二甲雙胍增強(qiáng)體外擴(kuò)增γST細(xì)胞的抗腫瘤活性

Abstract：Gamma delta （yδ） Tcellsare a subset ofTlymphocytes expressing γδT cell receptors，which possess both innate andadaptiveimmune functions.Theycanrecognizeandkilltumor cells inamanner independentlyofMHCrestriction. However，theirlimitedquantityinvivoandlowefficiencyinvitroexpansionrestricttheirclinicalapplication.Thisstudy utilizedacombinationofcytokinesinterleukin-2（I-2）nterleukin-15（-15），ndtebisphosphonatedugzoledrocacid （Zol） to stimulate γδT cellsand optimize their in vitro expansion strategy.Results demonstrated that thecombination of Zol （5μmol/L） ，IL-2（ 100IU/mL ，andIL-15 Δ_10ng/mL ）achieveda10 ooo-foldexpansion of γδT cells，with a purity of 95.74% among CD3-positivecels.Additionally，metformintreatmentsignificantlyincreasedtheproportionsofcentralmemorycell subsets from 10.75% to 15.85% and effector memory cell subsets from 5.98% to 19.30% in γδT cells ）.Metformin also markedly upregulated the expression of anti-tumor factors interferon ?γ （IFN-γ） ， granzyme B （GZMB），and perforin in γδT cels，promotedexosomesecretion，andeancedcytotoxicactivity.Thisstudyprovidesanovelstrategyforinvitropansion and functional optimization of γδT cells，laying the foundation for their application in adoptive immunotherapy for tumors.

Key words： γδT cells; antitumor activity; metformin; anti-tumor factor; adoptive immunotherapy （ActaLaser Biology Sinica，2025，34（3）：229-238）

γδT 細(xì)胞是具有 γ 鏈和8鏈組成的T細(xì)胞受體（Tcellreceptor，TCR）表達(dá)的T細(xì)胞亞群，在外周血的CD3 陽性細(xì)胞里所占比例為 5%～10%^[1-3] 。與ααααααααααααααααααααααααααααααβαααα 細(xì)胞相似，胸腺內(nèi) γδT 細(xì)胞的發(fā)育需要重組激活基因?qū)ζ銽CRCDR3區(qū)的V（D）J片段進(jìn)行體細(xì)胞重排[4]。人 γδTCR 由兩個不同的基因片段編碼：位于7號染色體上的TRG基因片段編碼6個功能性Vγ基因，TRD基因片段嵌人14號染色體的TRA位點，編碼8個功能性的 Vδ 基因[5]。根據(jù)Vδ鏈的特征，γ8T細(xì)胞分為兩大子集： Vδ2⁺ 亞群和非 Vδ2⁺ 亞群。非 Vδ2⁺ 亞群主要存在于皮膚、腸道和生殖系統(tǒng)等上皮組織區(qū)域中[6]。在外周血中的γδT細(xì)胞絕大多數(shù)表達(dá)半不變的磷酸抗原反應(yīng)性TCRVγ9V82，由于其極容易獲得所以最早被關(guān)注用于臨床研究[5]。

在過繼性免疫細(xì)胞治療中， γδT 細(xì)胞是具有巨大潛力的一種免疫細(xì)胞[7]。 γδT 細(xì)胞不僅能夠呈遞抗原并觸發(fā) αβT 細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的成熟，還可通過高表達(dá)顆粒酶B（granzymeB，GZMB）和穿孔素（perforin）直接殺傷腫瘤細(xì)胞，同時激活NK細(xì)胞受體，增強(qiáng)抗腫瘤應(yīng)答[8]。不同于經(jīng)典的 αβT 細(xì)胞，γ8T細(xì)胞不受主要組織相容性復(fù)合體（majorhistocompatibilitycomplex，MHC）限制即可識別抗原并發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，可以作為同種異體移植物輸注，因此在腫瘤免疫治療中具有重要潛力[9]。但γ8T細(xì)胞在人體內(nèi)占比相對較少，數(shù)量的限制減弱了其殺傷腫瘤的能力。 γδT 細(xì)胞主要分布在外周血和消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)黏膜中，末梢血中也有少量的γ8T細(xì)胞[10]。從外周血中提取γδT細(xì)胞，并在體外進(jìn)行大量擴(kuò)增獲得高純度、高數(shù)量的γ8T細(xì)胞回輸給腫瘤患者進(jìn)行過繼性腫瘤免疫治療是近年來的一個研究熱點。

