管花秦蘇可培養內生真菌的分離與鑒定

植物內生真菌是指全部或者部分生命周期發生在宿主植物體內，不會引起任何明顯疾病病癥的微生物1，在長期協同發展進化過程中，內生真菌與植物形成互惠共利的關系[2]。一方面，宿主植物能夠提供內生真菌生長繁殖所必需的微環境和營養物質[3-4]。另一方面，內生真菌可通過產生吲哚乙酸（indole-3-aceticacid，IAA）和減少乙烯合成促進植物種子萌發及根、莖、葉的生長[5]，同時也能通過調節活性氧協助植物抵抗逆境脅迫[]；此外，內生真菌通過真菌誘導子刺激植物次級代謝產物的生物合成，并在植物代謝過程中將某些關鍵基因垂直傳遞給內生真菌，導致真菌產生與其宿主植物相同或相似的代謝產物[6-7]。因此，了解植物內生真菌多樣性不但對于研究宿主植物一微生物互作關系具有重要意義，而且對其開發利用也具有重要價值。

管花秦蘇（Gentiana siphonantha Maxim.）隸屬于龍膽科（Gentianaceae）龍膽屬（GentianaL.）秦蘇組（Sect.CruciataGaudin）的一種多年生草本植物[8]，主要分布在青藏高原及周邊地區，以根人藥，是重要的中藏藥材[9]。其主要含龍膽苦昔，在抗炎、鎮痛、調節免疫等方面具有重要作用[10-12]。高寒草甸是青藏高原最主要的草地類型，約占青藏高原草地面積的 46.7%^[13] ，因海拔高、氣候寒冷干旱、生長季溫度低、太陽輻射強度大等環境特點，植被遭受到較強的選擇壓力[14]。在長期的生物進化過程中，高寒植物通過形成獨特的調節機制、適應高原生境的形態和生理特性以應對寒冷和干旱脅迫[15-16]。研究表明，植物對脅迫的耐受性與其相關微生物有關[17]，與根際細菌的相互作用相比，寄主植物與內生菌的相互作用可直接影響植物特性[18]。

近年來，對秦蘇組植物的研究主要集中在藥理活性與質量標準[8]、近緣種進化關系[19]物種分布與生境之間關系[20]以及網絡藥理和分子動力學[21]等方面，而對管花秦蘇內生真菌及其與植物之間互作關系卻鮮有研究。管花秦作為典型的高寒草甸植物可能與其內生真菌形成了某種互作機制以適應寒冷干旱生境，因此了解管花秦芃內生真菌組成將有助于更好地解釋管花秦芃的高原生態適應機制。

本研究采用植物組織塊法分離開花期、生長于高寒草甸土壤中管花秦芃內生真菌，運用形態學和ITS序列進行內生真菌種屬鑒定并構建系統發育樹，探討管花秦蘇可培養內生真菌的多樣性，為下一步研究管花秦芃內生真菌與宿主植物的關系和篩選具有活性的菌株提供依據和基礎。

1材料與方法

1.1材料

于2023年8月，在青海省海北藏族自治州門源回族自治縣（東經 100^°99^′ ，北緯 37^°91^′ ，海拔3 435m 采集盛花期的整株野生管花秦蘇，并采集根系土壤，共采集樣本10份。樣品采集后低溫保存并帶回實驗室處理，經藥學院林鵬程教授鑒定為野生管花秦芃。

1.2方法

1.2.1植物組織表面消毒將樣品用流水沖洗干凈，用無菌濾紙吸干表面水分。表面消毒處理：用 75% 乙醇浸泡 3min ，無菌水沖洗 次， 8% NaClO溶液中浸泡 3～5min ，無菌水沖洗 3～5 次，用無菌濾紙吸干組織表面殘留的水分。

