鯽miR-21靶基因篩選與組織分布及皮膚免疫時序表達分析

中圖分類號：S917.1 文獻標志碼：A 文章編號：1004—6755（2025）06-0016—03

Screening of target genes and tissue distribution of Carassius auratus miR-21 and temporal expression analysis in skin immunity

JIN Ge，HUO Jiaxin，LIN Xuan， CHEN Yixin， ZHOU Junmin，HU Xiucai，LV Aijun

（AquaticColge，TianjinAgriculturalUniversityTianjinKeyLaboratoryofquaticecologyandBreedingianjino392ina） Abstract：In order to clarify the molecular mechanism of miR-21 involvement in mediating immune related signaling pathways in Carassus auratus skin infected with Aeromonas hydrophila， miR-21 and its target genes were identified through screening and enriched immune related signaling pathway analysis. Real time fluorescence quantitative PCR （qRT PCR） was used to detect tissue distribution and temporal expression levels.The results indicate that the predicted binding site sequences of miR -21 and BCL2 target genes are highly conserved among diferent species such as humans，mice，and fish. QRT PCR detection showed that miR 21 was mainly highly expressed in the gils， intestines，and muscle tissues of Carassius auratus ，in Carassius auratus skin infected with Aeromonas hydrophila，miR -21 exhibited a short-term fluctuating temporal expression pattern; miR -21 regulates the target gene BCL2 to mediate the downregulatied of TLR/MAPK signaling pathway related genes （such as IRAK1， TAB1 ， IKKa ）in the Carassius auratus skin，while TLR4 and RHO genes show significant upregulation at 12 and 72 hours of infection，and BCL2 is significantly correlated with TAB1 gene expression （ r=0.87 ）.The above research results contribute to the understanding of the molecular regulatory mechanisms of miR -21 and target gene functions in fish，as well as its mediation of skin immunity.

Key words： Carassius auratus ; Aeromonas hydrophila ; miR-21 ；target gene； tissue distribution; temporal expression; skin immunity

魚類miRNA對許多生物學過程如發(fā)育、代謝、炎癥和疾病產生廣泛影響，其中大多數(shù)miR-NA在魚類中的調控機制尚不清楚[1]。目前發(fā)現(xiàn)miRNA在不同層面調節(jié)TLR、MAPK相關信號通路，在硬骨魚中 miR-21 靶向IRAK4以抑制過度的免疫反應，也可調控靶基因PDCD4抑制STAT3活化作用 [2-3] ，而且一些miRNA調節(jié)TLR、MAPK和MyD88介導 NF-κB 信號通路中的基因表達[4-5]

魚類皮膚免疫學研究已成為探索有效抗病策略的重要途徑之一[6]。目前，對于魚類miR一21在炎癥系統(tǒng)中的生理和病理作用仍未見文獻報道。本文以嗜水氣單胞菌感染鯽為實驗對象，重點研究miR-21在皮膚免疫應答過程中的作用及其調控機制，有助于闡明細菌性敗血癥皮膚黏膜免疫的分子機理，對該病預防及miRNA藥物治療具有重要意義。

1材料與方法

1.1 試驗材料

嗜水氣單胞菌由本實驗室保藏，鯽魚購自某水產科技發(fā)展有限公司。RNAeasyTM動物小RNA抽提試劑盒， Mir-X^TM miRNA First-Strand Synthesis and TB Green qRT-PCRUserManual和RNAiso forSmall RNA等試劑購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2方法

1.2.1人工感染鯽miRNA及信號通路的篩選

參照Huo等[4]方法進行。人工感染鯽在浸泡感染6、12、24、36、48、72h分別選取至少3尾，無菌操作取組織（鰓、皮膚、肝臟、脾臟、腎、腸道、肌肉），用于miRNA轉錄組測序和實時熒光定量PCR分析。其中miRNA轉錄組測序分析，送至百邁克生物技術有限公司完成，篩選具有顯著差異表達的miRNA以及免疫相關信號通路。

