響應面法優化石斑魚骨酶解工藝及酶解產物的抗氧化活性研究

中圖分類號：TS201.2 文獻標志碼：A 文章編號：1000-9973（2025）05-0075-07

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2025.05.011

Optimization of Enzymatic Hydrolysis Process of Grouper Bones by Response Surface Methodology and Study on Antioxidant Activity of Enzymatic Hydrolysates

LIU Mei-jiao1，LI Zhu-yi1，CHEN Qiu-han1，YANG Xue-bo1，LIU Shou-chun ^1，2 * ZHONG Sai-yi1，HONG Peng-zhi1’2， ZHU Chun-hua3，CHEN Kang-jian4 （1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety， Guangdong Provincial Engineering Technology Research Center of Seafood，Guangdong Provincial Engineering Technology Research Center of Aquatic Prepared Food Processing and Quality Control， College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524o88，China; 2. Southern Marine Science and Engineering Guangdong Provincial Laboratory （Zhanjiang）， Zhanjiang 524o25，China；3.College ofFisheries，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524o88，China;4.Guangdong Evergreen Group Co.，Ltd.，Zhanjiang 5240o0，China）

Abstract：Four kinds of proteases are used to enzymolize the grouper bone，and the optimal hydrolysis enzyme is screened with thecontent of polypeptides and soluble calcium as the indexes. The efects of enzyme addition amount，solid-liquid ratio and enzymatic hydrolysis time on the content of polypeptides and solublecalcium are investigated，and the enzymatic hydrolysis process is optimized by response surface methodology. The content of amino acids and the antioxidant activity of the enzymatic hydrolysates obtained under the optimal conditions are determined. The results show that the polypeptide content is 11.07mg/mL and the soluble calcium content is 80.49mg/L when enzymatic hydrolysis time is ，solid-liquid ratio is 1：6 and enzyme addition amount is 4 500U/g ， The essential amino acids in the enzymatic hydrolysates account for 35.87% of the total amino acids. The antioxidant activity of enzymatic hydrolysates increases with the increase of mass concentration，and the DPPH radical scavenging rate is 94.62% when the mass concentration is 5mg/mL ，which reaches the level of the same concentration of v_c ，indicating that they have good antioxidant activity. In this study，a kind of enzymatic hydrolysate of grouper bone that is rich in polypeptides and soluble calcium and has antioxidant activity is prepared，which has provided a certain theoretical basis for the utilization of grouper bone resources.

Key words： grouper bone;enzymatic hydrolysis； ploypeptide； soluble calcium;antioxidant activity

石斑魚屬鱸形目鮨科，營養價值高、味道鮮美，是一種低脂肪、高蛋白、富含多種不飽和脂肪酸的上等食用魚[1]。近年來，石斑魚養殖產量激增，2021年已達到20萬噸。隨著市場上對石斑魚需求量的增大，魚片、魚糜等加工產品也在不斷增多，同時產生大量的副產物，其中近 25% 是魚骨[2]。關于石斑魚肉和魚皮用來開發蛋白多肽的研究已有報道[3-4]，但是關于石斑魚骨加工利用的研究報道極少。魚骨中含有豐富的膠原多肽和礦物質，具有生產抗氧化肽、ACE抑制肽[5]和生物活性鈣的潛力，是一種天然活性物質開發的良好來源。魚骨膠原具有由2個 α∝1 鏈和1個 α2 鏈組成的I型膠原的特性，魚骨中的膠原蛋白被歸類為I型膠原蛋白，其中含有大量的氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸。同時，魚骨中鈣含量豐富， Ca²⁺ 溶出有助于提高多肽的抗氧化活性[8]。范秀萍等[9]通過生物酶解法制備石斑魚頭酶解產物，發現其在分子質量 時具有較好的抗氧化活性。張蕾等[0]以河蜆為原料制備多肽螯合鈣，結果表明添加 Ca²⁺ 的多肽對DPPH自由基的清除能力提高。

