TGFBR1在肝癌中的表達和對肝癌細胞活性的影響

中圖分類號：R735.7 文獻標志碼：A 文章編號：1672-1098（2025）02-0100-09

引文格式：，.TGFBR1在肝癌中的表達和對肝癌細胞活性的影響[J].理工大學學報（自然科學版），2025，45（2） ：100-108.

DOI：10.3969/j. issn.1672-1098.2025.02.013

Expression of TGFBR1 in Hepatocellular Carcinoma and Its Impact on Tumor Cell Activity LIU Xinkuang1 ，HUANG Xiaolong

（1.TheFirstHospitalofAnuiUniversityfSienceandTechnology，HuainanAnhui220o，China;2.SchoolofMedicine，Ahi Universityof Science and Technology，Huainan Anhui 232OO1，China）

Abstract： Objective To examine TGFBR1 expression in hepatocellular carcinoma （HCC）and its clinicopathological correlations，as well as validate TGF- β pathway effects on proliferation，migration and invasion.Methods TGFBR1 expression in 25 HCC tisues，from the patients who underwent hepatectomy at the first Anhui University of Technologyafiliated hospital，was assessed via immunohistochemistry.Statistical analyses linked expressionlevels to clinical features. EdU，Transwell，and scratch assays evaluated TGF- β pathway effects. Results TGFBR1 was higher in HCC than that in normal liver tissues （ Plt;0.05） ），correlating with TNM stage，AFP，ALT，and AST （20 （Plt;0.05）.TGF-β activation enhanced HCC cell proliferation，migration and invasion. Conclusion TGFBR1 is associated with HCC progression and liver dysfunction，and therefore the research may ofer therapeutic potential for patients with liver cancer.

KeyWords：Transforming growth factorbeta receptorsI（TGFBR1）;hepatocelularcarcinoma;Immunohistochemistry;prolifera tion;migration

肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是全球癌癥死亡的主要原因之一[1-2]。口服索拉非尼是晚期無法切除HCC患者的標準一線治療藥物[3]。盡管索拉非尼治療后部分HCC患者的生存獲益顯著，但患者多由于獲得耐藥性而出現疾病進展[4]。轉化生長因子 -β （ Transforming growth fac-tor beta， TGF-β ）過度表達在多種腫瘤類型中，是一種廣泛且與預后不良相關的分子標志物 [5-6]TGF- ?β 可以作為預測反應性的生物標志物，也可以作為提高免疫療法活性的治療靶點[7]

人體內有30多種 TGF- ?β 超家族配體[8]，根據序列相似性和功能可分為多個亞家族；主要亞群包括 TGF- 、激活素、抑制素、骨形態發生蛋白和生長分化因子[9]。由于在哺乳動物中表達的3種TGF- 亞型中， TGF-β1 是最豐富的，因此得到了充分的研究[10]。活化的 TGF-β 配體以自分泌和旁分泌依賴的方式啟動下游信號組件[1]。對于典型的 TGF- β 信號轉導，激活的 TGF-β 配體與由TGF-βI型和II型受體組成的四聚體受體復合物結合[12]。TGF-βRII 促進 TGF-βRI 的磷酸化，通過Smad2/Smad3的磷酸化傳遞信號，引發級聯反應[13]。 TGF-β 信號通路在良性細胞中可抑制細胞生長，但在癌細胞中可促進癌變生物學行為；這種現象被稱為 TGF-β 悖論。反常的 TGF-β 功能依賴于腫瘤細胞和微環境，并具有特定的分子機制[14]。 TGF-β 信號通路在肝癌中起雙重作用。在腫瘤發展的早期階段， TGF-β 途徑被抑制，導致活性降低。TGF- β 通路的早期衰減主要是由于抑制因子如SMAD7、SKI樣因子和 TGF-β 誘導因子的過度表達，這些因子作為負反饋調節因子[15]。此外，TGF- ?β 信號通路誘導DNA損傷基因家族成員Gadd45的表達，Gadd45參與細胞周期阻滯和凋亡[16]。在腫瘤發展的后期階段， TGF-β 通路通過促進上皮-間質轉化來促進腫瘤的生長[17]。上皮間質轉化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮細胞失去細胞間粘附并獲得間充質樣特征，使上皮細胞遷移和侵襲的過程。TGF- β 通過增加間充質標志物如波形蛋白和減少上皮標志物如 E- 鈣粘蛋白來促進 EMT[18]。由于 TGF-β 途徑的高活性，晚期肝癌表現出腫瘤細胞遷移和侵襲增強[19]。綜上所述， TGF-β 通路通過其對早期腫瘤發展、EMT、與其他信號通路的相互作用以及對腫瘤微環境的調節而促進肝癌的腫瘤侵襲

