一株雞源星狀病毒的分離鑒定及致病性研究

中圖分類號：S858.31 文獻標識碼：B 文章編號：1673-1085（2025）06-0079-05

（動物基因工程疫苗國家重點實驗室/青島易邦生物工程有限公司，山東 青島266114）

禽星狀病毒可感染多種禽類，導致雞、火雞和珍珠雞出現(xiàn)生長發(fā)育緩慢和生產(chǎn)力下降等癥狀，同時還能引發(fā)鴨的病毒性肝炎[]。其中雞星狀病毒能引發(fā)雞腹瀉性腸炎、胃炎，是導致其發(fā)育遲緩、生產(chǎn)力下降的病原體之一，常與其他腸道病毒混合感染。雞星狀病毒在世界各地存在較為廣泛的感染現(xiàn)象，在我國局部地區(qū)感染率高，對我國養(yǎng)禽業(yè)造成了一定的經(jīng)濟損失[2-3]。星狀病毒有一個長 7kb 的單鏈陽性RNA，無包膜，圓形，直徑28～30nm 。病毒粒子呈20面體對稱，病毒外表含有5個或6個突起結構，研究表明其突起結構具有pH依賴性[4-5]。星狀病毒大多存在于腸道中，性質(zhì)極其穩(wěn)定，由于沒有囊膜，大多數(shù)的酚類物質(zhì)、酸類物質(zhì)、醇類物質(zhì)、酯類溶劑等均無法使其完全失活，三氯甲烷、氨水、大多數(shù)清潔劑也無法使其完全失活。研究表明，甲醛、 β -丙內(nèi)酯、90% 甲醇和含有過硫酸鉀的清潔劑可限制星狀病毒的傳染性。試驗證實，星狀病毒在4℃環(huán)境可存活數(shù)周，將病毒保存至-20℃或 -70℃ ，可保持病毒活性。在實驗室中，可使用 90% 甲醇溶液或 β 1丙內(nèi)酯使星狀病毒完全失活[6-7]。

目前，星狀病毒分為哺乳動物星狀病毒和禽星狀病毒兩大類。相對于哺乳動物星狀病毒，禽星狀病毒的研究相對較少。20世紀90年代，人們首次在雞糞便中發(fā)現(xiàn)類似星狀病毒的病毒粒子。此后，世界各地均有發(fā)現(xiàn)，還常與其他腸道病毒發(fā)生混合感染[8-10]。我國各地雞群中也檢測到雞星狀病毒的存在，呈現(xiàn)感染雞群分布范圍廣、局部地區(qū)感染率高等特點[11-12]。病雞和帶毒雞均是雞星狀病毒的傳染源。該病毒極易在幼禽中流行，其他各時間段的雞也易感。病毒種間傳播的現(xiàn)象常有發(fā)生，在肉雞、火雞、珍珠雞等家禽中均可傳播。宿主感染星狀病毒后，有時無臨床癥狀，因此對該病毒在種間傳播需要進一步研究。臨床實踐中星狀病毒既可經(jīng)卵向子代垂直傳播，也可通過糞口途徑水平傳播，這給該病毒的防控提出了更大的挑戰(zhàn)[13-15]。

本研究采用雞肝癌細胞（LMH）從臨床疑似患病樣品中分離出一株雞源星狀病毒，并對分離株病毒鑒定、致病性研究，旨在為科學防控雞源星狀病毒感染提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1 病料采集 病料來自于山東某養(yǎng)雞場的患病雞。

1.1.2細胞系細胞系均由本實驗室保存提供，SPF雞胚購自北京勃林格殷格翰維通生物技術有限公司，由本實驗室自行孵化至所需日齡。

1.1.3主要試劑DMEM培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基、新生牛血清、 0.25% 胰酶，購自Gibco公司；PBS緩沖液，購自北京索萊寶科技有限公司；RNA提取試劑盒，購自BioFlux公司;RNAisoPlus、M-MLV反轉錄酶、Prime STARMax 高保真酶、One StepPrimeScriptRT-PCRKit（PerfectRealTime），購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1病料處理無菌采集患病雞病變的肝臟、腎臟，剪碎研磨，按1：3比例加入無菌生理鹽水勻漿處理，勻漿液放置-20℃冰箱反復凍融3次，3 000rpm 離心 20min ，取組織上清液無菌分裝，置-80℃低溫冰箱保存，用于病毒分離。1.2.2病毒分離與傳代LMH細胞從液氮中取出后迅速放入37℃水浴鍋中畫大圈使其快速融化，融化后將細胞懸液加入到 25cm² 細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，將生長液緩慢加入細胞懸液中，放入溫室靜止 3h 后觀察貼壁情況并換液，置37℃、 5%CO₂ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)；LMH細胞培養(yǎng)約 72h 長滿單層后傳代，傳代后培養(yǎng) 48h 用于接毒，將1.2.1的樣品處理液經(jīng) 0.22μm 針式濾器過濾后接種于長滿單層的LMH細胞，加入維持液置37℃、 5% （204號 CO₂ 培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，觀察病變。