1.2.2內生真菌的分離純化將消毒完成的植物切成 0.5cm×0.5cm 組織塊，并接種至PDA培養基上。采用組織印跡法作為對照處理，觀察消毒是否完全。 28°C 恒溫培養 7～10d^[22] 后，用接種針挑取菌絲至新的PDA培養基上進行真菌純化，直至獲得單一菌株。

1.2.3內生真菌鑒定形態學鑒定：觀察并記錄PDA平血中菌落的直徑、顏色、形態，用乳酸酚棉蘭染液將菌絲體染色后觀察菌絲體及孢子形態對照《真菌鑒定手冊》23進行形態鑒定。分子生物學鑒定：采用新型植物基因組DNA提取試劑盒提取真菌DNA，采用真菌通用引物ITS1（ 5^′ -TC-CGATGGTGAACCTGCGG- ?3^′ ）和ITS4（ 5^′ -TC-CTCCGCTTATTGATATGC- 3^′ ）進行PCR擴增，擴增產物用 10g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測純度后，送上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.4ITS序列分析及系統發育樹構建將測序所得ITS序列在美國國家生物技術信息中心（NCBI）數據庫中進行Blast比對分析，使用MEGA11軟件采用鄰接法（neighbor-joiningmethod）構建系統進化樹。kimura 2-parametermodel計算進化距離，1000次重復檢驗發育樹的可靠性。用i-TOL軟件美化進化樹。

1.2.5 多樣性分析 在MEGA11軟件中，將所得序列前后嵌合堿基刪除，使每個序列長度約為520bp 。運用Mothur程序將共有序列相似度大于 97% 的同一序列劃分為同一個OTU，采用 Ex^- cel2010整理統計內生真菌定殖及種屬分類數據。基于OTUs豐度表，通過圖圖云平臺（www.cloudtutu.com）進行 α 多樣性、主坐標（PCoA）分析及非度量多維尺度（NMDS）分析。

1.3 統計方法

內生真菌定殖率、分離率、相對頻率、多樣性指數等指標主要反映內生真菌在管花秦蘇不同組織部位的分布情況。

定殖率（colonizationfrequrncy，CF）和分離率（isolationfrequrncy，IF）可衡量組織中內生真菌豐富程度及受多重侵染發生頻率。相對頻率（relativefrequently，RF）主要反映樣本內生真菌群落中某種內生真菌的優勢度。

定殖率 內生真菌定殖的組織塊數/全部組織塊數 ×100%

分離率 某一類群內生真菌菌株/分離樣品組織總塊數 ×100%

相對頻率 某種真菌菌株數/分離所得總菌株數 ×100%

α 多樣性分析主要反映單個條件下群落的物種豐富度和多樣性，主要包括Richness指數（D_R ，物種豐富度）、Shannon-Wiener多樣性指數（H^′ ，物種多樣性，主要針對優勢種）、Gini-Simpson多樣性指數 （1-D ，物種多樣性指數，主要針對稀有種）、Pielou均勻度指數（E，物種分布均勻程度）、Invsimpson 指數（ D_Invsimpson ，生態優勢度）、Chaol指數（ S_Chaol ，豐富度估計量）、ACE指數（ S_ACE ，基因豐富度）和goods_coverage指數（C，反映了測序深度），具體計算公式如下：

Richness指數：

Shannon-Wiener多樣性指數：

Gini-Simpson多樣性指數：

Pielou均勻度指數：

Invsimpson指數：

Chaol指數： ACE指數： goods_coverage指數：

P_i 表示第 i 個物種相對于所有物種的豐富度（即個體數/總個體數），其中， s 是樣品中OTUS數量， N 是序列總數， n₁ 是只有一條序列的OTU數目， n₂ 是只含有兩條序列的OTU數目， n_i 是第 i 個OTU所含有的序列數， S_abund 是高豐富度物種（豐度 gt;10）;S_rare 是稀有物種（豐度 ?10 且不為0）； F₁ 是豐度 =1 的物種（single-ton）， C_ACE 是樣本覆蓋度的估計值； γ²ACE 是稀有物種的變異系數。