1.2.2 miRNA提取及 cDNA 制備

根據(jù)試劑盒說明書，提取組織樣本中的miR-NA和制備 cDNA ，通過Nanodrop ND—2000超微量分光光度計檢測其質量，存于一 80^°C 超低溫冰箱備用。

1.2.3 引物設計及實時熒光定量PCR（qRT一PCR）

根據(jù)鯽miR—21成熟序列設計特異上游引物和通用下游引物， ，5.8SrRNA 為內參基因。從TLR、MAPK信號通路中篩選出10個相關基因，β—actin為內參基因[5]，所有引物由上海生工生物工程有限公司合成。

2結果

2.1miR-21分子特征及其靶基因篩選

從嗜水氣單胞菌感染鯽皮膚組織中，通過高通量測序獲得感染 ^12h 的差異表達miRNAs為856個，其中發(fā)現(xiàn)53個已知和10個未知miR-NAs顯著性差異表達。進一步利用Miranda和TargetScan預測鯽miR—21的候選靶基因，獲得一些免疫相關靶基因包括B細胞淋巴瘤基因（BCL2）、補體（C6）、細胞外基質蛋白（ECM2）、Toll樣受體（TLR1）、白細胞介素（IL一15）、整合素（ITGA9）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK8a、MAPK5）等。其中，發(fā)現(xiàn) miR-21 與靶基因預測的目標結合位點序列在不同的物種之間是高度保守的，并且BCL2在基因預測置信度得分較高，進一步采用RNA雜交工具預測BCL2的3UTR與 miR-21 的結合位點，具有較高的匹配度，最小自由能為 -23.2kcal/mol （20號

2.2miR-21在鯽組織表達及其在感染皮膚中的時序表達分析

采用qRT一PCR檢測miR-21在鯽不同組織中的表達分析，結果顯示主要在鰓、腸道和肌肉組織中相對高表達，在頭、腎、腸道、皮膚、肌肉、脾臟和肝臟組織中的表達量顯著低于鰓組織（ Plt;0.05） ，其中在肝組織中 miR-21 的表達量與鰓相比差異最大，miR一21表達量最低。進一步對感染嗜水氣單胞菌的鯽 miR-21 在皮膚組織中的時序表達分析，發(fā)現(xiàn)miR一21在感染皮膚中呈現(xiàn)“先升降、再升降\"短期波動的時序表達模式，在感染 ⁶h 表達量明顯升高，在 12～24h 表達降低，然后在感染 36h 皮膚組織中miR—21表達量最高（11.15倍），隨后 48～72h 呈現(xiàn)下降趨勢（見下頁圖1）。

2.3miR-21靶基因BCL2介導TLR-MAPK信號通路在皮膚免疫中的時序表達

嗜水氣單胞菌感染鯽后， miR-21 靶基因BCL2介導TLR-MAPK信號通路相關蛋白基因在皮膚中的表達模式變化，結果表明 miR-21 通過調控靶基因BCL2下調表達參與介導TLR一MAPK通路。其中IRAK1、TAB1、IKKa均在 ⁶h 表達量最低，出現(xiàn)顯著性下調，分別為^0h 的0.48、0.6、0.48倍。 TLR4 除 ^48h 外，其他時間均呈上調表達模式， ^72h 顯著性上調，最高為9.65倍； RHO 在 ^12h 和 ^72h 表達上調分別為8.63和3.55倍。進一步對基因表達相關性分析表明，鯽BCL2與TAB1基因的表達具有較強的相關性 Φ_r=0.87 ）。

3討論

近幾年，對魚類miRNAs與信號通路調控研究備受關注[。嗜水氣單胞菌感染鯽后，在感染6h 皮膚中發(fā)現(xiàn)829個miRNAs差異基因表達，^12h 有856個miRNAs差異表達；在鰓組織中鑒定出165個差異表達的miRNA，主要集中在TLR、MAPK、 NF-kB 等信號通路4。最近HUO等[5分析水生拉恩菌感染的鯽腸道m(xù)iR-NAs ，結果顯示miRNA主要參與脂質、胞嘧啶和嘌呤代謝的調節(jié)，這些基因通過腸道免疫網(wǎng)絡參與溶酶體和TLR途徑的局部免疫反應。