本研究以石斑魚骨為原料，采用不同蛋白酶進行酶解，通過單因素試驗和響應面法優化得到最佳酶解工藝，并測定最佳工藝條件下得到的酶解產物的抗氧化活性，該研究結果為石斑魚的高值化利用和生物活性研究提供了理論參考。

1材料與方法

1. 1 原料與試劑

石斑魚：購于霞山水產品批發市場；中性蛋白酶（1×10⁵U/g） 、堿性蛋白酶 （2×10⁵U/g） ：河南萬邦實業有限公司；木瓜蛋白酶 （1×10⁵U/g） 、復配蛋白酶（3.5×10⁵U/g） ：南寧東恒華道生物科技有限責任公司；硫酸銅、酒石酸鉀鈉、Ca標準溶液 （1000μg/mL） 、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、水楊酸、抗壞血酸（ v_c ）等試劑：均為國產分析純。

1. 2 儀器與設備

800C多功能粉碎機永康市紅太陽機電有限公司；ThermoLYNX6OOO高速落地式離心機美國賽默飛世爾科技公司；HH-8數顯恒溫水浴鍋常州鴻澤實驗科技有限公司;PHS-3CpH計上海雷磁儀器廠；TAS-990火焰原子吸收分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司；FD8508真空冷凍干燥機韓國ILSHIN公司。

1. 3 試驗方法

1.3.1石斑魚骨粉制備和酶解工藝

新鮮石斑魚 $$ 采肉 $$ 高壓蒸煮 （121°C，0.1MPa） 洗凈殘肉 $$ 烘干 $$ 粉碎 ? 過60自篩 $$ 石斑魚骨粉 $$ 根據料液比加水 $$ 調節 根據加酶量加入蛋白酶 $$ 設定溫度和時間水浴酶解 $$ 滅酶（沸水浴，10min） 離心 （5000r/min，20min） 冷凍干燥上清液 $$ 石斑魚骨酶解產物。

1.3.2 多肽含量測定

采用雙縮脲法[1]進行測定。向離心管中加人 5mL 樣液、 .5mL 三氯乙酸（ 10% ），搖勻后靜置 10min ，離心取上清液，加入4倍體積的雙縮脲試劑，搖勻靜置10min 后測定 OD_540nm ，根據蛋白標準曲線計算樣品溶液中的多肽含量。

1.3.3 可溶性鈣含量測定

可溶性鈣含量參照GB5009.92—2016《食品安全國家標準食品中鈣的測定》中火焰原子吸收光譜法測定。

1.3.4 蛋白酶篩選

選取4種蛋白酶，根據各自的適宜溫度和pH（中性蛋白酶和木瓜蛋白酶： 50°C ， pH7.0 ；堿性蛋白酶：60^°C，pH8.0 ；復配蛋白酶： 55°C . pH8.5AA ，各種酶的添加量均為 6000U/g ，對石斑魚骨粉進行酶解， 3h 后準時取出滅酶，冷卻后離心 （5000r/min，15min） .測定上清液中多肽和可溶性鈣的含量。

1.3.5酶解單因素試驗

對酶解工藝條件進行單因素試驗優化，設置基本條件為酶解時間 ^3h 、加酶量 6000U/g 、料液比 1：6 。改變其中一個條件，固定其他條件不變。各因素水平設計為酶解時間 （2，3，4，5，6h） 、料液比 （1：4.1：5 F1：6.1：7.1：8） 、加酶量 （4000，5000，6000，7000 8000U/g? ，分析各單因素對多肽含量和可溶性鈣含量的影響。

1.3.6 響應面優化工藝

根據單因素試驗結果，設計響應面優化試驗，以多肽含量和可溶性鈣含量為響應值，響應面試驗因素水平見表1。

表1響應面試驗因素水平

1.3.7 氨基酸組成分析

參考GB5009.124—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸的測定》中的方法測定酶解產物中氨基酸組成。