2 結果與分析

2.1內生真菌分離結果

本研究從120塊（段）健康管花秦蘇組織中分離到了76株內生真菌（圖1），內生真菌總定殖率為 50‰ ，總分離率為 63.33% ，說明其內生真菌非常豐富。管花秦芃不同組織之間內生真菌定殖和分離亦存在差異，在根部分離得到24株菌，分離頻率為 80% ，花、莖、葉中分離得到16、20、17株菌，分離頻率分別為 53.33%.66.67% 和56.67% （表1）。

2.2管花秦內生真菌形態學鑒定

觀察并記錄菌株在培養過程中的形態特征，培養時間均為15d，形態學特征和菌絲顯微特征見圖1。將純化菌株的菌落特征與菌絲特性的觀察結果與《真菌鑒定手冊》進行比較，初步鑒定分離所得內生真菌，形態學特征描述見表2。菌株的顏色主要是棕色和黑色等顏色，菌落主要呈圓形，其次為橢圓形，菌絲大部分都很細長，通過菌落及顯微鏡菌絲形態初步鑒定劃分為63種，通過ITS序列分析進行分子生物學鑒定。

2.3管花秦蘇內生真菌ITS序列分析

有63株菌株根據菌株的ITS序列到Gen-Bank中尋找同源性 98% 的序列進行比對，再結合菌落和其他形態特征確定種級歸屬，其余13株可采用形態特征將其準確鑒定到屬，并歸類到上述菌株所在菌屬。經分析，76株管花秦芃生真菌歸屬在7個綱、11個目、19個科和22個屬共41種（表1），內生菌的種類非常豐富。從總體分離頻率分布來看，鏈格孢屬（Aternaria）（19.74% ）、鐮刀菌屬（Fusarium）（ （19.74% ）和曲霉屬（Aspergillus） （15.79%） ）為優勢菌群。分離部位的優勢菌群存在差異，曲霉屬（Aspergius）菌株在植物4個部位中均有存在，根中優勢菌屬為鐮刀菌屬（Fusarium）和曲霉屬（Aspergillus），花中為曲霉屬（Aspergillus）、鐮刀菌屬（Fusari-um）和木霉屬（Trichoderma），莖中為鐮刀菌屬（Fusarium）和鏈格孢屬（Alternaria），葉中為鏈格孢屬（Alternaria）和曲霉屬（Aspergillus）。

2.4管花秦內生真菌的系統發育分析

根據前述BLAST比對分析結果，選取22個屬的近緣種的菌株，相似度均大于 99% 。利用聚類分析MEGA11中的Neighbor-Joining程序構建系統發育樹，分析管花秦芃的內生真菌各菌株的親緣關系，結果如圖2所示。大部分菌株都屬于子囊菌門，其中有26株屬于糞殼菌綱，19株屬于座囊菌綱，錘舌菌綱最少只有1株。

NCBI中下載的相似菌株序列均與試驗獲得的菌種聚類在一起，表明這些菌株應為同一種屬。不同綱之間菌株明顯分開。系統發育樹顯示出各菌株與其相似菌株的關系與BLAST比對結果一致，各菌株分類位置清晰。

2.5 內生真菌 a 多樣性分析

不同組織部位管花秦蘇可培養內生真菌多樣性分析表明（圖3），不同組織所分離出來的內生真菌多樣性指數不同，其多樣性水平存在差異，管花秦蘇內生真菌的Richness指數、Shannon-Weiner多樣性指數及Simpson指數在不同組織之間的變化趨勢一致，根中的各指數最高，說明管花秦芃根中內生真菌擁有豐富的多樣性。

2.6管花秦內生真菌主坐標（PCoA）分析及非度量多維尺度分析（DMDS）

如圖4-A所示，管花秦芃不同組織內生真菌的PCoA分析中第一主成分解釋了群落結構22.88% 的方差，第二主成分解釋了 15.85% 的方差，第一、第二主成分共解釋了 38.73% 的方差。不同組織間內生真菌群落的置信區間有著顯著的偏差 （Plt;0.05） 。