目前的研究進展指出TGF- ?β 通路可以對肝癌的進展產生一定程度的影響，具體表現為參與肝癌細胞生長、分化、凋亡和免疫等反應。本文將針對TGFBR1在肝癌中的表達和對肝癌細胞活性的影響開展研究，研究肝細胞肝癌組織中TGFBR1的表達情況，及其與肝細胞肝癌臨床病理特征之間的關系，初步探討TGFBR1與肝癌的關系；進一步在肝癌細胞中驗證TGF- ?β 途徑對肝癌的生物學效應包括增值、遷移和侵襲的影響，以此為肝癌的靶向治療提供新的實驗依據。

資料與方法

1.1 研究對象

本研究以2019年至2023年于行肝癌切除術的25例患者和行肝囊腫切除術的24例患者作為研究對象。所有患者均術后對手術標本進行病理活檢，并進行TNM分期，確保獲得完整的臨床病理數據。納入與排除標準如下，納入標準： ① 病理活檢確診為肝癌； ② 圍手術期內未出現死亡事件； ③ 所有病例手術前均未接受過任何放射及化學治療。排除標準： ① 臨床資料不完整； ② 合并其他惡性腫瘤； ③ 合并其他嚴重疾病。

1.2 免疫組織化學法染色及評分

常溫下解凍組織標本，經甲醛固定，脫水、石蠟包埋，切片，厚度為 5μm ，依次按步驟進行烤片、脫蠟、抗原修復、內源性過氧化物酶滅活和封閉，孵育抗TGFBRI單克隆抗體（ 1：200 稀釋，TGFBR1 An-tibody－AF5347江蘇親科生物研究中心有限公司）， 4^°C 冰箱封閉過夜，TBST浸洗切片4次（ 5min/ 次），孵育二抗（HRP 標記的山羊抗兔 IgG 貨號GB23303，武漢賽維爾生物科技有限公司），37^°C 恒溫箱孵育 30min ，TBST浸洗切片4次（5min/次），DAB顯色，再次脫水，脫酒精，最后封片、晾干。

染色切片將使用兩種不同的技術進行定性和定量分析。在光學顯微鏡下，從10個野外隨機選擇1個切片，棕黃色顆粒被認為是陽性染色。結果根據染色細胞的百分比和細胞質染色的程度進行評分，并由2名病理學家獨立評估每個切片。接著將染色的切片在掃描儀下進行掃描，利用SlideViewer軟件對掃描后的病理切片隨機采集6塊200倍鏡圖片，并用imageJ軟件對采集的6塊圖片進行陽性區域量化后計算出隨機采集圖片的平均染色強度和平均陽性面積占比。最終將定性數據和定量數據用于統計分析。

1.3 統計學方法

使用SPSS16.0軟件對所得數據進行分析。對于計量資料，使用均數 ± 標準差表示，計數資料用百分數 （%） 表示；以Fisher確切法分析TGFBRI與病理特征的關系， Plt;0.05 則認為差異具有統計學意義。

1.4 EDU增殖實驗

將 1×10⁵ 個細胞均勻的種在24孔板里，放在 37^°C 恒溫培養箱中 24h 后丟棄培養基，加入 500μL 含有EDU（ 10μM ）的培養液。繼續培養2h后用 4% 多聚甲醛固定 15min ，然后用 0.3% Triton通透

10min 。再按照試劑說明書加入配制好的 500μL 的click反應液。用 3% BSA的PBS洗3次每次 3～ 5min ，用DAPI染核 10min 。最后在倒置熒光顯微鏡下觀察紅色熒光的比例以衡量細胞的增殖活力。

1.5 Transwell遷移實驗

通過孔徑為 8μm 的Transwell室進行細胞侵襲。首先，將無血清培養基（ 200μL 中的 5×10⁴ 細胞接種到Transwell的上室。然后，下室補充有500μL 含有 10% 胎牛血清的培養基。 37^°C 培養24h 和 48h 后，用棉簽去除膜上側未遷移的細胞，遷移的細胞用 90% 乙醇固定 30min 。最后，將細胞用結晶紫溶液染色并在顯微鏡下觀察并拍照。計算3個隨機視野中的細胞數以評估跨膜遷移。

1.6 劃痕愈合實驗

以 5×10⁵ 個細胞/孔的密度接種細胞于12孔板中，待細胞長到鋪滿細胞培養瓶底壁時，用 20μL 槍頭在每孔中以豎直方向劃3條痕，吸棄上清液，更換無藥無血清培養基，然后在倒置顯微鏡下拍攝0、24、48h的圖片。最后評估細胞的遷移能力。

