海水葉綠素a傳感器熒光性能評估方法

A standardized method for evaluating the fluorescence performance of

seawater chlorophyll-a sensors

WANG Aijun，WANG Cong， SHI Chaoying， ZHAO Hong （Technology Innovation Center for Marine Metrology and Instruments Test， MNR，National Center of Ocean Standards and Metrology，Tianjin ，China）

Abstract：Seawater chlorophyl-asensorsare essential tools for marineecological monitoring，enabling thedetectionof spatialand temporal variations inchlorophylla concentration.However，thesesensorsaresusceptible to measurement drift，whichcancompromisedatareliability.Thisstudyproposesametrologicalapproachforevaluating sensor performance using fluorescein sodiumasa reference standard.Sensor performance was assssed in terms of linear responserange，accuracy，precision，and stabityResults indicatedastrong positive corelationbetween fluorescence intensityandfluoresceinconcentration.Basedonthefittedcalibrationcurve，indicationerorand standarddeviation were calculated.The linearresponserange wasdeterminedbycontroling thecorrelationcoeficient，whereasstability was

assessed through repeated measurements over diffrent time periods.Within the linear range of 0 to 200μg/L ，the maximum measurement error was ?2.00μg/L ，and the relative standard deviation was lt;0.20% .The sensor exhibited consistentperformance from2021to2022.Maintaining consistent pipetingaccuracywasidentifiedasacriticalfactorfor ensuringmeasurement reliability.

Key words ： seawater chlorophyll-a senaor; fluorescence standard material； evaluation method； pipete accuracy

海洋中葉綠素a質量濃度及其時間變化可以反映海水中浮游植物的豐度及其變化規律，在一定程度上反映水體中藻類數量和水質狀況[1-2]，是海洋生態監測的常規監測項目之一，在研究浮游植物群落、海洋生態環境監測、赤潮防災減災等方面起著重要的作用。

目前海水葉綠素a的測定方法有遙感衛星法、分光光度法、高效液相色譜法、熒光法等，其中遙感衛星只適合大范圍、全天候監測;分光光度法和液相色譜法是基于現場采集、過濾水樣然后回實驗室進行測定，測試過程繁瑣、工作耗時長，需要有經驗的人員才能保障良好的數據和長期的一致性[3-4]，且數據不能連續。基于葉綠素a熒光誘導原理[的海水葉綠素a傳感器，具備實時、原位、連續測量、不需取樣等特點，對出現的特殊情況可即時做出判斷[3]，被廣泛地搭載在浮標、海洋調查船上[2.4]，但傳感器容易受到海洋環境的影響而產生漂移，有必要定期對傳感器進行性能評估[4]，以使熒光測量技術得到認可，并能支持沿海科學、綜合海洋觀測系統的長期發展。

林學舉等[5]采用威氏海鏈藻培養液可校準葉綠素a傳感器，但藻液培養存在時效性，不同藻液得到的系數不同，不適用于業務化校準;李祖華等[2]、林學舉等[5]比較葉綠素a傳感器測量結果和國標法[3測定結果，發現葉綠素a傳感器測量結果與國標法測量結果存在一定差異，因為傳感器測量的只是活體葉綠素，而國標法測量結果包含活體和死體兩部分，其次實際海水測量時，浮游植物群落組成、生理狀態、細胞形態、輻照度時間等均會影響熒光與葉綠素a質量濃度之間的關系[4]。ASTME2719-09《熒光儀器校準和鑒定標準指南》[6]指出利用系列熒光水溶液校準熒光傳感器檢測系統的特性。浮游植物體內葉綠素a的熒光測量是一種相對測量，無法提供直接確定葉綠素a的準確結果，本文利用熒光標準物質評估傳感器的熒光性能，涵蓋用戶關注的測量準確度、精密度、可靠性，建立了一套定期對葉綠素a傳感器進行評估的方法，有助于保障我國海水葉綠素a原位測量數據的準確性和可比性。

1 實驗部分

1.1 傳感器工作原理

海水葉綠素a傳感器的測量原理為將傳感器置于海水中，傳感器的光源發出 460nm 的光經過濾光片照射到海水中的浮游植物上，浮游植物的葉綠素a受到激發后發出 680nm 的熒光，發出的熒光被檢測器接收并產生熒光信號，熒光信號強度與葉綠素a的含量成正比，通過檢測熒光強度、進行數據擬合處理即可得到海水中葉綠素a的濃度[7-9]。因此本實驗利用熒光標準物質對海水葉綠素a傳感器的檢測器進行評估，進而實現傳感器的性能評估[0]，而不是基于葉綠素a熒光的生物學變化。

