國家參考品雞傳染性支氣管炎陽性血清 （檢驗用）制備與檢定

中圖分類號：S852.5 文獻標識碼：A文章編號：1673-1085（2025）06-0014-06

依據最新版《中華人民共和國獸藥典》三部的相關規定，凡是含有雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）的單價活疫苗或者多聯多價活疫苗以及子種毒都必須進行外源病毒檢驗。因此，抗雞傳染性支氣管炎特異性陽性血清在含有傳染性支氣管炎病毒的疫苗或種子毒外源病毒檢驗中不可或缺。其中抗IB血清的中和效價及其特異性對檢驗結果影響重大。本試驗受中國獸醫藥品監察所委托，在IB血清庫存預警情況下開展，旨在制備高質量的抗雞傳染性支氣管炎病毒特異性陽性血清，并建立相應制備及檢定方法[]。

1材料

1.1 IB種毒

雞傳染性支氣管炎病毒H120株和M41株兩個種毒，由中國獸醫藥品監察所制備和檢定，病毒含量均 ?10^6.0EID₅₀/ 瓶。

1.2M41株油佐劑滅活苗

由中國獸醫藥品監察所提供。

1.3檢驗用試劑和試劑盒

新城疫血凝抑制試驗所用抗原和陽性血清、馬立克瓊擴試驗用抗原和血清、減蛋綜合征血凝抑制試驗用抗原和血清等，均購自中國獸醫藥品監察所；HI用陰性血清，由豪威公司研發實驗室制備；H5、H9血凝抑制試驗用抗原，由哈爾濱獸醫研究所提供；IBV、REOV、REV、CAV、IBDV、MDV、ALV（A、B、J亞群）、AEV抗體檢驗用試劑盒，由IDEXX公司提供；ILTV抗體檢測試劑盒，由荷蘭百測BioChe提供。

1.4其他試劑和器材

生理鹽水、PBS（ 0.1mol/L ， pH7.0～7.2 ）緩沖液，由豪威公司質檢實驗室自行制備；SPF雞胚和SPF公雞，由維通生物技術有限公司提供；滅菌飼料，購自東方希望飼料股份有限公司武清分公司； 500mL 塑料疫苗瓶、膠塞、鋁塑蓋：豪威生物科技公司生產；菌檢驗用培養基，購自中海生物科技有限公司；

1.5主要儀器

生物安全柜（型號NSF-1149-LIB3），購自蘇州安泰儀器制造有限公司；正負壓禽用隔離器（型號TT-J-H-I型），購自德州海量凈化空調設備公司；移液器，購自Sartorius、eppendorf、RAININ；電子天平（型號為JTS-6CW），購自武清華興實驗儀器公司；高壓蒸汽滅菌器（型號為DOM-LS型），購自協信醫療器械公司；生化培養箱（型號QCJ-2SD），購自杭州建亮凈化設備股份有限公司；電熱恒溫培養箱（DRX-793B），購自連云港恩瑞儀器有限公司；超低溫冰箱（澳柯瑪，型號為DW-86L388），購自美分科技有限公司。

2方法

2.1隔離器消毒

將隔離器裝配好通風口并密封，在每個隔離器內放置分別用不銹鋼飯盒蓋盛裝的高錳酸鉀 15g 和 40% 甲醛溶液 30mL ；為了驗證熏蒸效果，同時在每臺隔離器飼養艙內里側和外側各放置1片甲醛熏蒸滅菌生物指示劑。通過操作手套，將高錳酸鉀傾倒至甲醛溶液中，反應 30～60min 。

2.2 環境消毒

消毒前，將試驗所用的不銹鋼桌子、凳子、注射器、儲血袋等物品放置在指定房間。實驗人員穿戴好防毒面具后，根據房間空間體積大小稱量高錳酸鉀和 40% 甲醛溶液（每立方米用甲醛 10mL /高錳酸鉀 5g ，甲醛與高錳酸鉀比例為2：1）的使用量，并放置在指定位置。工作人員根據進出動物房流程，依次按照內準備間、潔凈走廊、禽舍、隔離器清洗間、污物處理間、污物走廊、脫衣間、淋浴間、更衣間等順序，快速將高錳酸鉀倒入甲醛內進行熏蒸消毒， 30～60min 后，打開本區域（含隔離器）空調排風系統排風 48h 。取出甲醛熏蒸滅菌生物指示劑，標記好信息后放置在 溫箱內培養觀察 48h ，與陽性對照判定熏蒸效果。排風 48h 后，對隔離器進行第2次熏蒸消毒及生物指示劑驗證；待熏蒸消毒完成、驗證合格后，方可飼養SPF雞。