1.3.8 抗氧化活性測定

1.3.8.1DPPH自由基清除率測定

根據Luo等[12]的方法并稍作修改，將酶解產物配制成不同濃度的樣液，將等體積的樣液與DPPH-乙醇溶液 （0.1mmol/L） 混合，避光靜置 30min ，在 517nm 處測定OD值 （A₁ ），同時以無水乙醇代替DPPH-乙醇溶液測定OD值 （A₂） ，以蒸餾水代替樣液測定OD值 （A₀） L以 5mg/mL 的 v_c 溶液作對比。DPPH自由基清除率計算公式如下：

DPPH自由基清除率 中

1.3.8.2羥基自由基清除率測定

參照曹曉霞等[13]的方法，吸取 FeSO₄ （2 mmol/L）、H₂O₂（1mmol/L） 和水楊酸 （6mmol/L） 溶液各 3mL 混勻， 37^°C 水浴 15min ，在 510nm 處測定OD值 （A₀） ），隨后加入 1mL 樣液， 水浴 15min ，在 510nm 處測定OD值 （A₁） ），同時以蒸餾水代替 H₂O₂ 溶液測定OD值 （A₂ ），以 5mg/mL 的 v_c 溶液作對比。羥基自由基清除率計算公式如下：

羥基自由基清除率

1.3.8.3超氧陰離子自由基清除率測定

根據 Pan 等[14]的方法并稍作修改，吸取Tris-HCl緩沖液 （pH8.2，50mmol/L）5mL 于試管中， 25°C 水浴20min ，再加入樣液和焦性沒食子酸溶液（25mmol/L）各0.5mL，25PC 水浴 5min ，最后加入鹽酸溶液 （8mol/L） 1mL 終止反應，測定 299nm 處的OD值 （A₁ ），同時以蒸餾水代替樣液測定OD值 （A₀） ，以 5mg/mL 的 v_c 溶液作對比。超氧陰離子自由基清除率計算公式如下：

超氧陰離子自由基清除率 0

1.3.8.4 總還原力測定

參照Chan等[5]的方法，吸取樣液 0.2mL 、磷酸緩沖溶液 （0.2mol/L，pH 6.6） 和鐵氰化鉀溶液 （1% ）各 0.5mL 于試管中，混勻， 50^°C 水浴 20min ，再加人三氯乙酸溶液 （10%）0.5mL ，混勻，離心 （3500r/min 10min） ，吸取等體積上清液與蒸餾水，加入 0.1mL 三氯化鐵溶液 （0.1%） ，靜置 2min ，測定 700nm 處的OD值，同時以蒸餾水代替樣液作為空白對照，以 5mg/mL 的v_c 溶液作對比。

1.4數據處理

通過Design-ExpertV8.O.6.1軟件設計響應面試驗，采用Origin2024繪圖。每個試驗重復3次，顯著性水平為 Plt;0.05 。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶篩選

注：相同小寫字母表示差異不顯著（ ?Pgt;0.05） ，不同小寫字母表示差異顯著 ?Plt;0.05） ，下圖同。

由圖1可知，復配蛋白酶的多肽含量顯著高于中性蛋白酶和木瓜蛋白酶（ Plt;0.05; ，與堿性蛋白酶無顯著性差異（ Pgt;0.05 ，復配蛋白酶的可溶性鈣含量顯著高于其他3種蛋白酶 ?Plt;0. 05 。復配蛋白酶由不同的酶組成，可切斷蛋白質不同的肽鏈，從而得到更多的多肽和氨基酸[15]。綜合考慮，選用復配蛋白酶作為最佳水解酶。

2.2 單因素試驗

2.2.1酶解時間對多肽含量和可溶性鈣含量的影響

由圖2可知，酶解時間在 2～3h 時，多肽含量和可溶性鈣含量升高，均在 3h 時達到最高值，隨后可溶性鈣含量變化平緩，而多肽含量在 ⁴h 后顯著下降 （Plt;0.05） ，這是由于酶解時間延長，蛋白酶的水解度增大到一定程度，部分膠原多肽可能被降解成游離氨基酸，因此多肽含量隨酶解時間的增加而降低[16]。因此，選擇最適酶解時間為 3h 進行后續試驗。

