Penicilliumsp.MYA5中microperfuranone聚酮合酶基因在構(gòu)巢曲霉中的異源表達(dá)

中圖分類(lèi)號(hào)：Q786 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Heterologous expression of the microperfuranone PKS from Penicillium sp.MYA5 in Aspergillus nidulans

MengXianchao1，HuBo2，YuHaobing2，SunYuanyuan2，andLiuXiaoyu2 （1 SchoolofOceanFoodandBilogicalEngieeingJangsuOceanUnversityLianungang2O5;2LANavalMedicalCeter Naval Medical University， Shanghai 200433）

Abstract Objective To enhance the production of the antimicrobial compound microperfuranone derived from the polar endophytic fungus Penicillium sp.MYA5 through gene mining and heterologous expression strategies， and to evaluate its bioactivity.MethodsGenome sequencing data for Penicillium sp.MYA5 were analyzed using antiSMASH to identify biosynthetic gene clusters.The polyketide synthase gene mfpksA wascloned and inserted into the recombinant plasmid pYTU-mfpksA.Screening positive clones through yeastand Escherichia coli transformation. The recombinant plasmid was introduced into Aspergillus nidulans LO8030，and screened on CHsorbitol plates to obtain therecombinant strainThe plasmid was transformed into Saccharomyces cerevisiaeBJ5464andEscherichia coli TOP10 forvalidation，heterologous expression was performed in Aspergilus nidulans LO8030，followed by fermentation， HPLC analysis，and structural elucidation via NMR and massspectrometry. Antimicrobial activity was assessed against pathogenic strains using the broth microdilution method. ResultsThe target compound microperfuranone was successfullyisolated from the heterologous expression strain，achieving anapproximately3.88- fold increase in yield compared to the MYA5 strain.Antimicrobial activity assays revealed that microperfuranone exhibited a minimum inhibitory concentration （MIC） of 16μg/mL against both Fusarium oxysporum and Vibrio harveyi. Notably，its inhibitory activity against F. oxysporum was significantly superior to chloramphenicol. Conclusion The heterologous expression strategy successfully enhanced the production of microperfuranone， confirming the effectiveness of biosynthetic gene cluster mining and heterologous expression in natural product discovery.The compound exhibited significant inhibitory activity against plant pathogens，providing a theoretical foundation for the antimicrobial application of polar microbial resources.

Key WordsMicroperfuranone; Penicillium sp.; PKS; Heterologous expression; Polyketide compounds

呋喃酮類(lèi)化合物是一類(lèi)含有氧原子的五元雜環(huán)芳香化合物，具有抗菌、抗氧化、抗炎和抗癌等多種生物活性[1-3]，已開(kāi)發(fā)上市的藥物有痢特靈、呋喃酮唑片等，真菌中已報(bào)道的呋喃酮類(lèi)化合物多數(shù)都是通過(guò)聚酮合成酶（PKS）途徑合成的，如asperfuranone，gregatinA等[4-5]，其不同的官能團(tuán)具有不同的生物活性[]，microperfuranone是1個(gè)聯(lián)苯呋喃酮化合物，其結(jié)構(gòu)為5-羥基-4-芐基-3-苯基-2（5H）-呋喃酮，已從真菌Aspergilluscarneus，Aspergillussp.Y-12和AcremoniumpilosumF47等菌株中分離得到[7-10]，具有抗菌，抗病毒等生物活性[1]，但通過(guò)常規(guī)分離手段的產(chǎn)量相對(duì)較低，可以采取基因工程技術(shù)對(duì)其生物合成基因進(jìn)行異源表達(dá)，不僅能避免原始宿主復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)對(duì)產(chǎn)物合成的干擾，而且目標(biāo)化合物的產(chǎn)量也會(huì)有所提高。