魚類的皮膚免疫是宿主防御的第一道防線8，最近發(fā)現(xiàn)miRNAs介導TLR/NF-kB信號通路，在皮膚黏膜炎癥和免疫反應的調節(jié)中發(fā)揮重要作用 [4-6] 。在硬骨魚中，miRNA與免疫防御顯著相關，如NLR、JAK一STAT和MAPK信號通路，這些通路參與各種生物過程[9。研究發(fā)現(xiàn)，感染嗜水氣單胞菌的鯽皮膚中的miRNA介導黏膜免疫反應涉及TLR、MAPK、JAK一STAT和吞噬體途徑[4-6]。因此， miR-21 與BCL2靶基因相互作用的不僅與免疫應答相關，而且在調節(jié)免疫網(wǎng)絡方面發(fā)揮了重要作用。

關于魚類 miR-21 的分離鑒定及功能研究，發(fā)現(xiàn) 主要通過PDCD4/STAT3等信號通路發(fā)揮作用[2，10]。本研究針對鯽miR—21靶基因篩選與組織分布及其在皮膚免疫中的時序表達分析，初步揭示TLR一MAPK信號通路均參與嗜水氣單胞菌感染鯽誘導皮膚免疫應答機制，對該病預防及miRNAs藥物治療具有重要意義。

參考文獻：

[1] ZHOU Z，LIN Z，PANG X，et al. MicroRNA regulation of Toll-like receptor signaling pathways in teleost fish[J]. Fishamp;Shellfish Immunology，2018（75）： 32-40

[2]JIANGL，GEM，HOUX，et al.miR -21 regulates tumor progression through the miR -21 -PDCD4-Stat3 pathway inhuman salivary adenoid cystic carcinoma[J].Laboratory investigation，2015，95（12）：1398—1408.

[3]YAN H，RAO J，YUANJ，et al. Long non一coding RNA MEG3 functions as a competing endogenous RNA to regulate ischemic neuronal death by targeting miR -21 /PDCD4 signaling pathway [J].CellDeath amp; Disease，2017，8（12）：3211—3216.

[4]HUOJ，HU X，BAI J，etal. Multiomics analysis revealed miRNAs as potential regulators of the immune response in Carassius auratus gills to Aeromonas hydrophila infection [J].Frontiers in Immunology，2023（14）：1098455.

[5]HUOJ，LI X，HU X，et al.Multi - omicsanalysis of miRNA一 mediated intestinal microflora changes in crucian carp Carassius auratus infected with Rahnellaaquatilis[J]. Frontiersin Immunology，2024（15）：1335602.

[6]BAI J，HU X，WANG R，et al. MicroRNA expression profileanalysis of skin immune response in crucian carp（Carassiusauratus）infected byAeromonashydrophila[J].Fishamp; Shellfish Immunology，2020（104）：673-685.

[7] ZHOUW，XIEY，LI Y，et al.Research progress on the regulation of nutrition and immunity by microRNAs in fish [J].Fish amp; Shellfish Immunology，2021（113）： 1-8 ：

[8] XIE X，MA R，QIAN D，et al. MicroRNA regulation during Nibea albiflora immuno-resistant against Cryptocaryon irritans challenge in fish skin[J].Aquaculture，2019（507）：211 -221 ：

[9] CHU Q，GAO Y， BI D，et al. MicroRNA -148 as a negativeregulator of the common TLR adaptor mediates inflammatory response in teleost fish[J].Scientific Reports，2017， 7（1） 4124.

[10]CHUQ，YANX，LIUL，etal.The inducible micro RNA -21 negatively modulates the inflammatory response in Teleost Fish via targeting IRAK4[J]. Frontiers in Immunology，2019（10）：1623.

（收稿日期：2025-05-09）