2.3 動物標記

對試驗所用的4周齡SPF雞逐只檢查精神狀態，標記腳號，每臺隔離器內飼養12～13只，飼養觀察 24h 后進行免疫前采血雞只篩選工作。

2.4試驗動物篩選及飼養過程外源病毒監測

為保證制備血清所用動物無外源病毒感染，在SPF雞到貨飼養 24h 后以及首免后 14d， 二免后 14d 、三免后21d，每只雞在隔離器內翅靜脈采血 3mL 。血液置 溫箱放置1h， 冰箱冷藏1h后分離血清，進行外源病毒的抗體檢驗。除IBV抗體外，低禽流感病毒（H9亞型）、高禽流感病毒（H5亞型）、雞新城疫病毒（NDV）、雞痘病毒（FPV）、雞傳染性喉氣管炎病毒（AILTV）、禽呼腸孤病毒（ARV）、禽網狀內皮組織增生癥病毒（REV）、雞傳染性法氏囊病病毒（IBDV）、雞傳染性貧血病毒（CIAV）、禽淋巴白血病病毒（ALV-AB、ALV-J）、禽腦脊髓炎病毒（AEV）、禽腺病毒I群（EDS）、雞馬立克氏病病毒（MDV）等病原的抗體均不應檢出。根據檢驗結果剔除不合格動物，并標記腳號 2.5SPF雞免疫流程和隔離器編號[2]。 SPF雞的免疫流程見表1所示。

2.6飼養觀察、實驗人員及環境消毒

完成首次免疫后，飼養人員每天對飼養籠及環境消毒，確保清潔；每天上、下午各觀察動物狀態2次并記錄；實驗人員每次進入飼養區域前1d不接觸各類活毒，還要提前洗澡、更換衣服。

2.7采血及血清制備

2.7.1 物品準備采血前，準備好 0.1mol/L PBS、注射器、儲血袋、小推車、垃圾袋，放置在操作桌面一側備用。

2.7.2采血采血前 12h ，所有雞只停止供料，僅提供飲水。采用心臟采血法，一人保定，一人采血。保定人員將SPF雞左側向上固定在操作桌面，采血人員在雞只翅根、大腿關節、胸骨三點形成的三角區域的中心位置垂直刺入采血，每只雞約采 50～80mL ，平均 60mL 。將血液打入血袋，并標記腳號。

2.7.3血清制備將血袋放入 溫箱1h后，轉移至4℃冰箱保存過夜。提前準備好房間和操作臺，用消毒紗布擦拭血袋，用滅菌剪刀剪開血袋，將血清、血塊分別倒入 2000mL 燒杯分離。將每個燒杯內的血清混合到 2000mL 的潔凈燒杯，轉移至滅菌離心瓶中。通過電子天平配平后，以 7000r/min 離心 40min ，將離心后的血清過濾200目鋼紗，儲存在 15L 滅菌玻璃瓶中。將血塊用滅菌剪刀剪切后轉移至滅菌離心瓶中，配平后同樣條件離心 40min ，過濾血清并與之前的血清混合。在 15L 瓶子中加入終濃度為 的雙抗，混合均勻后分裝至 500mL 的塑料疫苗瓶，約 200mL/ 瓶，放置在 56° 水浴鍋中水浴滅活30min 。

2.8血清分裝凍干

將處理后的 200mL/ 瓶的血清溶解，通過5層紗布過濾至 15L 的無菌玻璃瓶中再次混合。用分裝機分裝至 7mL 西林瓶中，每瓶 2mL ，分裝前、中、后均取樣進行無菌檢驗。

2.9 凍干后成品血清檢測

2.9.1真空度測定、中和效價測定真空度檢測參考新版《中華人民共和國獸藥典》規程，使用高頻火花真空測定儀測定，出現輝光為合格，中和抗體效價應 ?1：200 。

2.9.2無菌檢驗、支原體檢驗和剩余水分測定根據新版《中華人民共和國獸藥典》規程，從大批生產中隨機抽取10瓶進行無菌檢驗，應無細菌生長；抽取5瓶進行支原體檢驗，應無支原體生長；隨機抽取4瓶進行剩余水分測定，測定值均應小于 4.0% 。

2.9.3外源病毒檢驗按照現行版《中華人民共和國獸藥典》進行，雞胚外源和細胞外源檢驗各3瓶。

雞胚法：將陽性血清用高壓滅菌生理鹽水稀釋到原倍量，從SPF雞胚的尿囊腔和絨毛尿囊膜兩種途徑分別接種10枚雞胚，每枚接種 0.3mL 。在 的孵化箱內孵化8d，棄去接種后 24h 內死亡的雞胚（無害化處理），每組雞胚存活應至少10枚。每8h照蛋1次，觀察雞胚變化至 144h 胎兒發育應正常，絨毛尿囊膜無病變，吸取雞胚液進行HA檢驗應為陰性[3]。