Penicilliumsp.MYA5是從北極仙女木根部中分離得到的內(nèi)生真菌，因長(zhǎng)期處于高寒和低氧等特殊環(huán)境，故從中獲取的天然產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)新穎生物活性豐富[12]。課題組前期從Penicilliumsp.MYA5中分離得到了microperfuranone，具有良好的抗菌活性，但是產(chǎn)量相對(duì)較低，基于此，本研究旨在通過(guò)異源表達(dá)的方式提高microperfuranone的產(chǎn)量。首先對(duì)極地來(lái)源Penicilliumsp.MYA5的基因簇進(jìn)行比對(duì)分析，通過(guò)基因組挖掘鑒定出一個(gè)PKS基因，這個(gè)基因與asperfuranone的生物合成有較高的同源性，我們命名為mfpksA基因。mfpksA基因具有典型PKS結(jié)構(gòu)域，其中脫水酶（dehydratase，DH）和產(chǎn)物模板（producttemplate，PT的存在提示該P(yáng)KS可能參與環(huán)化反應(yīng)，最終形成呋喃環(huán)[13]，其次將mfpksA基因在構(gòu)巢曲霉AspergillusnidulansLO8030中進(jìn)行異源表達(dá)，最終分離得到了目標(biāo)化合物microperfuranone，相較于原始菌株其產(chǎn)量提高了約3.88倍，生物活性測(cè)試表明其對(duì)尖孢鐮刀菌的抗菌活性顯著優(yōu)于陽(yáng)性藥，因此我們推測(cè)該化合物具有提高宿主植物的抗菌能力。這種基因?qū)虻拇渭?jí)代謝挖掘策略為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用microperfuranone及其衍生物提供了新的思路。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒及試劑

Penicilliumsp.MYA5（CCTCC保藏號(hào)：SF2021062）、Aspergillus nidulans LO8030（argB： nkuA△; stc△; eas△; afo△;mdp△; tdi△; aus△; ors△; apt△; pyrG89; pyroA4; riboB2）、SaccharomycescerevisiaeBJ5464-NpgA、pYTU、pYTU-mfpksA均為本實(shí)驗(yàn)室保存、EscherichiacoliTOP10（AmpR，URA）購(gòu)自上海唯地公司；PacI、SmiI購(gòu)自美國(guó)New England Biolabs公司；FastDigestPacI、FastDigestSmiI購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司；裂解酶購(gòu)自德國(guó)Sigma公司；Yatalase酶購(gòu)自日本Takara公司；真菌DNA提取試劑盒、YPDA培養(yǎng)基、酵母缺陷型瓊脂培養(yǎng)基（尿嘧啶）購(gòu)自北京酷來(lái)搏公司； 2× LongPCRMasterMix（WithDye）購(gòu)自上海少辛生物公司；酵母質(zhì)粒抽提試劑盒、酵母轉(zhuǎn)化試劑盒購(gòu)自美國(guó)Zymo公司；質(zhì)粒DNA抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒、DNAMarker、4SGelred核酸染料、及其他常用生化試劑和耗材購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

1.1.2 引物

本研究所用的引物見(jiàn)表1。

1.1.3 主要儀器

電泳儀（上海培清科技公司，JS-power300）；PCR儀（杭州朗基科學(xué)儀器公司，T20）；HPLC（美國(guó)Waters公司，1525/996）；恒溫?fù)u床（知楚儀器公司，202Y-C）電穿孔儀（美國(guó)BIO-RAD，1652100）。

1.1.4培養(yǎng)基及相關(guān)溶液配制

PDA培養(yǎng)基；PDB培養(yǎng)基；聚酮培養(yǎng)基；PDA加山梨醇培養(yǎng)基；Osmotic 培養(yǎng)基；Trapping緩沖液；STC緩沖液；尿嘧啶尿苷溶液（工作濃度：500μg/mL） ；維生素 ?B₆ HCI溶液（工作濃度： ）維生素 B₂ 溶液（工作濃度： ；酵母缺陷型培養(yǎng)基；SOC培養(yǎng)基；CD培養(yǎng)基；氨芐西林溶液（工作濃度： 100μg/mL ）。CD-山梨醇培養(yǎng)基和CD-ST培養(yǎng)基在A.nidulansLO8030培養(yǎng)時(shí)需補(bǔ)充尿嘧啶尿苷溶液，維生素 B₆ HCl溶液和維生素 B₂ 溶液，導(dǎo)入pYTU質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子補(bǔ)充維生素B6HC1溶液和維生素B2溶液。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1呋喃酮生物合成基因簇挖掘