不同組織內生真菌的NMDS分析如圖4-B所示，其應力函數值stress lt;0.2 ，表明其分析結果準確可靠。葉部位內生真菌與其他部位內生真菌彼此分離。

3討論

植物內生真菌的組成在促進植物健康和適應方面起著重要作用[24]。本研究從管花秦蘇中分離培養出76株內生真菌，經形態學鑒定和ITS序列分析鑒定分別屬于子囊菌門、擔子菌門和毛霉門，分別屬于7綱11目22屬。其中子囊菌門是管花秦蘇內生菌的優勢菌門，在屬水平上，鐮刀菌屬是根、花和莖部位的共同優勢屬。鏈格孢屬和曲霉屬在管花秦芃的4個部位中都存在（表2）。研究發現麻花蘇的優勢屬為鏈格孢屬和鐮刀菌屬[25，在紅花龍膽和粗莖秦蘇的根際土壤中，最優勢屬均為鐮刀菌屬[24，26]，這與本研究結果一致。同樣，相關研究也證明這些屬在藥用植物中普遍存在[26]。這可能與這些屬的菌株繁殖能力較強或培養方法有利于其生長有關。與其他屬相比，這些菌絲表現出加速的生長、提高的孢子形成率、更大的相對豐度和更廣泛的宿主范圍[25-27]。本研究從管花秦芃中分離得到的內生真菌很多是傳統病原菌，如鏈格孢屬和鐮刀菌屬，鏈格孢屬內生真菌可侵染多種農作物，從而給農業生產帶來巨大損失[28]。但作為內生真菌定殖時對宿主植物是有益的，可以促進植物生長或提高抗逆性[18]。鏈格孢屬內生真菌定殖鹽脅迫條件下的番茄植株具有更高的根莖生物量，同時還通過降低活性氧含量以應對鹽脅迫[29]。

能產生128個有開發利用價值的次級代謝產物，包括可開發利用次級代謝產物（抗蟲、抗菌和抗腫瘤）和其他有利用價值產物（抗病毒、抗炎癥、抗氧化、除草和抑制浮游生物）[30]。鐮刀菌是一類起源于印度，世界性分布的真菌，因其分生孢子呈船狀或月牙狀而得名，屬兼性寄生菌或腐生菌，具有分布范圍廣、產孢能力很強、生存力極強、遺傳性復雜、寄主品種多樣等特點[31-36]。從棉花中分離的鐮刀菌屬在平板對峙中能明顯抑制強致病力菌株大麗輪枝菌（Verticilliumdahliae）的生長，用發酵濾液灌根后可誘導棉花葉片中朕脹質積累，苯丙氨酸解氨酶基因、過氧化物酶基因和病程相關蛋白基因等基因的表達也有所上調[37]。曲霉菌屬（Aspergillussp.）也是常見的植物根際促生真菌種類之一，增強土壤肥力以及提高作物產量的同時還能改善土壤結構。王妍等[38]從根際土壤中篩選得到一株土曲霉（Aspergillusterreus）MR-97對尖孢鐮刀菌、木賊鐮刀菌、灰葡萄孢等8種常見病原菌具有較強的抑菌效果并對防風等中藥材作物有明顯的促生作用。張熙等[39]報道黑曲霉能產生脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶等。因此，這些優勢內生真菌菌屬在管花秦蘇的不同部位中具有獨特的生態位，可能對宿主的適應高原極端環境具有重要的作用。