1.2 實驗儀器與方法

1.2.1 實驗儀器與耗材

海水葉綠素a傳感器：型號為FLNTURTD;

測試專用桶：直徑 12cm ，高 20cm ，內壁黑色;熒光標準物質;熒光素鈉標準樣品，純度 97.5% ，擴展不確定度 U=2% （包含因子 k=2 ）電子天平：測量范圍 0～100g 的電子天平，分度值 0.01mg，I 級；

棕色容量瓶：容量 1000…2000mL， A級；

移液管： 10，25，50，100mL，A 級；

電子天平、棕色容量瓶和移液管均需在檢定/校準有效期內。

1.2.2 實驗環境條件

由于熒光素鈉標準樣品在溫度高于 25^°C 時會加快其降解[10]，另外外界光源對熒光標準物質溶液有一定影響，因此在實驗室測試時確定環境條件為環境溫度（ 20±5）^°C 、相對濕度 20%～80% 、避光環境。

1.2.3 實驗方法

（1）熒光標準物質的選擇

EARP等[1]認為海水葉綠素a傳感器校準時所用的熒光標準物質應具備以下特性：（1）水溶性；（2）與海水葉綠素a傳感器具有相似的激發波長和吸收波長；（3）在一定條件下，其水溶液的熒光響應與熒光物質質量濃度是線性相關;（4）在一定溫度和光照下不容易降解;（5）經濟實惠，適用性。

選擇確定滿足上述5點要求的熒光標準物質后，利用電子天平稱量一定量的熒光標準物質，定容至容量瓶中，即得到熒光貯備液。

（2）響應線性范圍

在傳感器的量程范圍內，設定5個標準點，用熒光貯備液稀釋配制5個標準點的溶液，傳感器按照從小到大的順序測試該系列熒光溶液，用傳感器的熒光信號與系列熒光溶液的質量濃度值繪制標準曲線，得到線性方程和相關系數。

（3）準確度與精密度

在傳感器的量程范圍內，除響應線性范圍的標準點外，選取低、中、高3個質量濃度點配制系列溶液，將傳感器測量的熒光信號代人線性方程得到傳感器測量值，然后比較傳感器測量值和熒光溶液的質量濃度值，得到傳感器的示值誤差，以此來表征傳感器提供熒光數值準確與否的能力;重復測量低、中、高3個質量濃度的溶液各10次，以其相對標準偏差最大值來表征傳感器的精密度，即傳感器提供相近示值的能力。

（4）穩定性

同一臺傳感器在不同時期開展的重復性測量實驗，每次實驗的傳感器測量值和對應熒光溶液的標準值，按照公式（1）計算每次測量的傳感器漂移系數，通過漂移系數來考察傳感器的熒光性能穩定性。

式中： 為傳感器在第 i 個標準點的測量值; Y_i?? 為傳感器在第 i 個標準點的熒光溶液標準值; n 為標準點個數。

2 結果與討論

2.1 熒光素鈉標準溶液的配制

滿足實驗方法中5個要求的熒光標準物質有羅丹明、熒光素鈉[1]，由于熒光素鈉是最敏感的，即在低質量濃度范圍內，傳感器的熒光信號增加幅度較大，重點是熒光素鈉在 530～650nm 范圍內具有與浮游植物相似的發射光譜，因此本文以熒光素鈉作為熒光標準物質。經調研發現目前市場上的熒光素鈉標準樣品有2種，純度分別為 95.0% 和 97.5% ，不確定度均為 2% ，確定純度為 97.5% 的熒光素鈉標樣品為熒光標準物質。

利用電子天平和砝碼進行了最小稱樣量[1]的測量（表1），重復稱量 40.00mg 的砝碼其實驗標準差最小，因此確定配制熒光素鈉貯備液所需稱量的熒光素鈉標準樣品為 40.00mg 。