在抗原刺激下， γδT 淋巴細(xì)胞從幼稚細(xì)胞逐漸成熟為增殖能力強(qiáng)、效應(yīng)功能低的中央記憶型（central memory，TCM）細(xì)胞（CD62L+CD45RA），在T細(xì)胞抗原進(jìn)一步的刺激下，它們可能成熟為效應(yīng)記憶型（effector-memory，TEM）細(xì)胞（CD62LCD45RA），最后驅(qū)動到表達(dá)終末分化CD45RA的終末分化效應(yīng)記憶型（terminallydifferentiatedeffectormemory，TEMRA）細(xì)胞[I-3]。目前腫瘤過繼性細(xì)胞療法，幾乎用的都是TEM型細(xì)胞，但是大多數(shù)TEM細(xì)胞輸入人體后只可存活兩周，療效難以維持[14]與TEM細(xì)胞相比，TCM細(xì)胞回輸體內(nèi)后可長期存活并能夠自我復(fù)制，同時它被腫瘤細(xì)胞激活后能轉(zhuǎn)化為TEM型細(xì)胞并持續(xù)發(fā)揮直接殺傷腫瘤細(xì)胞的作用[15]。所以，本研究希望尋求體外誘導(dǎo)培養(yǎng)TCM比例更高的γ8T細(xì)胞的方案。

病毒感染的細(xì)胞和癌細(xì)胞通常會通過羥基甲基戊二酰輔酶還原酶上調(diào)異戊烯焦磷酸（isopentenylpyrophosphate，IPP）[1-17]。這種非肽二磷酸代謝物“磷酸抗原\"（pAgs）特異性結(jié)合細(xì)胞表面蛋白BTN2A1/3A1的B30.2結(jié)構(gòu)域，進(jìn)而激活 TCRV_Y9Vδ2 細(xì)胞的反應(yīng)[18]。因此， v_Y⁹v_δ2T 細(xì)胞不是通過檢測病原體特異性或癌細(xì)胞特異性抗原發(fā)揮免疫功能，而是通過細(xì)胞表面的BTN2A1/3A1蛋白識別細(xì)胞感染或通過AMP活化蛋白激酶（AMP-activatedproteinkinase，AMPK）感應(yīng)ATP水平識別癌細(xì)胞代謝危機(jī)進(jìn)而發(fā)揮免疫功能[19]。有研究表明，白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2）是效應(yīng)T細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵因子[20]，白細(xì)胞介素-15（interleukin-15，IL-15）可以促進(jìn)γ8T細(xì)胞在體外大量增殖[21]，所以我們嘗試使用IL-2、IL-15和雙麟酸藥物唑來麟酸（zoledronicacid，Zol）聯(lián)合擴(kuò)增高純度的γ8T細(xì)胞。

二甲雙胍（metformin，Met）作為一種一線降糖藥物，一般用于治療2型糖尿病[22]，它主要通過降低肝臟葡萄糖生成和提高肌肉組織、脂肪組織對葡萄糖的攝取利用發(fā)揮作用。二甲雙胍一直被稱為是“神藥”，它不僅能治療糖尿病、降低血糖、改善血脂代謝，還具有一定的抗腫瘤作用[23-24]。二甲雙胍可通過激活A(yù)MPK途徑，引發(fā)腫瘤抑制因子LKB-1的激活，從而抑制mTOR途徑，減少腫瘤細(xì)胞增殖[25-26]。有研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可促進(jìn)記憶性T細(xì)胞的分化，提高其抗腫瘤功能[27]。然而，二甲雙胍對γδT細(xì)胞擴(kuò)增及抗腫瘤功能的影響尚不明確。因此，本研究探討了二甲雙胍對體外誘導(dǎo)γδT細(xì)胞擴(kuò)增及其抗腫瘤功能的影響，旨在優(yōu)化γδT細(xì)胞體外擴(kuò)增策略，為其在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用提供新思路。