值得注意的是，筆者分離的菌株中也有一些相對不常見的菌株，如假性小毛球屬（Chaet-osphaeronema）盾殼霉屬（Coniothyrium）、假鬼傘屬（Coprinellus）、亞球殼屬（Sphaerulina）淡領瓶霉屬（Cadophora）等。這些菌株可能由于寄生頻率低或培養條件不合適而具有低的分離頻率。王靜等[40]研究表明，輻毛小鬼傘（Coprinel-lusradians）能在兩個月內促進杜鵑蘭種子萌發長出原球莖，這可能是因為杜鵑蘭種子從共生真菌中獲得營養成分[41]，也可能是輻毛小鬼傘降解了杜鵑蘭種皮中的纖維素，導致萌發變得更容易[42]。暗隔膜內生菌（DSE）是子囊菌門中一類具有高黑色素生成活性的根定殖真菌。從加拿大西部云杉根中分離的淡領瓶霉（Cadophora sp.）的定殖能夠提升植物對磷和氮的吸收能力，顯著促進鹽脅迫下植物的生長[43]。盾殼霉屬（Conio-thyriumsp.）是核盤菌上一種重要的重寄生真菌[44]。其對于核盤菌菌核病的防治有著巨大的應用潛力，同時對人畜安全、對環境無污染，無殘留，是最具有潛力的生防農藥之—[45]。王慶云[46]用盾殼霉發酵液浸種向日葵種子后，發現向日葵的株高，干質量顯著提升，葉片內SOD活性顯著高于對照。這些菌株也代表了新微生物資源的重要來源。研究表明，稀有類群在真菌共生網絡和生態系統功能（包括作物產量和土壤酶活性）中發揮著重要作用[47]。

在 α 多樣性分析中，管花秦芃不同部位分離得到的內生真菌組成有明顯的差異，根和莖真菌多樣性高于花和葉，根中的真菌豐富度也最高，花和葉的真菌多樣性（Shannon和Simpson）沒有顯著差異。PCoA分析和DMDS分析也表明，不同組織間內生真菌群落的置信區間有著顯著的偏差。內生真菌在根中的定殖率比較高，這與麻花蘇內生真菌的分布結構相似[25]，這可能是由于與地上部分相比，地下部分表現出更長的存活時間。且在植物整個生命周期中，根部生長發育最早，發育時間也最長，有利于真菌的生長定殖，且根際土壤環境復雜，真菌和細菌種類豐富土壤中存在的大量真菌亦可人侵根部組織從而演變為內生真菌[48]。也可能是由于植物不同組織內部的物理和生化屏障引起的強烈選擇壓力[49]。此外，花的內生真菌多樣性略大于葉，這與燈盞花各組織內生真菌組成結構中相似[50]，可能是因為花是植物的繁殖器官，具有復雜的結構和功能，這些結構可能為內生真菌提供更多的生態位和生存空間，且花之間的傳粉也可能促進內生真菌的傳播，從而促進了內生真菌的多樣性。由于大量的內生真菌不能培養或未分離到，受限于數據量的限制也可能會造成莖、葉和花中真菌數量較少。

4結論

本研究從生長于高寒草甸的管花秦芃中共分離并鑒定得到76株內生真菌，結合形態學鑒定以及真菌ITS序列分析發現分屬于7個綱、11個目、19個科、22個屬共41種。其中鏈格孢屬（Al-ternaria）和鐮刀菌屬（Fusarium）是其優勢菌屬。多樣性結果表明，管花秦可培養內生真菌的分布存在明顯組織差異。不同組織部位的內生真菌多樣性由大到小為根 gt; 莖 gt; 花 gt; 葉，且根中的多樣性顯著高于葉。

參考文獻 Reference：

[1]SARKARS，DEYA，KUMARV，etal.Fungai endophyte：aninteractiveendosymbiontwith the capabilityofmodula-tinghostphysiologyinmyriadways[J].FrontiersinPlantScience，2021，12：701800.

[2] 王橋美，嚴亮，胡先奇，等.茶輪斑病對茶樹葉片內生真菌群落結構的影響[J].微生物學報，2021，61（9）：2949-2961.