利用電子天平和燒杯稱量 40.00mg 的熒光素鈉標準樣品，定容至 1 000mL 的棕色容量瓶中，即可得到熒光貯備溶液。

2.2 傳感器的響應線性范圍

本實驗所用傳感器測量范圍為 0～200μg/L ，設置標準點為 0.50，100，150，200，μg/L， 。用熒光貯備液稀釋配制上述5個標準點的溶液。

在環境溫度 （20±5）^°C 和避光環境下，傳感器置入測試專用桶中，傳感器底部到桶底部的距離不小于 10cm ，以降低邊界效應的影響。開啟傳感器 2min 后，按質量濃度從小到大順序依次測試該系列溶液，連續采集1min 的數據，取其算術平均值作為在該標準點下傳感器的熒光信號平均值。利用傳感器的熒光信號平均值x 和系列熒光溶液的質量濃度值 y 繪制標準曲線（見圖2）， r=0.9998 。可見在該測量范圍內，傳感器熒光信號與熒光質量濃度值呈現良好的線性關系，與張天鵬等[10]的實驗結論一致，則該傳感器的響應線性范圍為0～200μg

若測試實驗發現，這5個標準點所作的標準曲線的 rlt;0.995 ，則去掉最高點，重新設定最高質量濃度的標準點，與余下的質量濃度點重新繪制標準曲線；若 r?0.995 ，則新范圍即為傳感器的響應線性范圍。線性擬合的相關系數來調整傳感器的線性響應范圍是有必要的。如果傳感器的線性響應較高，那么它的輸出量與輸人量之間具有良好的一致性和可預測性，可以更準確地測量和控制傳感器的測量結果。

2.3 傳感器的準確度與精密度

在環境溫度 （20±5）°C 和避光環境下，除響應線性范圍的5個標準點外，再配制質量濃度20.00、120.00、170.00μg/L 的熒光溶液，利用傳感器測量得到熒光信號，然后計算熒光信號平均值、傳感器測量值（見表2）。結果顯示，該傳感器的最大誤差在 2.00μg/L 以內，在低、中、高3個質量濃度的相對標準偏差分別為 0.13% 10.20%.0.20% ，顯示出良好的測量準確度和精密度。該傳感器測量的熒光準確度、精密度與葉綠素標準溶液測量的準確度、精密度基本一致。葉綠素標準溶液是由美國 sigma公司生產的葉綠素a標準樣品配制，有較準確的葉綠素a濃度值，由此可見傳感器的熒光性能評估結果與葉綠素標準質量濃度評估的結果具有可比性，但本實驗沒有選取葉綠素標準樣品，是因為該標準樣品溶于乙醇、丙酮等有機溶劑，會損傷傳感器的外殼漆層。

2.4 傳感器的穩定性

同一海水葉綠素a傳感器在2019—2022年，送至海洋計量技術機構進行了熒光性能測試，利用不同時期的測試數據按照公式（1）得到各年傳感器的漂移系數（見圖3）。2021年和2022年漂移系數相當，均在1.000 0附近，而 2019 年漂移系數則為0.646 247。

穩定性是指傳感器使用一段時間后，其性能保持不變的能力，可以用在一定時間內傳感器輸出值的變化程度來考察。一般穩定性越好，傳感器輸出的數值變化較小。由此可見，同一臺傳感器，每次測量時熒光溶液的質量濃度值保持不變，通過比較傳感器測量值與標準值的關系——漂移系數來判斷傳感器的穩定性。即傳感器的測量值與標準值越接近，漂移系數在1附近;當傳感器的測量值低于標準值時，漂移系數大于1;當傳感器的測量值高于標準值時，漂移系數小于1。因此漂移系數可以說明傳感器測量的穩定性，即漂移系數維持在1附近，則表明傳感器越穩定。由此可見，該傳感器在2021和 2022年的性能比較穩定。

由于海水葉綠素a傳感器多在近海在線監測平臺上進行長期現場測量，以獲得連續數據。在長期的海洋測量活動中，傳感器的穩定性、可靠性越來越受到關注。但是受到現場海水不斷運動變化的影響，測量時間不同，同一測量點上各傳感器獲得的海洋葉綠素a數據不盡相同，目前相關文獻[8開展的傳感器比測僅是比較兩臺傳感器測量數據的相關性，無法說明傳感器的穩定性。為解決該難題，本文采用同一傳感器在同一實驗室、同一環境條件，由同一批實驗人員采用同一種方法和同一種計量標準器具，在不同時期進行的重復性實驗[12]數據，即采用間斷的重復性數據來考察傳感器的穩定性，因為該數據具有溯源性和可比性。