1材料與方法

1.1試驗材料

人外周血淋巴細(xì)胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司，紅細(xì)胞裂解液購自上海生工生物工程有限公司。人肝癌細(xì)胞MHCC97H由本實驗室凍存保存。

RPMI1640培養(yǎng)基（含谷氨酰胺，不含硝酸鈣）DMEM/F12培養(yǎng)基和DMEM高糖培養(yǎng)基（含谷氨酰胺、丙酮酸鈉）購自Gibco公司，胎牛血清（fetalbovineserum，F(xiàn)BS）購自CellMax公司，噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞礬、青霉素和鏈霉素均購自上海生工生物工程有限公司。ⅡL-2購自北京同立海源生物科技有限公司，Zol購自美國Selleck生物科技有限公司，L-15重組蛋白購自武漢云克隆科技有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1γ8T細(xì)胞的分離和擴(kuò)增純化

從健康的供體獲取一定量的外周血與無菌磷酸鹽緩沖液（phosphatebufferedsaline，PBS）按1：1體積比混勻后獲得稀釋血樣。稀釋血樣緩慢加在淋巴細(xì)胞分離液Ficoll上層，稀釋血樣與分離液的比例為1：1。 800g 離心 18min ，去除大部分上層液體，移液槍吸取中間白色云霧層細(xì)胞，加入5倍體積PBS混勻，再用 800g 離心 10min ，保留沉淀細(xì)胞，再次使用PBS洗滌。棄上清，加入2倍體積的紅細(xì)胞裂解液，室溫孵育 5min 。加入 2mL PBS， 800g 離心10min ，洗滌細(xì)胞兩次，即獲得外周血單個核細(xì)胞（peripheralbloodmononuclearcell，PBMC）。進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)后將其加至含有 10% FBS以及擴(kuò)增必需的含有Zol、IL-2和IL-15的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37^°C ） 5%CO₂ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每2＼～3d更換一半培養(yǎng)液，添加新的含Zol、IL-2和IL-15的培養(yǎng)液，或重新更換新的含有Zol、IL-2和IL-15的培養(yǎng)液，培養(yǎng)11d收獲γδT細(xì)胞。細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)計算公式：擴(kuò)增倍數(shù) Σ=Σ （擴(kuò)增后總細(xì)胞數(shù) × 擴(kuò)增后 γδT 細(xì)胞純度）/（擴(kuò)增前總細(xì)胞數(shù) x 擴(kuò)增前γδT細(xì)胞純度）。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)分析

離心 800g，10min） 收集細(xì)胞，用PBS清洗兩次，檢測細(xì)胞表面蛋白時則用 4% 多聚甲醛固定細(xì)胞 10～15min ，離心去除后用PBS清洗兩次，再用含 1% FBS的PBS封閉 15～20min ，PBS清洗兩次。然后用 100μL PBS重懸細(xì)胞，加人適量的熒光素標(biāo)記抗體，抗體量根據(jù)細(xì)胞的數(shù)量而定。 1×10⁶ 個細(xì)胞加人 5μL 抗體，充分混勻， 4^°C 避光孵育30～60min 。離心去除上清，用PBS清洗兩次，用適量PBS重懸細(xì)胞后即可上機(jī)檢測。使用MoFloAstriosEQ流式細(xì)胞儀進(jìn)行流式細(xì)胞分析（Beckman-Coulter，USA），使用FlowJov10.8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和可視化。

1.2.3 MTT試驗

將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的MHCC97H細(xì)胞，植入96孔板，設(shè)置對照組和試驗組，每組設(shè)6個復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，對照組加入 100μL 細(xì)胞培養(yǎng)液，試驗組加入 100μL 含有5000個 γδT 細(xì)胞的細(xì)胞懸液，即效靶細(xì)胞比例為10：1，共培養(yǎng) 12h ，接著棄去培養(yǎng)液，PBS清洗2～3次，每孔加入 10μL MTT溶液（ 5mg/mL ，即 0.5% MTT）和 90μL 無血清無雙抗的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng) 4～6h 。棄上清，加入100μL 二甲基亞砜，在搖床上輕微震蕩 10min 使結(jié)晶充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀上于 490nm 處測量光密度值。