2 結果與分析

2.1 肝癌組織中TGFBR1的表達

TGFBR1在肝癌組織和正常肝組織中的表達情況如圖1所示，在肝癌組織中TGFBR1高表達（見圖1a），在正常肝細胞中TGFBR1低表達（見圖1b）;利用imageJ量化染色強度并計算出隨機視野下的平均染色強度，TGFBR1在25例肝癌組織中的平均陽性面積明顯高于24例正常肝組織的平均陽性面積（見圖1c），差異有統計學意義（ Plt; 0.05）；經過評分得出，在肝癌組織中TGFBR1表達陽性例數為18例、陰性例數為7例，陽性率為72% ；在正常肝組織中TGFBR1表達陽性例數為3例、陰性例數為21例，陽性率為 12.5% （見圖1d）。

2.2TGFBR1表達水平與臨床特征的關系

如表1所示，TNM分期為 I～II 期的肝癌中TGFBR1陽性率為 50% ，低于 I～N 期的 92.31% ；有腫瘤轉移（淋巴結、腹膜、腹水和肝臟）的肝癌組織中TGFBR1均表達為陽性，TGFBR1的表達與肝癌患者的TNM分期具有相關性，差異具有統計學意義（ Plt;0. 05） ）。并且在甲胎蛋白（AlphaFetopro-tein，AFP）超過異常值的患者中TGFBR1的陽性表達率為 91.67% ，在甲胎蛋白正常的患者中TGF-BR1的陽性表達率為 53.85% ，并且差異具有統計學意義（ Plt;0.05） 。而其他因素如性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤遠處轉移、Child-puge分級、WHO分級，與TGFBR1的表達未見明顯相關（ Pgt;0.05） °

2.3TGFBR1表達水平與生化指標的關系

如表2所示，在統計25位肝癌患者的血清學生化指標，并將生化指標與其對應的病理切片染色結果進行卡方檢驗發現，在谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）超過正常值的患者TGFBR1的陽性表達率為 91.67% ，而在ALT和AST在正常值范圍內的患者TGFBR1的陽性表達率為 53.85% ，并且差異具有統計學意義（ Plt;0.05） 。而其他指標如GGT、TBIL、ALB、 Pa 、WBC、PLT、RDW-SD、RDW-CV與TGFBR1的表達未見明顯相關（ ?Pgt;0.05 ）

2.4 TGF- ?_β 通路激活增強肝癌細胞的活性

細胞水平實驗包括EDU增殖實驗、Transwell實驗和劃痕愈合實驗在分組上采取同樣的分組方法，分別為第一組親代細胞 、第二組Hep^G2+ 索拉非尼、第三組 HepG2+ 索拉非尼 +TGF- 、第四組 Hep ⁶²⁺ 索拉非尼 SB431542。其中 TGF- _?β1 為TGFBR1配體，用于激活 TGF-β 通路；SB431542為 TGFBR1受體阻斷劑，用于阻斷TGF- ?β 通路

通過EDU增殖實驗評估了各組肝癌細胞的增值情況，如圖2（a）所示，在肝癌細胞HepG2中加入索拉非尼可見增值的細胞大幅度減少，而在加入TGF- 后被抑制的增值呈現了恢復的趨勢，再繼續加入TGF- 受體抑制劑SB431542后發現恢復的增值再次被抑制。

接下來通過Transwell實驗評估了各組肝癌細胞的侵襲情況，如圖2（b）所示，在肝癌細胞中加入索拉非尼可見肝癌細胞穿過小孔的數量大幅度減少，而在加入TGF- 后穿過小孔的細胞數量呈現了恢復的趨勢，再繼續加入 TGF-β1 受體抑制劑SB431542后發現穿孔的細胞數量再次減少。最后，通過劃痕愈合實驗評估了各組肝癌細胞的遷移情況，如圖2（c）＼～圖2（d）所示，在肝癌細胞中加入索拉非尼可見傷痕愈合率明顯減少，而在加入TGF- 后傷痕愈合率增大，再繼續加入 TGF-β1 受體抑制劑SB431542后發現愈合再次被抑制，并且在加入TGF-β1后增高的傷痕愈合率甚至達到未加人索拉非尼時的傷痕愈合率。

3討論

目前， TGF-β 信號通路已經成為癌癥治療的一個新興研究靶點，也與癌癥免疫治療的新領域有關[20]。 TGF-β 的信號失調明確促進了肝癌的炎癥和上皮間充質轉化，但具體機制尚不清楚TGF- 不僅可以引發肝癌細胞的EMT，還可以通過免疫抑制形成有利于腫瘤發展的免疫微環境[21]。當前在肝癌治療中遇到的諸多難題，而TGF- ?β 作為重要的細胞因子參與到肝病進展的所有階段，從最初的肝損傷直到肝細胞癌的發生[22] 。

