紅曲霉液態發酵過程中桔霉素的動態監測

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2025.05.003

中圖分類號：TS207.4 文獻標志碼：A 文章編號：1000-9973（2025）05-0015-05

Dynamic Monitoring of Citrinin During Liquid Fermentation of Monascus

WANG Xuan， SHI Xin-yun， CHEN Xin，WANG Wei-ping （School of Life and Health Sciences，Hubei University of Technology，Wuhan 43O068，China）

Abstract： Citrinin is the most common mycotoxin produced by Penicillium and Aspergillus ， which is usually found in Monascus products. At present，various methods have been developed for the detection of citrinin，but most of these methods require expensive equipment and professional operation，resulting in high costs. In this study，in order to detect citrinin more conveniently and accurately，the bacteriostatic activity of citrinin is utilized to monitor citrinin dynamically during fermentation by the inhibition zone method and to test the bacteriostatic activity of Monascus red pigment. The experimental results show that the change trend of the inhibition zone diameter of citrinin is basically consistent with the results detetermined by HPLC，and the inhibition zone method could be used to accurately monitor the citrinin production during the fermentation of Monascus. The Monascus red pigment does not show resistance to Bacillus subtilis in the concentration range of 25～400U/mL ，and the interference of Monascus red pigment on the accuracy of citrinin determination by the inhibition zone method can be excluded. Compared with HPLC，the inhibition zone method is simpler for determining citrinin. The linear correlation coeficient between the inhibition zone diameter and the content of citrinin is O.975，indicating a higher linear fiting degre and accurate detection of citrinin content，which has provided a simple method for the industrial detection of citrinin content.

Key words：Monascus；liquid fermentation；citrinin；inhibition zone

紅曲制品常被用作食品添加劑，得益于其所產生的有益次級代謝物在食品或飲品中的廣泛使用 [1-2] 0紅曲色素作為天然色素，可以通過固態或液態發酵獲得，具有較高的營養價值。現代藥理學研究已經證實，紅曲色素具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化等多種生物活性，這些活性使得紅曲色素在食品、醫藥和化妝品等領域具有廣闊的應用前景[3]。但是在紅曲霉發酵過程中可能會產生桔霉素（CIT），這是一種對人體和環境有害的物質[4-5]。桔霉素由青霉和曲霉誘發產生，廣泛存在于飼料、谷物和水果等產品中[6]。桔霉素被確認為紅曲霉次級代謝產物后，其對人體健康的潛在危害引起了國際社會的廣泛關注。因此，多個國家對紅曲制品中的桔霉素含量實施了嚴格的控制標準，這對紅曲產業的持續發展造成了顯著的沖擊。2019年，歐盟對CIT含量的規定限值從 2 000μg/kg 降至 100μg/kg^[7] 。

目前已經開發了多種用于桔霉素檢測的方法，氣相色譜法和高效液相色譜法被廣泛使用和研究[8]，使用先進的LC-MS/MS法進行高靈敏度和低檢測限的多霉菌毒素檢測已成為目前研究的主流趨勢。LC-MS/MS檢測方法快速且靈敏，但由于其分析和維護成本高，并未在桔霉素的檢測中廣泛使用[9]。因此， Sun 等[10]開發了一種簡單便捷的熒光分光光度法來檢測紅曲米中的桔霉素，在 330nm 激發后在 485nm 發射波長下測量甲醇 （pH1.5） 中的桔霉素天然熒光，該方法對實驗器材要求簡單，但是樣品的處理較復雜，前處理時間長，影響因素多，可能會對桔霉素造成損耗且難以對活菌株或鮮樣直接檢測，不適合應用于發酵過程中鮮樣桔霉素含量的測定。Wang等[1]利用抑菌圈法篩選紫外誘變低產桔霉素的紅曲霉菌株，證實了采用抑菌圈法檢測桔霉素具有高靈敏性。實驗室在之前的研究中初步建立了一種利用抑菌圈法檢測桔霉素的方法[12]。在本研究中，使用抑菌圈法對紅曲霉發酵紅曲紅色素過程中的桔霉素含量變化進行動態監測，并且測試不同濃度的標準品紅曲紅色素的抗菌活性。