1.2.4實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-qPCR）分析

使用Trizol試劑（賽默飛世爾科技公司）從人肝癌組織中提取總RNA，使用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

根據(jù)VazymeSYBRqPCR試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，每個樣品設(shè)置4個平行反應(yīng)，根據(jù)說明書設(shè)置擴(kuò)增曲線和熔解曲線反應(yīng)程序。RT-qPCR引物列于表1中。得到擴(kuò)增階段Ct值，使用 2^-ΔΔCt 計算基因與對照組的相對表達(dá)值，計算并作圖分析。

1.2.5 外泌體分離與蛋白質(zhì)印跡

體外分離培養(yǎng) γδT 細(xì)胞8d后，在培養(yǎng)基中加人 2mmol/L 的二甲雙胍處理 12h 。為了排除培養(yǎng)基中添加的血清影響外泌體檢測，先離心去除原培養(yǎng)基，使用無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)γδT細(xì)胞 48h ，再進(jìn)行外泌體分離。使用超速離心法提取外泌體，先使用 800g 離心 10min 去除細(xì)胞，收集培養(yǎng)基; 2000g 離心 10min ，去除死細(xì)胞，留上清； 10000g 離心 30min ，去除細(xì)胞碎片，留上清；用0.22μm 過濾器過濾上清液以清除細(xì)胞碎片，使用超速離心機(jī) 100000g 離心 70min 小心去除上清，再用PBS重懸后 100000g 離心，得到潔凈的外泌體，用 20μL PBS重懸沉淀， -80^°C 保存?zhèn)溆谩?/p>

在外泌體中加入適量的細(xì)胞裂解液，冰上放置20～30min ，加入 6×SDS 上樣緩沖液， 105°C 金屬浴變性 10min ，進(jìn)行 12% 聚丙烯酰胺凝膠電泳（恒壓 80V30min ，后調(diào)整為 120V ）。電泳結(jié)束后，采用濕轉(zhuǎn)法（100V，60min）將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidenefluoride，PVDF）。封閉： 5% 脫脂牛奶室溫封閉1h；一抗孵育：抗CD63單克隆抗體（武漢三鷹，貨號67605-1-Ig， 1：5000 稀釋），抗CD9單克隆抗體（武漢三鷹，貨號82105-1-RR，1：5000 稀釋） 4^°C 孵育過夜；二抗孵育：HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（ 1：10000 稀釋），室溫孵育1h；最后進(jìn)行增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhancedchemiluminescence，ECL）顯影。

1.2.6 統(tǒng)計分析方法

使用Image J_? GraphPad軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)來自至少3個獨(dú)立試驗的平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差。兩組和兩組以上的比較分別用獨(dú)立樣本 t 檢驗和單因素方差分析檢驗。當(dāng) Plt;0.05 時，結(jié)果被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1γδT細(xì)胞的體外擴(kuò)增方案優(yōu)化