為了證實TGFBR1和肝癌的病理特征具有相關性，本文收集肝癌組織和正常肝組織的病理切片，經過對TGFBR1免疫組織化學染色發現，在組織水平上，與正常肝組織相比較肝癌組織中TGF-BR1的表達量明顯較多，說明TGFBR1與肝臟的癌變可能存在一定的聯系。TGFBR1作為TGF- ?β 通路的I型受體蛋白，在發揮生物學效應上有具有重要意義，因此 TGF-β 通路的激活也可能是肝臟癌變病理過程的重要因素之一。接著在對肝癌患者的臨床特征與TGFBR1表達情況對比分析發現TGFBR1的表達與肝癌患者的TNM分期和AFP具有相關性，AFP為診斷原發性肝癌的特異性指標，約有 70% 的肝癌患者血清中甲胎蛋白會升高，因此AFP就成了診斷原發性肝癌的一個特異性臨床指標。因此，TGFBR1的表達可以促進肝癌的分期，并且可能作為一種診斷肝癌的特異性指標。在對肝癌患者血清學指標中分析發現TGFBR1的表達與肝癌患者的ALT、AST具有相關性。ALT與

AST主要分布在肝細胞內，如果肝臟受損或損壞，肝細胞中的轉氨酶便進入血液，血液中ALT和AST水平升高，提示肝臟病變信號。這提示TGF-BR1的表達與肝臟的損傷具有一定的相關性。

腫瘤細胞的增殖、浸潤和轉移等惡性生物學行為是造成患者死亡的主要原因，為了證實TGFBR1和肝癌增殖、浸潤和轉移具有相關性，在細胞水平上利用EDU增殖實驗、Transwell實驗和劃痕愈合實驗驗證TGF- β 途徑對肝癌的生物學效應的影響，結果表明隨著TGF- 通路的激活，被化療藥物抑制的肝癌細胞恢復了一定的增殖能力、遷移能力和侵襲能力。在量化數據后發現TGF- 通路的激活使得細胞的遷移能力恢復到未加入索拉非尼時的細胞遷移能力，在加入TGFBR1阻斷劑后TGF- 通路被部分阻斷，這時化療藥物對腫瘤的抑制作用又得到了一定的恢復，可做出以下推斷： TGF-β 通路的激活可以降低化療藥物對肝癌細胞的殺傷力，而阻斷TGF- 通路可以恢復化療藥物對肝癌細胞

的殺傷力。

綜上所述，本研究發現TGFBR1與肝臟的癌變具有正相關，TGFBR1的表達和肝癌的分期有相關性，并且可能作為一種診斷肝癌的特異性指標。TGFBR1的表達與肝臟的損傷具有正相關。TGF- β_β 通路的激活可以降低肝癌細胞的化療敏感性，而阻斷 TGF-β 通路可以恢復肝癌細胞的化療敏感性。此發現為肝癌的治療方向提供了新的線索和證據，并為開發針對TGF- ?β 信號通路的肝癌治療策略提供了新的思路。

4結論與展望

本研究顯示，TGFBR1在肝癌中高表達，并且與疾病的進展存在相關性。這表明肝臟組織可能通過TGF- 通路幫助演變成腫瘤并影響腫瘤的進展，在細胞水平上， TGF-β 通路的激活和阻斷都產生了明顯的生物學效應，因此如果藥物阻斷TGF- β 通路可能在一定程度上制約肝癌的增殖、遷移和侵襲等效應。本研究通過TGFBR1在肝細胞肝癌中的表達情況與臨床病理特征之間的關系初步探討TGFBR1與肝癌的關系；進一步在肝癌細胞中證實TGF- ?β 途徑的激活和抑制對肝癌確切的生物學效應具有明顯影響，因此猜想對 TGF-β 通路的干預會導致肝癌發生發展的變化，因此本研究結果為肝癌的治療方案提供新的參考。

本研究的不足之處有以下幾點：在組織水平上本研究樣本量較小，所得的結果可能存在偏差，還需進一步擴大樣本量以證實上述結果。而細胞實驗則只驗證了TGF- ?β 通路的激活可以降低肝癌細胞對化療藥物的敏感性，而阻斷TGF- β 通路可以恢復肝癌細胞對化療藥物的敏感性。因此在細胞水平上則需要設計更詳細的實驗來驗證TGF- ?β 通路影響肝癌進展的生物學效應和分子機制，最后小鼠荷瘤實驗可以在不傷害人體的情況下驗證TGF- ?β 通路如何影響肝癌在體內的發生發展，因此可以設計合理的動物實驗來驗證。TGF- ?β 在促進肝癌進展中的作用機制非常復雜，并涉及到各種生物學效應和分子機制。需要進一步的實驗來探索其分子水平的作用機理來推動臨床治療肝癌的新策略。進一步的研究有望揭示TGF- 在肝癌發生發展中的分子機制，并為肝癌治療提供更高效的治療方法。

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（責任編輯：丁 寒）

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