脂氧合酶編碼基因LOX3克隆及其在鮮切芋頭褐變中的作用

鮮切果蔬具有方便快捷、干凈衛生、可食率高、營養新鮮等優點，深受消費者青睞[1-2]。外表皮是果蔬的天然保護組織，可使果蔬免受病原菌和環境因子對其生理生化造成的不利影響。但對鮮切果蔬產品而言，采后經清洗、去皮和切分等加工處理后，鮮切產品失去了外表皮的保護[3]。鮮切加工還擾亂了果蔬正常的生理代謝活動，導致其呼吸作用加強，乙烯釋放量增加，抗病性降低，極易被環境中的病原菌侵染[4]。因此，鮮切果蔬在貯藏期間更容易腐爛變質，保持鮮切產品商品性一直是食品加工領域的研究熱點。其中，切面褐變是影響鮮切果蔬商品性的關鍵因素之—[5-6] 0關于鮮切果蔬褐變的發生原因，目前比較認可兩種理論：一種是切分處理通過苯丙烷途徑誘導黃酮類物質的合成積累，在產品切面形成黃褐色的褐斑[7-8]；另一種是切分處理破壞了細胞區室化作用，使得酚酶與底物直接接觸反應生成黃褐色的醌類物質，是造成大部分果蔬褐變的主要原因[9-10]。

近幾年的研究表明，細胞膜脂過氧化與鮮切果蔬褐變密切相關[11]。細胞膜脂過氧化會造成細胞膜的流動性和完整性降低，增加底物與酶直接接觸的幾率，加速酶促褐變反應[12]。脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）是一類含非血紅素鐵的雙加氧酶，能催化多不飽和脂肪酸形成含有共軛雙鍵的氫過氧化物，是催化多不飽和脂肪酸氧化的主要酶[13-15]。植物LOX能以細胞膜脂中的亞油酸和亞麻酸為底物發生加氧反應，導致膜脂過氧化[16]。不同品種的梨鮮切后，LOX活性高的品種更容易褐變，而不飽和脂肪酸含量高的品種則不易褐變[1]。硫化氫處理可能通過抑制鮮切梨LOX活性，降低丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，從而緩解其褐變[17]。這些研究結果暗示，LOX介導的膜脂過氧化是加速鮮切果蔬褐變的重要原因。但植物LOX一般是多基因家族，哪些LOX基因與鮮切果蔬褐變密切相關，目前的研究報道十分有限。

芋頭[Colocasiaesculenta（L.）Schott]是天南星科多年生塊莖植物，球莖中富含淀粉，是熱帶、亞熱帶地區廣泛栽種的根菜類蔬菜[18]。中國是除非洲外的最大芋頭生產國和消費市場，由于兼具營養和食療價值，芋頭在中國消費量逐年增加[19]。但芋頭中的草酸鈣含量很高，消費者在去皮切分時極易產生皮膚過敏癥狀，不利于擴大芋頭消費[20]。在產地或加工中心鮮切包裝后再銷售，可避免皮膚過敏問題，能促進芋頭的產業升級和消費擴大[21]。與鮮切馬鈴薯、山藥、蓮藕等淀粉含量高的根莖類蔬菜相似，切面褐變嚴重影響鮮切芋頭的商品性和貨架期[22]。但LOX介導的膜脂過氧化是否與鮮切芋頭褐變有關，仍未見相關報道。

本研究比較貯藏溫度對鮮切芋頭褐變的影響，并基于轉錄組學數據分析LOX家族基因在鮮切芋頭褐變過程中的表達模式。在轉錄組測序結果的基礎上克隆LOX3基因，并分析序列特性及其在褐變過程中的表達情況，以期探究LOX3表達在鮮切芋頭褐變的作用，為新型鮮切芋頭褐變防控技術的研發奠定理論基礎。

1材料與方法

1.1 試驗材料與處理

1.1.1試驗材料供試芋頭購自農貿市場，挑選無機械傷和病蟲害的芋頭作為試驗材料。自來水清洗干凈表面的泥沙后，用去皮刀去掉外表皮，然后將去皮芋頭橫切成約 1cm 厚度，待用。

1.1.2試驗處理不同溫度貯藏試驗：將芋頭片隨機分成2組，盛裝在一次性塑料托盤。一組貯藏在 ，另一組貯藏在 4^°C 。每組含30片，3個重復（每重復10片），用普通家用保鮮袋密封包裝。

抗褐變劑處理試驗：將芋頭片隨機分成3等份，每份30片。對照（CK）組用自來水浸泡處理30min ，另2組分別用 0.1g/L 的肉桂酸（cin-namicacid，CA）和香草酸（vanillicacid，VA）溶液浸泡處理 30min 。處理完后室溫瀝干表面水分，用保鮮袋密封包裝，貯藏于 4^°C 恒溫培養箱。每隔2d測定色度、拍照和取樣，樣品用液氮速凍貯藏于一 80^°C 冰箱。