[3] LUY，ZHUJ，ZHAOXX，etal.Beneficialeffectsofendo-phytic fungicolonizationonplants[J].Applied Microbiolo-gyand Biotechnology，2019，103（3）：3327-3340.

[4] 劉圣越，王躍飛，何永志，等.內生真菌對宿主植物生長和次級代謝產物影響研究進展[J].天津中醫藥大學學報，2021，40（1）：128-136.

[5] AHLEMN，RANIAABA，HAYFAJK，eta.Abilityofendophytic fungiassociated withWithania somnifera L.tocontrol Fusariem crown and root rot and to promote growthintomato[J].BrazillianJournalofMicrobiology，2019，50（2）：481-494.

[6] LUBNAB，SAJJADA，MUHAMMADH，eta.Plantgrowth promoting endophytic fungi AsprgillusfumigatusTS1and FusariumproliferatumBRL1 producegibberellinsandregulatesplantendogenous hormones[J].Symbiosis，2018，76（17） ：117-127.

[7]DANG H L，ZHANG T，WANG Z K，et al. Succession ofendophytic fungi and arbuscular mycorrhizal fungi associat-ed with the growth of plant and their correlation with sec-ondary metabolites in the roots of plants[J].BMC PlantBiology，2021，21（1）：165.

[8]曹曉燕，王喆之.HPLC測定管花秦蘇不同部位龍膽苦苷的含量[J].中成藥，2009，31（11）：1792-1794.

[9] 王環，司慶文，沈建偉，等.麻花蘇、管花秦蘇和黃管秦蘇種子萌發特性比較[J].西北林學院學報，2019，34（2）：122-128.

[10] 中國科學院西北高原生物研究所.藏藥志［M].西寧：青海人民出版社，1991.

[11] 國家藥典委員會.中國華人民共和國藥典[M].一部.北京：中國醫藥科技出版社，2015.

[12]] 穆楨強，于洋，高昊，等.龍膽屬秦蘇組植物的化學成分和藥理作用研究進展[J].中國中藥雜志，2009，34（16）：2012-2016.

[13]：李軍豪，楊國靖，王少平.青藏高原區退化高寒草甸植被和土壤特征[J].應用生態學報.2020，31（6）：2109-2118.

[14]GENG Y，WANG Y，JIN D M，et a. Alpine climate altersthe relationships between leaf and root morphologicaltraits but not chemical traits[J].Oecologia，2o14，175（2）：445-455.

[15］張銀霞，褚紅麗，趙方媛，等.飼草型小黑麥品種（系）的抗寒生理生化指標評價[J].西北農業學報，2024，33（12）：2231-2243.

[16] 田卜伊.4種紫花苜蓿逆境脅迫下生長及生理特征研究[D].陜西楊凌：西北農林科技大學，2023.

[17] 陳娜.醉馬草遺傳多樣性及內生真菌對其抗寒性影響[D].蘭州：蘭州大學，2008.

[18] 劉艷萍，張得芳，文懷秀.鹽堿土壤中唐古特白刺內生真菌分離與鑒定[J].西北農業學報，2024，33（7）：1375-1385.

[19] 張小蘭，葛學軍，劉建全，等.粗莖秦蘇與西藏秦蘇（龍膽科）種間的形態學、染色體與分子界定[J].植物分類學報，2006，44（6）：627-640.

[20] 李佳峰.秦蘇及近緣種龍膽苦苷積累與環境因子相關性的研究[D].西安：西北大學，2012.

[21]孫建國，李慧娟，寶文萍，等.網絡藥理學、分子動力學和實驗驗證探究秦蘇環烯醚萜苷抗類風濕性關節炎關鍵成分和作用機制[J].中草藥，2024，55（17）：5853-5866.

[22]DOS REIS JB A，LORENZI A S，DO VALE H MM.Methods used for the study of endophytic fungi：a reviewon methodologies and challenges，and associated tips. Archives of Microbiology.2022，204（11） ：675.