從健康人體的外周血中梯度離心提取出PBMC，在培養(yǎng)基中添加刺激γ8T細(xì)胞擴(kuò)增生長的Zol和細(xì)胞因子（IL-2、IL-15）誘導(dǎo)γδT細(xì)胞的擴(kuò)增和活化。在光學(xué)倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的大小、形態(tài)，檢驗細(xì)胞的活性和狀態(tài)。活γ8T細(xì)胞為外表光滑、形狀規(guī)則、大小均一、發(fā)亮的圓球狀，體外培養(yǎng)5d以后細(xì)胞會聚集結(jié)團(tuán)（圖1a），18d后細(xì)胞活力逐漸減小，細(xì)胞在顯微鏡下顏色暗淡，細(xì)胞形態(tài)變小且形狀不規(guī)則。有研究表明，使用IL-2和Zol體外誘導(dǎo)培養(yǎng)γ8T細(xì)胞，第14天時擴(kuò)增倍數(shù)只有450＼～1200倍[28-29]。因此，為了盡可能縮短誘導(dǎo)培養(yǎng)周期，進(jìn)一步探究體外高效誘導(dǎo) γδT 細(xì)胞擴(kuò)增的方案，我們使用不同濃度的細(xì)胞因子誘導(dǎo)同一批相同數(shù)量（ 1× 10⁵ 個）的PBMC細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)同時使用 Zol（5μmolL） ）IL-2（ 100IU/mL ）IL-15（ 10ng/mL ）時擴(kuò)增的效率最高?；诹魇郊?xì)胞儀計數(shù)檢測第11天時細(xì)胞數(shù)量達(dá)到了 1×10⁹ 個，細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)量達(dá)到了10000倍，γ8T細(xì)胞在CD3陽性中的比例為 95.74% （圖1b、1e）。這種培養(yǎng)方案擴(kuò)增倍數(shù)優(yōu)于僅使用IL-2和Zol誘導(dǎo)的 γδT 細(xì)胞[30-31]。為方便后續(xù)試驗統(tǒng)計，后續(xù)都使用最優(yōu)方案誘導(dǎo)培養(yǎng)γ8T細(xì)胞。

使用上述培養(yǎng)方案誘導(dǎo)培養(yǎng) γδT 細(xì)胞，第3天時，在培養(yǎng)基中加入 2mmol/L 的二甲雙胍處理48h ，流式細(xì)胞術(shù)分析表明，與未加入二甲雙胍的γδT細(xì)胞相比，經(jīng)過二甲雙胍處理的 γδT 細(xì)胞在CD3陽性細(xì)胞中的占比從 81.90% 提升到 97.67% （ Plt;0.01 ）（圖1c）。記憶性T細(xì)胞在CD3陽性細(xì)胞的比例從 16.73% 提高到 35.15% ，其中TCM（CD62L⁺CD45RA^-） 和TEM（CD62LCD45RA）比例都有明顯增加（圖1d、1f），TCM的比例從 10.75% 提高到 15.85% ，TEM的比例從 5.98% 提高到 19.30% （圖1d、1g）。這些試驗結(jié)果表明，二甲雙胍增強(qiáng)了γδT 細(xì)胞的記憶表型分化。

2.2二甲雙胍處理 γδT 細(xì)胞增強(qiáng)了其抗腫瘤殺傷作用

為探究二甲雙胍是否影響γ8T細(xì)胞的殺傷腫瘤的能力，體外誘導(dǎo) γδT 細(xì)胞培養(yǎng)5d后，我們用2mmol/L 的二甲雙胍預(yù)處理γδT細(xì)胞 48h ，離心去除含二甲雙胍的RPMI1640培養(yǎng)基，將經(jīng)二甲雙胍預(yù)處理過的 γδT 細(xì)胞與MHCC97H細(xì)胞共培養(yǎng)12h 。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)二甲雙胍處理的γδT細(xì)胞相比，經(jīng)二甲雙胍處理的 γδT 細(xì)胞對MHCC97H細(xì)胞的殺傷率從 28.8% 提高到 39.9% （圖2a＼～2b）；MTT試驗中γδT細(xì)胞對MHCC97H細(xì)胞的殺傷率從 40.8% 提高到 52.9% （圖2c）。試驗證明，二甲雙胍預(yù)處理γδT細(xì)胞增強(qiáng)了γδT細(xì)胞的細(xì)胞毒性，推測可能是由于激活了部分TEM型細(xì)胞所導(dǎo)致的。

（a）顯微鏡下γδT細(xì)胞體外擴(kuò)增5d的狀態(tài)；（b）最佳培養(yǎng)策略下CD3陽性細(xì)胞群中 γδT 細(xì)胞的純度；（c）流式細(xì)胞術(shù)檢測二甲雙胍對γST細(xì)胞體外擴(kuò)增純度的影響；（d）流式細(xì)胞術(shù)檢測二甲雙胍對γδT細(xì)胞的記憶表型分化的影響；（e）二甲雙胍對γδT細(xì)胞體外擴(kuò)增純度的影響的統(tǒng)計圖；（f）二甲雙胍對γδT細(xì)胞體外擴(kuò)增中央記憶細(xì)胞分化影響的統(tǒng)計圖； （g） 二甲雙胍對y8T細(xì)胞體外擴(kuò)增效應(yīng)記憶細(xì)胞分化影響的統(tǒng)計圖。 ^**Plt;0.01 ^**Plt;0.001 。