1材料與方法

1. 1 材料與試劑

1. 1.1 供試菌種

紅曲霉菌GN01、枯草芽孢桿菌01：由發酵工程教育部重點實驗室保藏。

1.1.2實驗試劑與材料

可溶性淀粉、蛋白脈、硝酸鈉、七水硫酸鎂、磷酸二氫鉀、葡萄糖、瓊脂粉、乳酸、牛肉浸膏、無水乙醇、乙睛、磷酸（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；超純水：實驗室自制；馬鈴薯：市售；紅曲紅色素粉末：廣東科隆生物科技有限公司。

1.1. 3 培養基

紅曲霉保藏培養基： 60g/L 葡萄糖， 20g/L 蛋白陳， 30g/L 可溶性淀粉， 30g/L 瓊脂。

紅曲種子液培養基： 20g/L 葡萄糖， 10g/L 蛋白陳， 3g/L （20 NaNO₃ ， 1g/L （204 MgSO₄ ， 1.5g/L （204 KH₂PO₄ ，取 200mL 種子液置于 500mL 錐形瓶中，于 115^°C 下滅菌 30min 。

紅曲霉液態發酵培養基： 30g/L 可溶性淀粉， 15g/L 蛋白脈 ，2g/LNaNO₃，0.5g/LMgSO₄，1.5g/LKH₂PO₄ 用自來水溶解， 250mL 錐形瓶中裝取 100mL 培養基，于 121^°C 下滅菌 20min 。

細胞保藏培養基： 3g/L 牛肉膏， 10g/L 蛋白肺， 瓊脂，調節 ΔpH 至7.0，于 121^°C 下滅菌 20min 。

1.1. 4 儀器與設備

722S可見分光光度計、AR114電子天平 上海精密科學儀器有限公司；TGL-16C臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；DNP-9052電熱恒溫培養箱上海精宏實驗設備有限公司；ZHWY-2102C恒溫搖床上海智誠分析儀制造有限公司；CJ-2D潔凈工作臺天津市泰斯特儀器有限公司；YM50L電熱壓力蒸汽滅菌鍋上海三申醫療器械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1紅曲霉的發酵與取樣

將紅曲霉接種于配制好的滅菌固體斜面培養基中，在 恒溫避光條件下進行活化培養，將長滿菌落的固體斜面接種到液體種子培養基中，在 30^°C 避光條件下，置于轉速為 180r/min 的恒溫培養箱中培養2d至紅曲霉對數生長期，然后將紅曲霉種子液接種到液體發酵培養基中進行發酵培養，接種量為 10% （體積比）。培養條件為 ，在培養過程中分別在 0，24，48，72，96，120，144，168h 取樣，檢測紅曲紅色素色價、桔霉素含量。

1.2.2發酵液樣品中桔霉素的萃取

吸取 5mL 分布均勻的發酵液置于 100mL 錐形瓶中，在 60°.200Δr/min 的條件下使用無水乙醇對樣品進行萃取，振蕩萃取 ^1h 后，以 13000r/min 離心10min ，然后取出上層清液。采用 0.22μm 濾膜進行過濾，得到的濾液即為檢測的桔霉素樣品溶液。

1.2.3樣品中桔霉素的檢測

桔霉素采用高效液相色譜法檢測[13]，檢測條件：色 譜柱：ZORBAXEclipse XDB-C₁₈ ；檢測器：熒光檢測器， 檢測波長為 λ_ex=331nm，λ_em=500nm ；柱溫： ；流