細胞法：應無細胞病變，也無紅細胞吸附現象。

ELISA試驗：檢驗禽白血病病毒，若陰性和陽性對照均成立，樣品應為陰性。

IFA試驗：檢驗禽網狀內皮組織增生癥病毒，若陰性和陽性對照均成立，樣品應無特異性綠色熒光。

2.10 中和試驗

參考最新版《中華人民共和國獸藥典》附錄，采用固定病毒稀釋血清法。將血清用滅菌生理鹽水恢復至 2mL 后，分別進行200、400、800、1600、3200倍稀釋。分別吸取稀釋后的血清 1.0mL ，與等體積的雞傳染性支氣管炎病毒（H120株）稀釋液（ 100EID₅₀/0.1mL ）充分混合，室溫靜置 2h 。每個稀釋滴度的血清接種到11～12日齡的SPF雞胚尿囊腔，共接種6枚雞胚，每枚雞胚接種 0.2mL 。同時設立病毒對照雞胚6枚，每胚接種雞傳染性支氣管炎病毒 0.1mL （含100EID₅₀ ）；設立未接種血清的正常對照雞胚5枚，每胚各接種滅菌生理鹽水 0.2mL 。37℃培養箱孵化 145h ，每 6～8h 照蛋觀察并記錄雞胚死亡情況。培養到 145h 時，對所有雞胚進行剖檢，當病毒對照胚全部死或出現特異性病變而正常對照胚全部健活時，試驗成立。按Reed-Muench法計算血清的中和效價。

2.11特異性檢驗-抗體檢驗按2.4進行各類病原抗體檢驗，應均為陰性。

3結果

3.1隔離器熏蒸消毒效果驗證結果見表2所示。

注：指示劑由菌片和恢復培養基兩部分組成。經甲醛氣體滅菌后，若滅菌完全，菌片上不長菌，培養基顏色不變；若滅菌不完全，有菌生長，培養基顏色由紅色變為黃色。

3.2動物飼養過程中外源病毒監測結果統計結果見表3所示。

3.3分裝過程中無菌檢驗

分裝過程前、中、后，取樣經無菌檢驗，均無細菌生長，檢驗結果為合格。

3.4凍干后血清檢驗結果

凍干血清檢驗結果見表4。

3.5中和抗體檢驗

經檢驗，各階段IB陽性血清中和抗體效價均gt;1：200 ，符合相關要求，本次制備IB陽性血清約 6000mL 。制成的IB陽性血清中和抗體效價見表5。

3.6特異性檢驗

除雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）抗體外，MDV、NDV、H5亞型、H9亞型、IBDV、AILTV、ARV、CIAV、ALV-AB、ALV-J、REV、AEV、EDS、FPV等抗原抗體均未檢測到。凍干血清特異性檢驗結果見表 6。

4討論

本試驗呈現了國家參考品雞傳染性支氣管炎陽性血清（檢驗用）制備的整體試驗流程。作為標準參考品，血清抗體水平的高低很關鍵。此外，IB血清的純凈性、血清制備前期準備工作不容忽視，尤其是對環境控制。例如，隔離器熏蒸效果直接關系到后續實驗動物飼養環境的安全性；合理控制雞舍飼養密度和環境溫濕度，有利于實驗動物的健康生長，進而保證血清質量；嚴格規范人員和物品進出以及對實驗動物分區飼養，能有效避免外源病毒污染；實驗過程中和試驗結束后期，對廢棄物進行無害化處理，確保環境無外源病毒殘留，這是保證血清制備純凈性的關鍵環節[4]。

通過上述一系列措施的有效實施，保證了國家參考品雞傳染性支氣管炎陽性血清（檢驗用）試驗的順利開展。由于IB陽性血清效價提升較慢且不易產出高效價血清，因此本試驗采用首次免疫H120株活毒刺激了雞只體內的細胞免疫，后續二免、三免用M41株油佐劑滅活苗進行多點位免疫，以此激發了雞只體內的體液免疫，加快了IB類抗體的上升速度，為獲取高質量的陽性血清奠定了基礎[5]。

5結論

本試驗成功完成了國家參考品雞傳染性支氣管炎陽性血清（檢測用）的制備工作，所制成的血清在純凈度、抗體效價和血清量等方面均達到了預期要求。通過開展試驗前環境消毒、SPF雞篩選、免疫接種、環境控制、采血、血清分離、過濾、滅活、分裝、凍干以及相關檢測操作，建立了一套完整的血清制備及檢定方法。該方法為新城疫、禽流感、馬立克、法氏囊等其他陽性血清的制備提供了重要參考依據。

參考文獻：

[1]張娜，張文芳，李曉靜，等.抗雞新城疫病毒特異性血清制備的研究與鑒定[J].畜禽業，2023，34（4）：1-5.

[2]孔冬妮，侯力丹，劉丹，等.雞傳染性支氣管炎病毒H120株和H52株種毒的制備與鑒定[J].動物醫學進展，2019，40（12）：6-11.

[3]孫守峰.雞傳染性支氣管炎的診斷和控制[J].中國畜牧業，2024（3）：115-116.

[4]夏立業.雞傳染性支氣管炎診斷方法的研究進展[J].家禽科學，2023，45（8）：70-73.

[5]王國榮，李豐耘，王國成.雞傳染性支氣管炎發展現狀與防治措施[J].家禽科學，2025，47（02）：91-93.