由圖3可知，隨著料液比的升高，多肽含量和可溶性鈣含量整體呈先上升后下降的趨勢，且均在 1：7 時達到最高值，之后開始下降，說明添加適量的水可以促進酶解反應，料液比過低導致反應體系中酶濃度過高，抑制酶解反應，而料液比過高會使酶濃度過低，降低酶解反應速率，與郭耀華等[7]的研究結果一致。因此，選擇最適料液比為 1：7 進行后續試驗。

由圖4可知，隨著加酶量的增加，多肽含量和可溶性鈣含量均呈現先升高后降低的趨勢，在 4000～5000U/g 范圍內迅速升高，在 5 000U/g 時達到最高值。加酶量的增加可以使水解強度增加，但加酶量達到一定值時，與底物的反應達到飽和，導致酶自身相互水解，使酶解效果下降[18]。另外，加酶量過高會導致蛋白過度水解，使多肽繼續水解成游離氨基酸，多肽含量在加酶量 gt;5000U/g 后顯著下降（ Plt;0.05; 。因此，選擇最適加酶量為 5000U/g 進行后續試驗。

2.3 響應面試驗

根據單因素試驗結果，運用Box-Behnken中心組合設計，以酶解液中多肽含量和可溶性鈣含量為響應值，設計17組響應面優化試驗方案，結果見表2。

將試驗中各響應值輸入，通過響應面軟件進行回歸擬合分析，得到酶解液中多肽含量 （Y₁ ）和可溶性鈣含量 （Y₂ ）的回歸方程：

Y₁=7.80+0.65A-1.91B-0.39C+0.060AB- 0 .59AC+0.008197BC+1.10A²+0.43B²-0.66C² Y₂=69.93+12.61A-0.026B-3.26C-7.42AB- 4.62AC+0.97BC-14.10A²-5.49B²-10.85C²

由表3中 Y₁ 回歸方程的方差分析可知，回歸模型的 P=0.000 1 ，模型極顯著，失擬項的 P=0.928 9gt; 0.05，失擬項不顯著， R²=0.971 0 ；由表4中 Y₂ 回歸方程的方差分析可知，回歸模型的 Plt;0. 000 1 ，模型極顯著，失擬項的 P=0.0756gt;0.05 ，失擬項不顯著，R²=0.9855 。方差分析結果表明兩個模型與試驗結果的擬合較好，試驗結果可靠，能夠反映出3個因素與多肽含量和可溶性鈣含量的關系，可用來預測酶解石斑魚骨粉的多肽含量和可溶性鈣含量變化。由表3可知，一次項 A，B 和二次項 A² 對多肽含量的影響均極顯著 （Plt;0.01） ，一次項 c 、交互項 AC 和二次項 C² 對多肽含量的影響均顯著 （Plt;0.05） ，其他項的影響均不顯著 （Pgt;0.05） 。由表4可知，一次項 A，C ，交互項 AB 、AC 和二次項 A²，B²，C² 對可溶性鈣含量的影響均極顯著 （Plt;0.01） ，其他項的影響均不顯著 ?Pgt;0.05） 。

根據Box-Behnken試驗結果和回歸分析，以多肽含量和可溶性鈣含量為響應值得到的最佳酶解工藝參數為酶解時間 3.95h 、料液比 1：6.12 加酶量 4425.41U/g 此條件下多肽含量預測值為 11.69mg/mL ，可溶性鈣含量預測值為 72.47mg/L 。考慮到操作的可行性，將試驗條件定為酶解時間 ^4h 料液比 1：6 、加酶量 4500U/g ，以此工藝參數進行驗證試驗，得到多肽含量為 11.07mg/mL 可溶性鈣含量為 80.49mg/L。

