E基質(zhì)評分與性別的關(guān)系；F基質(zhì)評分與T分期的關(guān)系

A綜合評分與生存差異的關(guān)系圖；B免疫評分與生存差異的關(guān)系圖；C基質(zhì)評分與生存差異的關(guān)系圖

2.2基質(zhì)細(xì)胞與免疫細(xì)胞基因差異表達(dá)

為了揭示整體基因表達(dá)譜與免疫評分和/或基質(zhì)評分的相關(guān)性，比較GEO數(shù)據(jù)庫中167例HCC患者的Illumina微陣列數(shù)據(jù)。圖3A、B中的熱圖顯示了免疫評分高與基質(zhì)評分低組病例的不同基因表達(dá)譜，此外，Venn圖（圖3C，D）顯示，460個基因在高分組中普遍上調(diào)，34個基因普遍下調(diào)。為了概述DEGs（differentially expressedgenes，DEGs）的潛在功能，對高免疫評分組的460個上調(diào)基因和34個下調(diào)基因進(jìn)行了功能富集分析。

A基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)熱圖；B免疫細(xì)胞表達(dá)熱圖；C基質(zhì)細(xì)胞與免疫細(xì)胞上調(diào)表達(dá)基因交集圖；D基質(zhì)細(xì)胞與免疫細(xì)胞下調(diào)表達(dá)基因交集圖

2.3基因功能聚類分析（genefunctionclusteranaly-sis）

在Venn圖中發(fā)現(xiàn)在高分組中有460個基因普遍上調(diào)，34個基因普遍下調(diào)。為了揭示差異表達(dá)基因的潛在功能，對免疫和基質(zhì)評分普遍上調(diào)和下調(diào)的基因進(jìn)行功能富集分析。通過RPackageclusterProfiler對494個差異表達(dá)基因進(jìn)行基因的功能注釋及通路富集分析，根據(jù) FDRlt;0.05 進(jìn)行篩選，結(jié)果表明494個靶點參與了702個生物過程相關(guān)的條目、65個細(xì)胞組成相關(guān)條目、70個分子功能相關(guān)條目。ToPGO術(shù)語確定了中性粒細(xì)胞激活、細(xì)胞因子參與并介導(dǎo)免疫反應(yīng)（圖4A）。將通路富集分析結(jié)果 plt;0.05 的前30條通路進(jìn)行可視化（圖4B）。圖4中長方形條框越長，表明通路富集到的基因數(shù)目就越多；顏色越紅，表明p值越小。

A基因功能注釋分析；B基因富集通路分析

2.4蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

共同靶點構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)模型（圖5A）。其中CXCL8、CXCL10、JUN、OAS2、MX1、MX2、SYK等基因為中樞核質(zhì)相互作用基因，是富集相互作用數(shù)目最多的基因，直接作用基因數(shù)最高為10個，combined_ score最高可達(dá)0.999。根據(jù)相互作用的蛋白數(shù) ?5 個，可以將各基因蛋白進(jìn)行可視化直觀展示（圖5B）。

A基因相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖；B基因相互作用的富集數(shù)目

2.5預(yù)后基因生存相關(guān)性

在免疫高評分組中，544個基因根據(jù)（ plt; 0.05）進(jìn)行篩選，得到87個與HCC生存分析具有顯著意義的基因見表2。進(jìn)一步過濾，篩選得到8個基因表達(dá)與HCC生存分析比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ plt;0.01 ），分別是ALOX5AP、BST2、BTK、CD48、CECR1、CORO1A、DOCK2、Clorf162，各基因表達(dá)與生存關(guān)系分析圖如圖6所示，在87個具有顯著生存意義的基因中選取蛋白互作基因數(shù)目5個及以上的基因可以得到8個二級核心基因，分別是ALOX5AP、BST2、BTK、CCL5、COL6A1、HLA-DMB、HLA-DRA、RAC2。其中BST2、BTK均是與HCC生存預(yù)后分析比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義性（ plt;0.01 ）且蛋白互作數(shù)目多的一級核心基因。

AALOX5AP基因表達(dá)與生存關(guān)系差異；BBST2基因表達(dá)與生存關(guān)系差異；CBTK基因表達(dá)與生存關(guān)系差異；DCD48基因表達(dá)與生存關(guān)系差異；ECECR1基因表達(dá)與生存關(guān)系差異；FCORO1A基因表達(dá)與生存關(guān)系差異；GDOCK2基因表達(dá)與生存關(guān)系存在差異；HC1orf162基因表達(dá)與生存關(guān)系也存在差異。

2.6DEGs的體外驗證

ADR作用于HePG2細(xì)胞24h的IC50為82.5mg/L 。如圖7所示，所有8種DEGs在經(jīng)ADR處理的HePG2細(xì)胞中表達(dá)與對照組相比均有顯著差異。然而，只有BST2和BTK基因在肝癌和正常肝細(xì)胞系中表達(dá)有顯著差異并具有量-效關(guān)系（ plt;0.05） 。BST2和BTK是在HCC腫瘤微環(huán)境中起重要作用的 DEGs 。

以L-02細(xì)胞為對照組，以* plt;0.05 ，** plt;0.01 ，****plt;0.001 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。（A）不同濃度ADR對HePG2細(xì)胞存活率的影響；（B）ALOX5AP；（C）BST2；（D）BTK；（E）CD48；（F）CECR1；（G）CO-RO1A；（H）DOCK2；（I）C1orf162