[23]魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上海科技出版社，1979.

[24]張曉勇，李樹江，嚴凱，等.紅花龍膽內生真菌多樣性分析及抑菌活性菌株篩選[J].分子植物育種，2021，19（14）：4714-4725.

[25]CHENG T F，LIN P C，ZHOU D W，et al. Distributionand diversity of cultured endophytic fungi in Gentianastraminea Maxim.at different altitudes on the northeast-ern Qinghai-Tibetan Plateau[J].Frontiers in Microbiolo-gv. 2024.15：1466613.

[26]EGIDI E，DELGADO-BAQUERIZO M，PLETT JM，et al.A few Ascomycota taxa dominate soil fungal com-munities worldwide[J]. Nat Commun，2019，1o（1） ：2369.

[27]XULL，LING XF，ZHAO SJ，et al.Distribution and di-versity of endophytic fungiin Gentiana rigescensand cyto-toxic activities[J]. Chinese Herbal Medicines，2020，12（3）：297-302.

[28]WOUDENBERG J H，GROENEWALD J Z，BINDER M，etal.Alternaria redefined[J].StudiesinMycology，2013，75（1）：171-212.

[29]AZAD K， KAMINSKYJ S. A fungal endophyte strategyfor mitigating the effect of salt and drought stress on plantgrowth[J].Symbiosis，2016，68（1/3）：73-78.

[30] 秦飛飛，張婕.鏈格孢屬真菌中有開發潛力的活性次級代謝產物研究進展［J/OL].天然產物研究與開發，1-23[2024-11-18].

[31]O'DONNELL K，CIGEKNIK E，NIRENBERG H 1. Mo-lecularsystematics andphylogeographyof theGibberellafujikuroispeciescomplex[J].Mycologia，1998，90（3）：465-493.

[32]PLOETZ R C.Fusarium wilt of banana is caused by sever-al pathogens referred to as Fusarium oxysporum f. sp.cubense[J].Phytopathology，2006，96（6）：653-656.

[33]NEPHALELA-MAVHUNGA M，KWINDA G T，SUM-MERELLBA，etal.Geneticdiversityof theFusariumoxysporum complex isolated from the grassland biome ofSouth Africa[J]. Phytopathology.2021，111（8）：1459-1469.

[34]張素軒.鐮刀菌屬分類進展[J].真菌學報，1991，10（2）：85-94.

[35] 林鎮躍，闕友雄，劉平武，等.植物致病鐮刀菌的研究進展[J].中國糖料，2014（1）：58-64，78.

[36] 王獻慧，魏林，梁志懷，等.鐮刀菌屬遺傳多樣性的 ISSR分析[J].長江蔬菜，2012（16）：12-15.

[37] 孫百川，趙麗紅，張亞林，等.內生鐮刀菌CEF-321對棉花黃萎病的防治作用及機理[J].中國棉花，2024，51（10）：15-20.

[38] 王妍，張福軍，孫卓，等.防風枯萎病拮抗真菌的篩選鑒定及防效評價[J].華南農業大學學報，2023，44（2）：263-26.

[39] 張熙，韓雙艷.黑曲霉發酵產酶研究進展[J].化學與生物工程，2016，33（1）：13-16.

[40]王靜，潘長能，王淙薇，等.輻毛小鬼傘對杜鵑蘭種子萌發的促進作用[J].中藥材，2023，46（11）：2658-2662.

[41] ZAHN F E，LEE Y L，GEBAUER G. Fungal associationandrootmorphology shift stepwise during ontogenesis oforchid Cremastra appendiculata towards autotrophic nu-trition[J].Aob Plants，2022，14（3）：21.

[42]HYNSON N A，SCHIEBOLD J M，GEBAUER G. Plantfamily identity distinguishes patterns of carbon and nitro-gen stable isotope abundance and nitrogen concentration inmycoheterotrophic plants associated with ectomycorrhizalfungi[J].Annals of Botany，2016 ，118（3）：467-479.