2.4氨基酸組成分析

酶解產物的氨基酸組成見表5。

由表5可知，酶解產物的氨基酸種類齊全，必需氨基酸豐富，占總氨基酸的 35.87% 。其中，精氨酸含量（9.98mg/g） 最高，且組氨酸含量 （1.40mg/g） 、酪氨酸含量 （1.72mg/g） 、賴氨酸含量 （1.84mg/g） 也相對較高，疏水氨基酸（甘氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸）含量占總氨基酸的 30.25% ，可能對提高抗氧化活性有相關作用[19]。支鏈氨基酸（氨酸、異亮氨酸、亮氨酸）含量占總氨基酸的 21.01% ，具有促進合成代謝、減少運動性疲勞的作用[20]。結果表明，酶解產物中氨基酸種類齊全、含量豐富，有利于人體健康和提高抗氧化活性。

2.5 抗氧化活性測定

2.5.1 DPPH自由基清除率

DPPH溶解于乙醇中表現為深紫色，酶解產物的多肽或鈣離子可能會產生與DPPH自由基結合的質子，從而形成更穩定的分子，這反映在吸收率的降低上[21]。由圖5可知，隨著酶解產物質量濃度的升高，DPPH自由基清除率在 1～3mg/mL 范圍內顯著升高 ?Plt;0.05） ，在 3～5mg/mL 范圍內無顯著變化（ Pgt;0.05） 。當酶解產物質量濃度為 5mg/mL 時，DPPH自由基清除率達到 94.62% ，與相同濃度下 v_c 的DPPH自由基清除率無顯著性差異 （Pgt;0.05） ，此結果表明石斑魚骨酶解產物對DPPH自由基有較好的清除效果。蛋白質通過酶解產生較小分子的肽和氨基酸，表現出較好的DPPH自由基清除能力，與Escudero等[22]的研究結果一致。

頓反應產生，可引起膜脂、蛋白質、核酸的氧化損傷和油脂的酸敗[23]。由圖6可知，隨著酶解產物質量濃度的升高，羥基自由基清除率整體呈上升趨勢，在 5mg/mL 時羥基自由基清除率達到 49.69% ，低于同濃度下 v_c 的羥基自由基清除率（98. 43% ，說明酶解產物質量濃度的升高會增強羥基自由基的清除率，但是清除能力低于v_c ，與熊明澤等[24]的研究結果相似。

2.5.3超氧陰離子自由基清除率

超氧陰離子自由基（ O₂^- ·）可以促進氧化反應，產生過氧化氫和羥基自由基[25]。測定 O₂^- ·清除率是評價樣品抗氧化活性的方式之一。由圖7可知，酶解產物的 O₂^- ·清除率隨著酶解產物質量濃度的增加而升高，在 5mg/mL 時 O₂^- ·清除率為 24.31% ，而同濃度下Vc的O?·清除能力較弱，于智慧等[26]研究驢骨酶解液的抗氧化活性時也發現相同結果。

物質的抗氧化能力可以通過還原力進行判斷，抗氧化能力與還原力強度呈正相關[27]。由圖8可知，隨著酶解產物質量濃度的增加，酶解產物的總還原力升高，這可能與酶解產物中多肽和鈣的含量有關。同濃度 5mg/mL 下， v_c 的總還原力顯著高于酶解產物（ Plt;0.05） ，酶解產物的總還原力約為 v_c 的 50% ，與羥基自由基清除率結果一致。

3結論

本研究通過蛋白酶水解石斑魚骨，采用單因素試驗和響應面法優化得到最佳酶解工藝參數為酶解時間 料液比 1：6 、加酶量 4500U/g ，此條件下得到的多肽含量為 11.07mg/mL ，可溶性鈣含量為 80.49mg/L 說明蛋白酶對魚骨中多肽的水解效果較好。氨基酸組成分析表明酶解產物中含有豐富的氨基酸，其中必需氨基酸含量占總氨基酸的 35.87% ，且富含疏水氨基酸，與提高抗氧化活性相關。抗氧化活性隨著酶解產物質量濃度的增加而升高，與同濃度下的 v_c 相比，羥基自由基清除率和總還原力約為 v_c 的 50% ，超氧陰離子自由基清除率較低，DPPH自由基清除率可達到 94.62% ，說明石斑魚骨酶解產物具有較好的抗氧化活性，為石斑魚骨的綜合利用提供了一定的科學依據。

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