將Penicilliumsp.MYA5全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)上傳至antiSMASHversion6.1.1軟件，通過(guò)Known-ClusterBlast、SubclusterBlast和smCOG等功能進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。

1.2.2PKSmfpksA的克隆及重組載體的構(gòu)建

① 目的片段的獲取。將菌株P(guān)enicilliumsp.MYA5 用PDB培養(yǎng)基在 28^°C 培養(yǎng) 180r/min ， 3d ，紗布過(guò) 濾獲得菌體，按照試劑盒方法提取基因組。以菌株

Penicilliumsp.MYA5全基因組為模板，mfpksA-F和mfpksA-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR的反應(yīng)條件為：94^°C5min ； 94^°C30s ， 68.3°30s ， 72°C5min ，30個(gè)循環(huán)； 72°C 7min 。經(jīng) 2% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

② 質(zhì)粒雙酶切。采用限制性?xún)?nèi)切酶PacI和SmiI對(duì)質(zhì)粒pYTU雙酶切，PacI體系 ， 37°C ， 3h ：10× rCutSmartTM緩沖液 （5μL） 、質(zhì)粒DNA （1μg） 、PacI（2μL） 、去離子水 （42μL） 。SmiI體系 （60μL ， 25°C ，3h ：PacI體系 （50μL） 、Nacl溶液 （5μL） 、Smi I（2μL） 小NE buffer 3.1（1μL） 、去離子水 （2μL） 。

③ 酵母感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化。使用冷凍酵母轉(zhuǎn)化試劑盒制備并轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞，將感受態(tài)細(xì)胞涂布于酵母缺陷型瓊脂培養(yǎng)基， 30°C 倒置培養(yǎng) 2～3d 后續(xù)進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

④ 大腸埃希菌感受態(tài)的轉(zhuǎn)化。通過(guò)電轉(zhuǎn)法[14]將重組質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸埃希菌。并進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證、雙酶切驗(yàn)證以及測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3A.LO8030原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化

參考Zhou等[15]方法制備原生質(zhì)體，用滅菌竹簽將活化菌液接種到CD斜面培養(yǎng)基，制備孢子液，將孢子液按1：5（V/V）轉(zhuǎn)接至CD培養(yǎng)基， 28°C ， 180r/min 培養(yǎng)14h 獲菌液，將菌液離心，棄上清；加入Osmotic緩沖液混勻后離心棄上清，重復(fù)此操作兩次去除培養(yǎng)基殘留；向菌體沉淀加酶解液， ， 80r/min 酶解14h ，觀察到大量合格原生質(zhì)體后，加Trapping緩沖液離心，兩層緩沖液間透明層即原生質(zhì)體。將重組質(zhì)粒及原生質(zhì)體混合液涂抹到CD-山梨醇固體平板上，置于 37°C 養(yǎng)3d，觀察轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)情況。選擇生長(zhǎng)良好的單克隆轉(zhuǎn)接至CD培養(yǎng)基中，在 30°C 培養(yǎng)3d，重復(fù)進(jìn)行3次轉(zhuǎn)接，以獲取穩(wěn)定遺傳的重組菌株A.LO8030：：P.MYA5 mfpksA。