1.2.3 病毒鑒定 依據(jù)發(fā)表的雞源星狀病毒的基因序列設計引物，由上海生工生物工程有限公司合成后，預期擴增片段大小為 750bp 。

Trizo 法提取病毒RNA，具體操作如下： ① 取少量細胞的接毒液，加入1mLTrizol，充分震蕩混勻，室溫靜置 10min ； ② 用RNase-free槍頭加入 400μL 氯仿，充分混勻后4℃靜置 10min ， 12000r/min 離心 15min ，吸取 500μL 水相上清轉置于 1.5mL RNase-free離心管中；④ 向離心管中加入 500μL 預冷的異丙醇后，顛倒混勻，置于 -20'C30min ，以沉淀RNA； ， 12 000r/min 離心 10min ，棄去管內(nèi)溶液，加入 1mL DEPC水配置的 75% 乙醇； ， 12000r/min 離心 5min ，棄去管內(nèi)溶液，倒置離心管，以晾干管內(nèi)剩余水分； ⑦ 向管內(nèi)加入 25μL RNase-free水，移液器吹打使沉淀溶解;⑧55C～60（ 孵育 10min ，樣品保存于 ，備用。

RT-PCR反應體系為 2× one-Step ReactionSolution 25μL ，one Step Enzyme Mix 2μL ，引物（ 0.4μM ）各 1μL ，RNA模板 1μL ， 20μL ，共 50μL 。反應程序如下： 后，94C2min ， ， 55C30s ， .進行30個循環(huán)；最后 延伸 10min 。 1% 瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進行鑒定。

1.2.4病毒部分生物學特性研究 ① 對雞胚的致病性：分離的細胞毒經(jīng)尿囊腔接種10.5日齡SPF雞胚，每胚 0.1mL ， 孵化7d，每天觀察1次，觀察 24h 后死胚的病變； ② 細胞制備或傳代按殷震法進行，將分離毒分別接種Vero、ST、PK、DF1、BHK等原代或傳代細胞單層， 1 5%CO₂ 培養(yǎng) 3～5d ，同時設未接毒的正常細胞對照。每日觀察，當細胞病變達 75% 時收獲細胞，凍存或連續(xù)盲傳三代。

2結果

2.1病毒分離

病料在LMH細胞上連續(xù)傳代，傳至第3代時

細胞開始出現(xiàn)明顯病變，出現(xiàn)融合、空泡等細胞病變，見圖1。

2.2病毒基因鑒定

通過PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結果可見，病料接種LMH細胞后，收獲的細胞病毒液可擴增到大小約為 780bp 的特異性目的條帶，符合預期結果，結果見圖2。

2.3對雞胚的致病性

經(jīng)尿囊腔接種10.5日齡SPF雞胚，每胚0.1mL ，37℃孵化7d后剖檢，發(fā)現(xiàn)對照組肝臟、脾臟均正常，接毒組雞胚肝臟發(fā)綠且有白色斑點，脾臟腫大發(fā)紅，結果見圖3～4。

注：A：未感染雞胚的正常肝臟；B：感染雞胚的病變肝臟；C：未感染雞胚的正常脾臟；D：感染雞胚的病變脾臟。

2.4對細胞的致病性

分離株在Vero、Marc-145、DF1細胞上連續(xù)盲傳3代無明顯的病變產(chǎn)生，在BHK細胞上有明顯的CPE產(chǎn)生，見圖4。

3討論

禽星狀病毒屬成員均感染禽類。病毒感染經(jīng)常涉及腸道之外的損傷，如對肝、腎或免疫系統(tǒng)的傷害。鴨源星狀病毒通常引起鴨的致死性肝炎。星狀病毒感染火雞和雞，影響多個組織包括腎和淋巴。雞胚絨毛尿囊膜盲傳后，病毒可在受孕的禽卵中生長[16-19]。目前對人星狀病毒的研究較為成熟，甚至已經(jīng)出現(xiàn)商品化的檢測試劑盒，但是對于禽星狀病毒，因研究時間短，病毒難以培養(yǎng)的特性，還有眾多需要研究的難點。且星狀病毒因其感染特性，抑制宿主生長，因而很難用細胞繁殖培養(yǎng)。

注：A：感染病毒的Vero細胞未出現(xiàn)細胞病變；B：感染病毒的Marc-145細胞未出現(xiàn)細胞病變；C：感染病毒的DF1細胞未出現(xiàn)細胞病變；D：感染病毒的BHK細胞出現(xiàn)明顯的細胞融合、拉網(wǎng)。

本試驗通過LMH細胞分離鑒定獲得一株雞源星狀病毒，并研究其生物特性，結果表明此分離株對雞胚有明顯的致病性，且在BHK細胞上產(chǎn)生明顯的病變，為后期雞源星狀病毒的疫苗研究奠定了基礎。

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Isolation， Identification and Pathogenicity of a Chicken Stellate Disease

YANG Xiangfang，WU taihang （StateKeyLaboratoryofAnimal Genetic EngineeringVaccines/Qingdao YibangBioengineering Co， LTD.，Qingdao 266114，China）

Abstract：To isolate and study chicken astrovirus.A virus strain was isolated from the liver of dead chicken and was identified as astrovirus by RT-PCR and sequencing.Some of its biological characteristics were studied.The proliferation of chicken stellarvirus on Vero，ST，PK and DF1 cells was not obvious，but it could produce obvious cytopathia on chicken hepatocytes.At the same time，the chicken embryo was inoculated with the virus and it was found that the chicken embryo died，and the chicken embryo was dissected and the liver was green with white spots and the spleen was red and swollen.The isolated strain was inoculated onto BHK cells，which could produce obvious CPE.In this study，a chicken astrovirus strain was obtained by isolation and identification，and its biological characteristicswere studied，which showed that this strain has obvious pathogenicity to chicken embryos，laying a foundation for the research of avian astrovirus vaccine。

Keywords：Astrovirus;Isolation and Identification;Cytopathy;Virus content; Chicken embryo