（a）Microscopic observation of the in vitro expansion status of γδT cellsafter 5d （b）Purityof γδT cells in the CD3-positive cell population under optimal culture conditions; （c）Flow cytometry analysis of the effect of metformin on the purity of γδT cells during in vitro expansion; （d） Flow cytometryanalysis of the effect of metformin on memory phenotype differentiation of γδT cells;（e） Statistical analysis of metformin's impact on the purity of γδT celsduringinvitroexpasio;（f）Statisticalchartoftheefectofmetformiontediferentiatioofentralmemorycelsdurngin vitro expansion of γδT cels;（g）Statisticalchartoftheeffectofmetformnonthediferentiationofeectormemorycellsduringinvitroexpansionof γδT cells. ^\"Plt;0.01 ^**Plt;0.001 ：

2.3二甲雙胍增強(qiáng)γδT細(xì)胞抗腫瘤因子的表達(dá)

為了研究二甲雙胍促進(jìn) γδT 細(xì)胞抗腫瘤相關(guān)機(jī)制，我們用二甲雙胍預(yù)處理 γδT 細(xì)胞后檢測其IFN- ?γ 的表達(dá)水平量。IFN-γ是γ8T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞殺傷性的一個重要標(biāo)志。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測γδT 細(xì)胞的IFN- ?γ 這項指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍處理后的 γδT 細(xì)胞 IFN-γ 的表達(dá)上調(diào)，從 22.5% 提高到 32.8% ，表明二甲雙胍可以提高IFN-γ的表達(dá)（圖3a、3c）。與MHCC97H細(xì)胞共培養(yǎng)后，二甲雙胍預(yù)處理的γ8T細(xì)胞的IFN- ?γ 的表達(dá)水平進(jìn)一步提高至 83.4% （圖3b＼～3c）。隨后，通過RT-qPCR技術(shù)驗證 γδT 細(xì)胞中發(fā)揮腫瘤殺傷作用的相關(guān)細(xì)胞因子GZMB、perforin的mRNA表達(dá)水平變化，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以提升GZMB、perforin的mRNA表達(dá)水平（圖3d）。接著，取γδT細(xì)胞和經(jīng)二甲雙胍處理72h 的γ8T細(xì)胞的上清，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測分析，二甲雙胍的處理會增加γδT細(xì)胞的TNF- ??a 的分泌（圖3e）。進(jìn)一步，我們使用超速離心法提取γδT 細(xì)胞的外泌體。外泌體提取后需要進(jìn)行表征，在透射電鏡下通過負(fù)染直接觀察外泌體形態(tài)結(jié)構(gòu)，提取物為茶杯狀形態(tài)的小囊泡，說明外泌體提取純度較高（圖3f）。通過蛋白質(zhì)印跡檢測外泌體的標(biāo)志蛋白CD63和CD9相對表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過二甲雙胍處理 12h 以后的γ8T細(xì)胞分泌的外泌體量顯著升高（圖3g、3h）。為了研究外泌體是否能在體外發(fā)揮抗腫瘤作用，我們將經(jīng)過和未經(jīng)過二甲雙胍處理的γ8T細(xì)胞外泌體分別與MHCC97H細(xì)胞共培養(yǎng) 12h ，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過二甲雙胍處理以后外泌體的殺傷力顯著提高（圖3i）。這些結(jié)果表明，二甲雙胍可以增強(qiáng)γ8T細(xì)胞分泌發(fā)揮腫瘤殺傷作用的相關(guān)細(xì)胞因子的能力，從而提高γ8T細(xì)胞對抗腫瘤的作用。