1.2.4 菌株發(fā)酵與目標(biāo)產(chǎn)物的HPLC檢測(cè)制備

參考蔣美珍等方法并做修改，分別收集MYA5、構(gòu)巢曲霉LO8030及重組菌株的新鮮孢子，用于制備種子液。將種子液以 5% 的接種量接入 500mL 的CD-ST液體培養(yǎng)基中， 28°C ， 180r/min 搖床培養(yǎng)5d后，分別取發(fā)酵液加入2倍體積的無(wú)水甲醇混勻，然后離心取上清進(jìn)行HPLC分析。HPLC條件為：流動(dòng)相A：甲醇，B：水；梯度洗脫 （0～60min ， A：B=20：80～99：1， /V）；流速1 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量20 μL；C1s柱（AQ12S05-2546WT， 5μm ， 4.6mm×250mm） 。以0.1mg/mL 的microperfuranone作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。計(jì)算MYA5和重組菌株發(fā)酵液中的樣品濃度（樣品濃度 樣品峰面積/標(biāo)準(zhǔn)品峰面積 × 稀釋倍數(shù) × 標(biāo)準(zhǔn)品濃度）。

1.2.5化合物生物活性測(cè)試

采用微量肉湯稀釋法[17]對(duì)microperfuranone進(jìn)行抑菌活性測(cè)試。指示菌為尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum）（CCTCCAF2015018）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）（CCTCCAB2015113）、大腸埃希菌（Escherichiacoli）（CCTCCAB2017070）、哈維弧菌（Vibrioharveyi）（CGMCC1.8773）和白念珠菌（Candidaalbicans）（CCTCCAY2018005）。陽(yáng)性對(duì)照為氯霉素，陰性對(duì)照為1% 的DMSO溶液。進(jìn)行3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算MIC值。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1呋喃酮生物合成基因簇挖掘結(jié)果

將Penicilliumsp.MYA5全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)提交至antiSMASHversion6.1.1，通過(guò)分析鑒定出一個(gè)PKS生物合成基因簇cluster6.2，大小為 41732bp ，包含8個(gè)基因。MIBIG分析顯示其核心基因PKS（gene07096即mfpksA基因）與A.nidulansFGSCA4的asperfuranone生物合成PKSAN1036.2相似度為 27.59%^[18] ，mfpksA基因的酮合酶（ketoa-cyl-ACP synthase，KS）、酰基轉(zhuǎn)移酶（acyltransferase，AT）、酰基載體蛋白（acylcarrierprotein，ACP）等關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域與AN1036.2高度保守，提示其可能具有相似功能，推測(cè)mfpksA基因可能負(fù)責(zé)合成呋喃酮類(lèi)化合物。基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)mfpksA基因的表達(dá)水平及表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果表明mfpksA基因僅與簇內(nèi)初級(jí)代謝相關(guān)的orf100基因相關(guān)（圖1B），表明mfpksA基因具有高度的獨(dú)立性，且在不同培養(yǎng)時(shí)間（圖1C），不同培養(yǎng)條件（圖1D），mfpksA基因均呈現(xiàn)低表達(dá)水平，導(dǎo)致通過(guò)發(fā)酵分離難以獲得足量目標(biāo)化合物，由此為采用異源表達(dá)策略提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2.2重組菌株A.LO8030：：P.MYA5mfpksA的構(gòu)建

以Penicilliumsp.MYA5基因組為模板，PCR擴(kuò)增mfpksA基因，經(jīng)過(guò)PacI和SmiI雙酶切獲得線性質(zhì)粒pYTU。將mfpksA基因與pYTU轉(zhuǎn)入S.cerevisiaeBJ5464，篩選陽(yáng)性克隆并進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，條帶約 490bp 。提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌，進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，pYTU-mfpksA質(zhì)粒約 20kbp ，酶切結(jié)果符合預(yù)期。最終測(cè)序驗(yàn)證序列正確，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，見(jiàn)圖2。

注：A為mfpksA基因的結(jié)構(gòu)；B為cluster6.2內(nèi)基因的表達(dá)相關(guān)性；C為cluster6.2內(nèi)基因在PDB培養(yǎng)4、6和8d的表達(dá)水平；D為cluster6.2內(nèi)基因在PDB10d、PDA45d和聚酮45d培養(yǎng)的表達(dá)水平。