[43]GABER D A，BERTHELOT C，BLAUDEZ D，et al. Im-pactofdark septate endophytes on salt stressalleviation oftomatoplants[J].FrontiersinMicrobiology.2o23，14：1124879.

[44] 葛平華，馬桂珍，付泓潤，等.油菜菌核病的生物防治研究進展[J].北方園藝，2013（2）：185-187.

[45] LIGQ，HUANGHC，MIAOHJ，eta.Biologicalcontrolofsclerotinia diseases of rapeseed by aerial applicat ions ofthe mycoparasite of Coniothyrium minitans[J].EuropeanJournalofPlantPathology，2006，11l：345-355.

[46] 王慶云.盾殼霉發酵物對向日葵的促生作用及SOD活性的影響［J].山西農業科學，2014，42（12）：1274-1275，1282.

[47]XIONG C，HEJZ，SINGH BK，et a.Rare taxa maintainthestability ofcrop mycobiomesand ecosystem functions[J].EnuironmentalMicrobiology，2021，23：1907-1924.

[48] TAYLORJE，HYDEKD，JONEE.Endophyticfungias-sociatedwiththetemperatepalm，Trachycarpusfortunei，within and outside its natural geographic range[J].NewPhytologist，1999，142（2）：335-346.

[49] HACQUARD S，GARRIDO-OTER R，GONZALEZ A，etal.Microbiota and host nutrition acrossplantand ani-mal kingdoms[J].CellHostamp; Microbe，2015，17（5）：603-616.

[50] 趙祎，石瑤，湯雯婷，等.燈盞花內生真菌多樣性、群落結構及生態功能預測[J].微生物學通報，2023，50（11）：4812-4824.

Isolation and Identification of Culturable Endophytic Fungi from Gentiana siphonantha Maxim

HU Xingqiang ^1，2 ， ZHENG Kun1，2，YE Xing1，2 and ZHOU Dangwei1，2.3 （1.CollgofPharmacyQinghaiMinzuUniversity，Xiningoo7，China；2.KeyLaboratoryofPhytochemistryofQinghai-ibetan Plateau，Xining1oo7China；3.ServiceStationofSci-TechCommisioner，Hiyan County，Haibei Qinghai822Cina）

Abstract To investigate the species composition and tissue一specific distribution of culturable endophytic fungi in Gentiana siphonantha Maxim，endophytic fungi were isolated from plants growing in alpine meadows using a tissue segment isolation method. The isolated fungi were identified based on morphological characteristics，ITS sequence analysis，and phylogenetic reconstruction. A total of 76 strains were obtained from roots，stems，leaves，and flowers，representing 7 classes，1l orders，19 families，22 genera，and 4l species. Among these，Alternaria （19.74% ），Fusarium（ 19.74% ），and Aspergillus （15.79% ）were identified as the dominant genera. The diversity analysis of endophytic fungi in different tissues of G . siphonantha showed that the highest diversity index occurred in roots，followed by stems，flowers，and leaves. Although the distribution of endophytic fungi varied among tissues，the roots were identified as the primary site of colonization and infection. This study provides a preliminary yet comprehensive overview of the diversity of culturable endophytic fungi associated with G . si? phonantha ，and also lays a foundation for their further development and application.

Key words Gentiana siphonantha Maxim. ; Endophytic fungi; Isolation; Identification; Diversity

Received 2024-11-20 Returned 2024-12-09

Foundation itemQinghai Province Science and Technology Commissioner Specialist Project （No. 2024-NK-P11）.

First authorHU Xingqiang，male，master student. Research area：microbiology. E-mail：2896696938 @ qq. com

Corresponding authorZHOU Dangwei，male，Ph. D，professor. Research area： plant molecular biology.E-mail ：dangweizhou@sina. com

（責任編輯：史亞歌 Responsible editor：SHI Yage）