（a）流式細(xì)胞術(shù)檢測二甲雙胍對y8T細(xì)胞表達(dá)抗腫瘤因子IFN-γ的影響；（b）流式細(xì)胞術(shù)檢測γ8T細(xì)胞與MHCC97H細(xì)胞共培養(yǎng)對抗腫瘤因子IFN-γ表達(dá)的影響；（c）二甲雙胍和MHCC97H細(xì)胞對γ8T細(xì)胞表達(dá)抗腫瘤因子 IFN_-γ 的影響統(tǒng)計圖；（d）RT-qPCR檢測二甲雙胍處理對γδT細(xì)胞GZMB、perforin表達(dá)量的影響（ n=4 ；（e）酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測二甲雙胍處理對γST細(xì)胞TNF- σ_?a 表達(dá)的影響 （n=4） ；（f）透射電鏡觀察外泌體形態(tài)； （g） 蛋白質(zhì)印跡檢測外泌體的標(biāo)志蛋白CD63和CD9相對表達(dá)量； η（h） 蛋白質(zhì)印跡檢測外泌體的標(biāo)志蛋白CD63和CD9相對表達(dá)量統(tǒng)計圖 （n=3 ）；（i）經(jīng)過和未經(jīng)過二甲雙胍處理后 γδT 細(xì)胞的外泌體與MHCC97H細(xì)胞共培養(yǎng) 12h ，檢測細(xì)胞存活率 （n=4） 。 ^*Plt;0.05 ^**Plt;0.01 ^**Plt;0.001， 。

（a）Flow cytometric analysis of metformin’s effect on IFN-γ production in γδT cells;（b）Flow cytometric evaluation of IFN-γ expression in γδT cells co-cultured withMHCC97Hcels;（c）QuantitativeanalysisofcombinedefectsofmetforinandMHCC97HcellsonIN-exprssioin γδT cells; （d） RT-qPCR assessment of GZMB and perforin expression in metformin-treated γδTcells （n=4） ； （e）ELISA-based detection of TNF- ??a secretion bymetformin-treated γδT cells （n=4） ;（f）Observationof extracellular vesicle morphologyusing transmission electron microscopy;（g）Western blot analysisofrelatieexpevesofexoalkpesd;QatiiealysofCepress Western blot （n=3） ; （i）CellviabilityofMHCC97Hcelsafter12hco-culture with exosomes derived from metformin-treatedoruntreated γδT cells （n=4） ?_Plt;0.05 ^*Plt;0.01 ^**Plt;0.001 ，

3 討論

盡管基于 aβββ 細(xì)胞的免疫療法革新了部分癌癥的治療模式[32-33]，但臨床數(shù)據(jù)顯示，有 50% 的實體瘤患者因惡性腫瘤固有的檢查點抑制劑耐藥機(jī)制，仍表現(xiàn)出對現(xiàn)有免疫治療方案的臨床應(yīng)答率低下[34-35]。個性化治療嵌合抗原受體（chimeric antigenreceptor，CAR）-T細(xì)胞療法在癌癥治療領(lǐng)域引起了人們的興趣[36]。其工作原理是修飾患者的T細(xì)胞，使其在表面表達(dá)CAR蛋白，從而誘導(dǎo)它們識別和破壞癌細(xì)胞[37]。CAR-T細(xì)胞療法在治療血液腫瘤方面取得了一些成功，但它在治療實體瘤方面仍面臨許多挑戰(zhàn)，如抗原選擇、耐受性和安全性[38]。此外，CAR-T細(xì)胞療法的嚴(yán)重急性不良反應(yīng)也讓人們放慢了腳步去開發(fā)這種昂貴的治療方法[39]。令人欣喜的是，生物學(xué)研究表明， γδT 細(xì)胞是一種更適合用作免疫治療的細(xì)胞。與傳統(tǒng)的αβT細(xì)胞相比，γδT細(xì)胞的優(yōu)勢在于它們不依賴MHCI類介導(dǎo)的抗原呈遞，這使其可用于MHCI缺失的腫瘤治療[40]，并且更適用于同種異體細(xì)胞治療。此外， γδT 細(xì)胞的抗腫瘤功能不依賴于體細(xì)胞突變負(fù)荷，因此在比黑色素瘤或肺癌等突變程度低得多的癌癥中仍能發(fā)揮有效作用[41]。另一方面，γδT細(xì)胞相比NK細(xì)胞也具有優(yōu)勢，如其更強(qiáng)的腫瘤浸潤能力以及關(guān)鍵抑制分子（如殺傷抑制受體）的低表達(dá)，而這些抑制分子會干擾NK細(xì)胞的激活[42]。事實上， γδT 細(xì)胞可被視為結(jié)合了“兩全其美”的特性，即同時具備αβT細(xì)胞和NK細(xì)胞的抗腫瘤能力，能夠同時利用TCR和NK細(xì)胞受體，從而增強(qiáng)對癌癥的靶向作用及廣度[43]。