動相：乙腈：水 （pH2.5） 為 50：50 ；流速： 1mL/min ；進樣量：標準樣品和樣品均為 20μL 。

1.2.4樣品的抑菌圈直徑測定

將枯草芽孢桿菌接種于PDB搖瓶中， 培養24h 后，將等份（ 200μL） 枯草芽孢桿菌培養物均勻涂布在PDA板上。取 3～5 片濾紙片（將濾紙片裁剪成直徑為 6mm 的圓片并經過高溫滅菌），在1.2.2中制備的桔霉素樣品溶液中充分浸濕，取出后自然晾干，將濾紙片均勻固定放置在枯草芽孢桿菌平板上， 30^°C 培養1d后，待濾紙片周圍有透明圈出現，測量抑菌圈直徑11并與HPLC結果進行比較。

1.2.5 標準品紅曲紅色素的抗菌性

將標準品紅曲紅色素粉末按25，50，100，200，400U/mL濃度稀釋，取濾紙片按1.2.4中方法處理，檢測紅曲紅色素的抑菌圈產生情況。

全部實驗均平行3次，數據以平均值±標準差（SD）表示。采用Origin64軟件繪圖，采用SPSS18軟件分析數據。

2 結果與分析

2.1紅曲霉液態發酵結果

在發酵過程中桔霉素和紅曲紅色素的產生情況見圖1。

由圖1可知，發酵至第3天時紅曲紅色素產量開始迅速增加，桔霉素的含量也隨著紅曲紅色素產量的增加而增加。桔霉素和紅曲紅色素的碳骨架源自聚酮化合物和脂肪酸生物合成途徑，這些生物合成途徑利用共同的前體物質乙酰輔酶A和丙二酰輔酶 A^[14-15] 這些常見的前體物質通過克萊森縮合反應和單獨的途徑將特異性聚酮合酶（PKS）轉化為五酮化合物（CIT）或六酮化合物（MPs）前體，CIT和MPs的生物合成由單獨的基因簇（BGC）中編碼的酶催化，這些酶由不同的簇特異性調節因子控制[16]。因此，桔霉素與紅曲紅色素的產生保持一致性，且增加色素產量的優化手段通常會使桔霉素含量增加[17]。

2.2桔霉素的HPLC檢測結果

高效液相色譜法檢測的結果見圖2。

注：從上到下依次表示標準樣品及發酵時間為0，1，2，3，4，5，6，7d的圖譜。

由桔霉素標準樣品的液相色譜圖可知，桔霉素在7.5min 左右出現最大吸收峰。

由液相色譜圖的吸收峰面積可以清楚地看到隨著發酵時間的增加，桔霉素含量不斷增加。CIT產量和濃度的變化可能是由發酵過程中不同的外在因素造成的，影響CIT水平的因素包括紅曲霉種類和分離物、氨基酸、微量元素、碳源和氮源、營養因素、氮碳濃度比、pH、水分含量、光、氧、溫度和環境[18]。動態監測不同培養條件下桔霉素的產生情況可以為影響因子提供有力證據。根據桔霉素的標準曲線可以計算出上述樣品中的桔霉素含量。

2.3桔霉素的抑菌效果

注：a、b、c、d、e、f、g、h分別表示發酵時間為0，1，2，3，4，5，6，7d 0

Wong等[19]研究指出，枯草芽孢桿菌的活性會受到紅曲霉產生的抗菌活性物質的抑制，并在菌株菌落周圍形成抑制區，抑制區越大，抗菌活性越高。Blanc等[20]研究發現，桔霉素對枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、乳酸鏈球菌和熒光假單胞菌具有抗菌活性，并且以枯草芽孢桿菌作為指示微生物來評估其抑制活性；抑菌圈直徑與抗生素劑量（pg）的對數值成正比。在涂布有枯草芽孢桿菌平板上的濾紙片周圍出現透明圈，隨著發酵時間的增加，透明圈直徑逐漸增加，說明抑菌物質在不斷增加。