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pYTU-mfpksA導(dǎo)入構(gòu)巢曲霉中進(jìn)行異源表達(dá)，通過(guò)CD-山梨醇平板經(jīng)兩輪篩選，最終成功篩選獲得重組菌株A.LO8030：：P.MYA5mfpksA。觀察重組菌株與空白菌株在平板上的生長(zhǎng)情況發(fā)現(xiàn)，兩者菌落形態(tài)存在顯著差異，重組菌株的菌落呈墨綠色，4mfpksA的A.nidulansLO8030菌落正面為白色至淺黃色，證實(shí)mfpksA基因在宿主構(gòu)巢曲霉中成功表達(dá)，合成了新的產(chǎn)物（圖3）。

2.3重組菌株A.LO8030：：P.MYA5mfpksA的產(chǎn)物分析鑒定

將重組菌株A.LO8030：P.MYA5mfpksA和菌株A.nidulansLO8030分別在液體CD-ST培養(yǎng)基中發(fā)酵5d的浸膏進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果如圖4所示，A.LO8030：：P.MYA5mfpksA在保留時(shí)間為20.8、21.7和29.7min 處有明顯的吸收峰，提示有新產(chǎn)物。在保留時(shí)間為 20.8min 和 21.7min 處的吸收峰成分鑒定為cyclo（ L -Phe- .L -Pro）和desferritriacetylfusigen，二者均為NRPS產(chǎn)物，且desferritriacetylfusigen是構(gòu)巢曲霉的本底化合物[19-20]，推測(cè)mfpksA基因的導(dǎo)入激活了宿主菌

注：A為mfpksA基因擴(kuò)增片段；B為線性質(zhì)粒pYTU酶切產(chǎn)物；C為菌落PCR驗(yàn)證；D為重組質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證；E為重組質(zhì)粒的測(cè)序驗(yàn)證；泳道1＼～3為mfpksA基因片段；M為Marker 5000bp ；泳道4和5為pYTU線性質(zhì)粒； M₂ 為Marker 15000bp ；泳道6和7為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；泳道8和9為pYTU空質(zhì)粒；M3為Marker 2000 bp；泳道10為pYTU-mfpksA質(zhì)粒；泳道11和12為雙酶切后的線性pYTU-mfpksA質(zhì)粒。

中某些沉默的基因簇。 29.7min 處的吸收峰經(jīng)高效液相 色譜法制備得到化合物3：黃色粉末，HRESI-MS （m/z） ，通過(guò)HRESI-MS確定分子式為 C₁₇H₁₄O₃ ，不飽和度為11。 ¹H NMR （ 500MHz CDCI3） δ_H： 7.53 （2H， m， H-7，11）， 7.19 （2H， m，H-8，10），7.31 （1H，m，H-9），7.46 （2，dd， J=7.2 ， 1.3Hz ，H-14，18）， 7.31 （2H，m，H-15， 17）， 7.46 （1H， m，H-16）， 5.92 （1H， s，

H-5）， 3.5 （2H， m，H-12）; ¹³C NMR （125 MHz， CDCl₃. ） δ_c ：170.2 （C-2），128.86 （C-3），157.72 （C-4）， 96.1 （C-5）， 130.0 （C-6），129.0（C-7，11），128.9 （C-8，10）， 127.2 （C9）， 32.3 （C-12）， 135.9 （C-13），128.9 （C-14， 18）， 129.1 （C15，17），128.6（C-16）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[21]， 鑒定化合物3為microperfuranone（圖4）。圖5為菌株發(fā)酵 后microperfuranone的產(chǎn)量，結(jié)果表明重組菌株相比 MYA5菌株的產(chǎn)量提高了約3.88倍。

2.4生物活性測(cè)試結(jié)果

抗菌活性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示microperfuranone對(duì)F.oxysporum和V.harveyi的MIC分別為 16μg/mL ，氯霉素對(duì)F.oxysporum和E.coli、C.albicans、S.aureus、V.harveyi的MIC分別為32、8、32、8和 8μg/mL 。1% DMSO的MIC均大于 64μg/mL （表2），結(jié)果表明microperfuranone對(duì)Foxysporum的抗菌活性?xún)?yōu)于氯霉素。