3結論

本文選取了與海水葉綠素a具有相似特性的熒光素鈉作為參考標準物質，明確了測試環境條件，從響應線性范圍、準確度、精密度和穩定性等4方面，研究了實驗室環境下海水葉綠素a傳感器的熒光性能評估方法。研究發現，利用傳感器測量熒光素鈉的系列溶液，傳感器的熒光信號與熒光溶液質量濃度具有良好的線性關系，當相關系數 r?0.995 ，則該系列熒光溶液的低濃度點和高濃度點構成傳感器的響應線性范圍，當rlt;0.995 時，則需調整最高濃度點，繼續測試、繪制標準曲線，直至 r?0.995 ，則新范圍即為響應線性范圍；傳感器的示值誤差最大在 2.00μg/L 以內，相對標準偏差最大為 0.20% 。利用同一傳感器在不同時期的測量數據評估了傳感器的穩定性，2021—2022 年的漂移系數維持在1附近，表明傳感器在此期間比較穩定。為了獲取高質量的海水葉綠素a觀測數據，定期對傳感器進行檢定/校準，即在實驗室利用熒光素鈉評估葉綠素a傳感器的響應線性范圍、準確度、精密度和穩定性的評估，以確定傳感器的性能是否發生變化;該方法是科學、易于操作的，且現用現配，經濟實惠。

參考文獻：

[1]張麗，郭翠蓮，張述偉，等.熒光法測定葉綠素a的影響因素及其數據校正[J].山東科學，2017，30（3）：8-11.DOI：10.3976/j.issn.1002-4026.2017.03.002.

[2]李祖華，李天深，周文東.海水自動監測站與實驗室國標方法測定海水中葉綠素的比對分析[J]．儀器儀表與分析監測，2013（3） ： 41-43. D01：10.3969/j.issn.1002-3720.2013.03.014.

[3］國家海洋局.海洋監測規范第7部分：近海污染生態調查和生物監測：GB 17378.7—2007[S].北京：中國標準出版社，2008.

[4]王愛軍，王聰，石超英，等.海洋現場葉綠素傳感器的校準方法初探[J].計量技術，2019，63（2）：3-6.DOI：10.3969/j.issn.1000-0771.2019.02.01.

[5]林學舉，黃邦欽，王大志，等.葉綠素現場連續測定的基本原理及其數據校正[J].廈門大學學報（自然科學版），2001，40（6） ： 1346-1349. D0I：10.1088/0256-307X/18/11/313.

[6]ASTMInternational.Standardgudeforfluorescence：instrumentcalibrationandqualifcation，international：ASTE219-09（2022）[S].Washington，DC：ASTM，2022.

[7]景超，曹煊，吳寧.基于熒光法的明場海水葉綠素傳感器設計[J].傳感技術學報，2021，34（5）：581-586.DOI：10.3969/j.issn.1004-1699.2021.05.003.

[8]崔建升，呂鵬翼，段莉麗.海水葉綠素現場檢測儀的研制及性能研究[J].分析儀器，2014（1）：12-16.DOI：10.3969/j.isn.1001-232x.2014.01.003.

[9]張天鵬，褚東志，馬海寬，等．原位葉綠素a光纖熒光傳感器研制[J].山東科學，2017，30（6）：1-5.DOI：10.3976/j.isn.1002-4026.2017.06.001.

[10]EARPA，HANSONCE，RALPHPJ，etal.Reviewoffluorescentstandardsforcalibrationof insitufluorometers：Recommendationsapplied incoastalandoceanobserving programs[J].Optics Express，2011，19（27）：26768-2678.DOI：10.1364/OE.19.026768.

[11]The United States Pharmacopieial Convention.USP lt;1251gt; weighing on an analytical balance[EB/OL].[2024-12-2O]. http：//www.newdruginfo.com/pharmacopeia/usp28/v28230/usp28nf23s0_c1251.html.

[12]王愛軍，趙卓英，張川，等.海洋環境參數監測傳感器的穩定性評價研究[J].海洋開發與管理，2022，39（12）：115-120