2.4標準品紅曲紅色素的抑菌效果

桔霉素在紅曲霉的發酵過程中產生，有報道稱，橙色素紅曲紅色素和紅斑素對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、一些絲狀真菌和酵母具有抗菌活性，而紅色素紅曲紅胺和紅斑胺幾乎沒有抗菌活性[21]。本文研究了紅曲霉在液態發酵紅曲紅色素過程中對桔霉素的動態監測，考慮到紅曲紅色素可能會對桔霉素的抑菌性產生影響，通過驗證實驗，用所購買的不含有桔霉素的標準品紅曲紅色素進行抑菌圈實驗，用不同濃度的色素溶液浸泡濾紙片，貼在涂布有枯草芽孢桿菌的平板上，觀察透明圈的產生情況。實驗結果表明，濃度為 25～400U/mL 的紅曲紅色素溶液在涂布有枯草芽孢桿菌的平板上未產生透明圈（見圖4），表明紅曲紅色素對枯草芽孢桿菌沒有抗菌活性。本實驗中可以排除紅曲紅色素對產品抑菌性的干擾，故產生抑菌效果的物質是桔霉素。

2.5桔霉素含量與抑菌圈大小的關系

Fig.5Linear fitting diagram between inhibition zonediameter andcitrinin content（A），relationshipdiagram between citrinin accumulation amount and inhibition zone diameter （B）

利用抑菌圈法對發酵過程中桔霉素含量的變化進行監測，該方法較其他方法簡單易行，可以快速實時檢測發酵過程中桔霉素含量的變化，以枯草芽孢桿菌作為指示菌，觀察抑菌圈直徑，考察紅曲霉產桔霉素的含量。由圖5中B可知，隨著桔霉素含量的升高，抑菌圈直徑也隨之增大，抑菌圈直徑與桔霉素含量呈正相關。在發酵至 24h 時，平板上開始出現透明圈，此時桔霉素含量為 0.56mg/L ，隨著發酵時間的增加，桔霉素含量也逐漸增加，發酵4d后桔霉素含量線性增加，當抑菌圈直徑為 1.05cm 時，桔霉素含量達到 3.679mg/L 通過數據計算，抑菌圈直徑與桔霉素含量的對應關系見圖5中A，線性回歸方程為 y=8.607 67x-5.105 89. 相關系數 R²=0.975 ，表明桔霉素含量在 0.56～3.679mg/L 范圍內呈良好的線性關系，符合比爾定律。

在測定抑菌圈直徑的同時，利用抑菌圈法動態監測桔霉素含量，抑菌圈有一個最小的檢出量，即桔霉素含量為 0.0194mg/L 以下時，沒有抑菌圈出現。所以利用該方法在發酵過程中動態監測桔霉素含量的變化時，桔霉素含量應在檢出限以上才能有效檢出。

3結論

在紅曲霉液態發酵紅曲紅色素的發酵周期內，對紅曲紅色素色價和桔霉素的產生情況進行檢測，結果發現桔霉素伴隨著紅曲紅色素的產生而產生，桔霉素和紅曲紅色素的合成來源于同一個碳骨架，共享一個前體物質的合成途徑，因此在紅曲紅色素制品的生產過程中，對桔霉素的檢測尤為重要。采用抑菌圈法和HPLC兩種方法檢測紅曲霉液態發酵過程中桔霉素的變化情況并進行對比，得出以下結論：抑菌圈法與桔霉素含量成正比，在發酵過程中，利用抑菌圈法檢測桔霉素含量具有較高的準確性，桔霉素含量越高，抑菌圈直徑越大，檢出限為0.0194mg/L 針對紅曲紅色素發酵過程中桔霉素含量的監測，通過標準品紅曲紅色素的抑菌圈實驗可以排除紅曲紅色素對抑菌圈法的干擾。相較于其他方法，抑菌圈法方便快捷，對樣品的要求低，應用場景靈活，且結果的擬合度較高，對設備條件和人員技術的要求較低，可以應用于企業在生產紅曲相關制品的過程中對桔霉素產生情況的初步監測和大量篩選，能夠有效節約成本與耗材，有助于產品的質量控制與分析。

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