3結(jié)論與討論

極地環(huán)境具有溫度低、光照強(qiáng)、輻射大和營(yíng)養(yǎng)貧乏等特點(diǎn)，這些極端條件促使植物形成了與之相適應(yīng)的內(nèi)生真菌[22]，研究表明內(nèi)生真菌能夠提高宿主植物的適應(yīng)性和抗逆性，如馬鈴薯中的內(nèi)生真菌Aspergilluscarneus產(chǎn)生了豐富的呋喃酮類(lèi)化合物，顯著增強(qiáng)了馬鈴薯根莖的抗菌能力[7]，Penicillium sp.MYA5作為分離自仙女木（Dryasoctopetala）的內(nèi)生真菌，可能通過(guò)合成具有顯著生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物協(xié)助宿主適應(yīng)極地惡劣的生存環(huán)境。通過(guò)常規(guī)的發(fā)酵分離獲取這些天然產(chǎn)物已逐漸暴露出效率低、難度大等缺點(diǎn)，隨著生物信息學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，化合物的獲取已不再局限于一株多化合物策略（OSMAC）[23-24]，基因組挖掘策略獲取天然產(chǎn)物的方法具有更高的特異性和效率，如異源表達(dá)生物合成基因簇[25-26]和過(guò)表達(dá)全局性調(diào)控因子[27-28]等。這種生物合成技術(shù)已成為提高天然產(chǎn)物產(chǎn)量及產(chǎn)生新化合物的重要手段。

本研究通過(guò)基因組挖掘技術(shù)從極地來(lái)源內(nèi)生真菌Penicilliumsp.MYA5中鑒定出1個(gè)PKS基因簇（cluster6.2），其核心基因mfpksA基因與已知的asperfuranone生物合成基因AN1036.2具有部分同源性，且結(jié)構(gòu)域分析顯示其DH和PT的保守性，提示該基因可能參與呋喃酮類(lèi)化合物的生物合成。轉(zhuǎn)錄組分析表明，mfpksA基因在原始菌株中表達(dá)水平較低，且基因簇內(nèi)基因間缺乏協(xié)同表達(dá)關(guān)系，這可能是天然條件下microperfuranone產(chǎn)量較低的重要原因。通過(guò)將mfpksA基因在構(gòu)巢曲霉A.nidulansLO8030中異源表達(dá)，成功獲得重組菌株A.LO8030：：P.MYA5mfpksA，較原始菌株microperfuranone產(chǎn)量提高了約3.88倍，驗(yàn)證了異源表達(dá)策略在提高次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量方面的有效性。此外，HPLC分析顯示重組菌株中出現(xiàn)了宿主本底NRPS產(chǎn)物的新吸收峰，表明異源基因的導(dǎo)入可能激活了宿主菌中部分沉默基因簇的表達(dá)，這一現(xiàn)象為后續(xù)次級(jí)代謝產(chǎn)物的多樣性挖掘提供了新線索。抗菌活性測(cè)試表明，microperfuranone對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制效果顯著優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照氯霉素，且對(duì)哈維弧菌也表現(xiàn)出同等抗菌活性。這一結(jié)果證實(shí)了microperfuranone在植物病原真菌防控中的潛在應(yīng)用價(jià)值，也提示其結(jié)構(gòu)中的聯(lián)苯呋喃酮骨架可能通過(guò)特定作用機(jī)制（如干擾真菌細(xì)胞壁合成或膜通透性）實(shí)現(xiàn)高效抑菌。然而，該化合物對(duì)革蘭陽(yáng)性菌（如金黃色葡萄球菌）的活性較弱，可能與其分子極性或靶標(biāo)選擇性相關(guān)，未來(lái)可通過(guò)結(jié)構(gòu)修飾進(jìn)一步優(yōu)化其廣譜抗菌能力。本研究的局限性是本次異源表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建仍有提升空間，后續(xù)可通過(guò)優(yōu)化啟動(dòng)子、異源共表達(dá)調(diào)控因子或引入后修飾基因等策略進(jìn)一步提高microperfuranone的產(chǎn)量。

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