3討論

GEO數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)挖掘已被廣泛用于預(yù)測癌癥預(yù)后及預(yù)后基因差異分析，在這項工作中，筆者分析了這87個DEGs的總體生存分析結(jié)果，挖掘了8個（ALOX5AP、BST2、BTK、CD48、CECR1、CORO1A、DOCK2、C1orf162）與 HCC預(yù)后生存顯著性差異最強的基因（ plt;0.01 ），其中BST2、BTK這兩個基因是蛋白互作基因數(shù)目的一級核心基因。此后進(jìn)行體外細(xì)胞實驗也驗證了前面的分析篩選，這證明了基于GEO數(shù)據(jù)庫使用ESTIMATE算法對HCC腫瘤微環(huán)境相關(guān)基因進(jìn)行大數(shù)據(jù)分析的預(yù)后價值。

BST2，也被稱為CD317，是一種跨膜糖蛋白。BST2在HCC組織中高表達(dá)，被認(rèn)為是縮短肝癌患者OS 的重要臨床預(yù)后指標(biāo)[]。它參與B細(xì)胞的生長發(fā)育，并能有效激活核因子 -σ_KB （NF-π_KB ），從而在免疫中發(fā)揮重要作用。BST2表達(dá)升高與腫瘤大小和數(shù)量的增加密切相關(guān)，但BST2與miR-760 聯(lián)合可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[12]。BST2 也是膠質(zhì)瘤預(yù)后不良的獨立危險因素[13]。BST2 高表達(dá)HCC患者的總生存率較低。它被認(rèn)為是HCC的獨立不良預(yù)后因素，與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并有助于腫瘤轉(zhuǎn)移[14]。另一個核心基因布魯頓酪氨酸激酶（BTK）是一種細(xì)胞質(zhì)酪氨酸激酶，是與人類癌癥發(fā)病相關(guān)的Tec激酶家族中唯一的成員[15]。該基因編碼的蛋白質(zhì)在B細(xì)胞發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用，該基因突變會產(chǎn)生免疫缺陷，導(dǎo)致不能產(chǎn)生成熟的B淋巴細(xì)胞進(jìn)而誘發(fā)惡性腫瘤HCC[16-17]

中性粒細(xì)胞是宿主防御的關(guān)鍵防線，在消除感染中發(fā)揮著重要作用[18-19]。然而，中性粒細(xì)胞黏附增加導(dǎo)致中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用增強，從而導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷和器官功能障礙[20-21]，并且過度嗜中性粒細(xì)胞激活可能會對宿主有害，導(dǎo)致附屬組織損傷[22]，包括分泌促炎介質(zhì)導(dǎo)致炎癥進(jìn)而誘導(dǎo)癌癥 HCC^[23] 。細(xì)胞因子在炎癥過程的協(xié)調(diào)以及與炎癥相關(guān)的癌癥中發(fā)揮著廣泛免疫調(diào)節(jié)作用[24]，對人類生物學(xué)和疾病至關(guān)重要。細(xì)胞外基質(zhì)對炎癥及腫瘤免疫反應(yīng)是密不可分的，研究細(xì)胞外基質(zhì)在腫瘤免疫中的關(guān)鍵作用可能揭示新的腫瘤治療策略或改善現(xiàn)有的策略[25]

本研究利用HCC轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行DEGs挖掘和功能富集分析，鑒定出與預(yù)后有顯著性差異的基因。此外，細(xì)胞外基質(zhì)、中性粒細(xì)胞活化和細(xì)胞因子都參與了HCC預(yù)后不良的發(fā)生。DEGs的鑒定可能為尋找治療HCC的新靶點和新方法提供新的見解[26]。由于HCC 的復(fù)雜性，其腫瘤微環(huán)境需要由更大的隊列進(jìn)行更全面的分析，未來還需要更完整的體內(nèi)體外實驗來探索TME和DEGs影響HCC進(jìn)展的具體機制，實現(xiàn)積極的健康結(jié)果。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突

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Tumor Microenvironment-Related Genes Associated with Prognosis in Hepatocellular Carcinoma

CAI Ye'， DUAN Fangfang2（1. Department of Pharmacy， Jiangxi Children's Hospital； 2. Central Laboratory，Jiangxi Children's Hospital，Nanchang，Jiangxi 33o006，China）

ABSTRACTObjective Hepatocelular carcinoma （HCC） is a common malignancy. Genes related to the tumor microenvironment（TME）areoftencloselyrelated tooverallsurvival（OS）.However，therolesofTME-related genes in HCC have notyetbeen fulyelucidated.This studyaimed toidentifyTME-related genes thatcouldbeused to predictpoor prognosis in patients with HCC.Method The GSE76427 datasetand GPL10558 Platform matrix file inGene Expression Omnibus（GEO）were downloaded.Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）and GeneOntology（GO）analyses were conducted to identifydiferentially expressed genes （DEGs）and explore their potential prognostic value.Result Immune scores were significantly associated with OS and Barcelona Clinic Liver Cancer （BCLC） grade（ plt;0.05 ）. We identified 87 genes in the TME that were significantly correlated with HCC OS（ plt;0.05 ）.Eight of these DEGs， ALOX5AP，bone marow stromal cellantigen 2（BST2），Bruton tyrosine kinase（BTK），CD48，CECR1，CORO1A， DOCK2，and C1orf162 were significantly associated with OS （ plt;0.01 ）.Conclusion We identified two（BST2、BTK） TME-related genes thatweresignificantlyassociatedwithpoorprognosis in HCC，providingatheoretical basis fortreatment.

KEYWORDSdiferentially expressed genes；GEO database；hepatocellular carcinoma；prognosis；tumor microenvironment

（責(zé)任編輯 胡安娜）