為了更進(jìn)一步探索γ8T細(xì)胞在細(xì)胞治療方向的應(yīng)用，我們急需一種能高效體外誘導(dǎo)具有抗腫瘤活力的γδT細(xì)胞的方法。IL-2和Zol是最常見的用于對PBMC刺激選擇性擴(kuò)增 $＼mathrm { v } _ { ＼ ? } ＼mathrm { v } _ { ? } 9 ＼mathrm { v } _ { ? } ＼delta 2 ? ＼mathrm { T } ?$ 細(xì)胞的方案。Vγ9Vδ2T 細(xì)胞是細(xì)胞免疫治療中經(jīng)常使用的亞型，表現(xiàn)出釋放穿孔素、顆粒酶和其他溶解細(xì)胞因子的能力，同時還分泌IFN-γ 和 TNF- ?a^[44-45] 。此外，它們間接調(diào)節(jié)NK細(xì)胞、B細(xì)胞、 CD4⁺ CD8⁺ 和其他免疫細(xì)胞群的活性，從而有效消除腫瘤[46-47]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)IL-2、IL-15和Zo1共刺激 γδT 細(xì)胞可縮短獲得較高純度和記憶性γδT細(xì)胞的時間，擴(kuò)增效率最高可達(dá)10000倍。IL-2和IL-15在調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫（促進(jìn)T細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞毒性）和先天免疫（激活自然殺傷細(xì)胞）方面具有許多相似的功能[48]。不同的是，IL-15主要負(fù)責(zé)維持長期的、高親和力的T細(xì)胞應(yīng)答，而IL-2具有的功能是活化T細(xì)胞，促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化以及活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[49-50]。Zol可抑制甲羥戊酸途徑限速酶法尼基焦磷酸合成酶（farnesyl pyrophosphate synthase，F(xiàn)PP）發(fā)揮作用，會導(dǎo)致FPP上游代謝物IPP濃度增加，γδT細(xì)胞識別IPP后，將激活γδT細(xì)胞的增殖[51]。同時我們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過二甲雙胍處理后， γδT 細(xì)胞純度得到了進(jìn)一步的提高，從而促進(jìn)了記憶型γδT細(xì)胞的分化，并且會激活γ8T細(xì)胞的細(xì)胞毒性。通過試驗我們驗證了二甲雙胍預(yù)處理γδT細(xì)胞會增加IFN-γ、GZMB和perforin的表達(dá)，同時促進(jìn)γ8T細(xì)胞分泌更多的外泌體，增加了 γδT 細(xì)胞對腫瘤的殺傷力。雖然初步證據(jù)表明，二甲雙胍對γ8T細(xì)胞具有調(diào)節(jié)作用，但這種免疫調(diào)節(jié)作用的分子途徑需要進(jìn)一步的試驗探索。

總之，上述研究證明了在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)γδT細(xì)胞時，二甲雙胍有促進(jìn)γ8T細(xì)胞富集和激活其抗腫瘤的新作用。本研究對過繼免疫治療時γ8T細(xì)胞的體外擴(kuò)增和功能增強(qiáng)及持續(xù)殺傷作用和外泌體免疫治療策略提供了新思路，具有重要的科研價值與臨床應(yīng)用前景。

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