1.2 試驗方法

1.2.1 色度測定使用美能達CR-400型色差儀測定色差值 （L^?，a^?，b^?） ，分別在每片芋頭的

3個不同部位測定1次，3次測定結果的平均值代表該片芋頭的色度。褐變癥狀由數碼相機拍照固定，褐變指數（browningindex，BI）計算公式如下[23]：

其中

1.2.2芋頭 LOX3 基因全長克隆總RNA提取和cDNA合成的方法參照文獻［24]。根據轉錄組測序組裝的編碼序列（codingsequence，CDS）設計克隆引物，以芋頭cDNA為模板，使用生工生物工程有限公司的Super-FidelityDNAPolymerase試劑盒（產品編號：B639292-0005），通過RT-PCR法擴增LOX3基因的全長序列。在PCR反應33個循環時加入普通PCR聚合酶，在PCR產物末端增加A尾。利用NCBI網站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的在線工具設計引物，引物序列見表1。

1.2.3生物信息學分析在Expasy網站分析蛋白理化性質，利用在線工具Cell-PLoc和CEL-LO工具預測亞細胞定位。在NCBI網站分析保守結構域。以推導的芋頭LOX3氨基酸序列為查詢序列，使用Blast功能依次在擬南芥、煙草和番茄基因組數據中查詢同源蛋白，利用DNAman軟件繪制多序列比對圖。在MEGA軟件中利用鄰接法構建系統發育樹，從TAIR網站下載擬南芥LOX家族蛋白序列，在NCBI網站獲取煙草、浮萍、番茄LOX3蛋白序列。

1.2.4芋頭LOX3表達分析使用熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測冷藏期間LOX3的表達模式，qRT-PCR步驟按照翌圣生物科技有限公司的試劑盒（產品編號：11201ES50）說明書進行，引物序列見表1。利用轉錄組數據分析CA和VA處理對LOX3表達的影響，用每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的片段數（fragmentsperkilo-base of exon model per million mapped frag-ments，FPKM）表示。

1.2.5LOX活性和MDA含量測定將 1.0g 芋頭樣品（液氮速凍）在5mI ，1×PBS 緩沖溶液中研磨成勻漿液，于 4^°C，11000r/min 離心15min，收集上清液用于測定LOX活性和MDA含量。在比色皿中加入 0.1mL 上清液、 、2.9mL 反應混合液（含終濃度為 0.1mol/L 乙酸鈉和2mmol/L 亞油酸鈉），立即在紫外風光光度計中記錄反應液在 234nm 波長下 3min 內的吸光度變化。LOX活性以 OD_234nm 值每分鐘變化10表示一個酶活性單位（U），結果通過U每千克鮮質量 （U/kg） 表示。使用生工生物工程有限公司的試劑盒（產品編號：D799761-0050），按照試劑盒說明書測定MDA含量。

1.2.6LOX3啟動子序列提取及元件分析通常默認翻譯起始密碼子（ATG）上游200Obp左右的DNA序列為該基因的啟動子序列[25]，為此，在芋頭基因組中查找了 LOX3 基因ATG上游約2000bp的DNA序列。在PlantCARE網站鑒定順式作用元件，使用TBtools軟件繪制逆境相關元件在啟動子上的分布。

1.3 數據整理與統計分析

在MicrosoftExcel2016軟件中記錄和整理數據，并制作柱形圖和折線圖。在SPSS v22.0 軟件中分析數據間的顯著性（ Plt;0.05） 。

2 結果與分析

2.1貯藏溫度對鮮切芋頭褐變的影響

切面發黃發褐是鮮切芋頭的典型褐變癥狀[22]。為明確貯藏溫度對鮮切芋頭褐變的影響，比較了貯藏在不同溫度（ 和 4^°C ）下的褐變進展。b”值表示黃藍色彩維度，正值對應黃色方向，且隨著 b^* 值增大，黃色飽和度相應增強。在 貯藏期間，切面亮度逐漸下降，黃褐色加深（圖1-A）， b^* 值快速增加（圖1-C），貯藏 24h 已無商品價值。但在 4^°C 貯藏時，切面黃褐色緩慢加深（圖1-B）， b^* 值緩慢增加（圖1-C），且增加速率明顯低于 貯藏時。在 4^°C 貯藏12d時的b^* 值為12.35，明顯小于 貯藏 24h 時的14.04，表明低溫貯藏能有效延緩鮮切芋頭褐變。但即使在 4^°C 下貯藏褐變仍不斷加重，因此，探明低溫貯藏條件下的鮮切芋頭褐變機制，能為鮮切芋頭抗褐變技術的研發奠定基礎。

2.2LOX家族基因在鮮切芋頭褐變過程中的表達模式

如圖2所示，轉錄組數據中共17個基因被注釋為LOX，不同LOX基因在芋頭褐變過程中的表達模式差異很大，但總體可分為兩種模式。11個LOX基因在各時間點的表達量很低，且在不同時間點的差異不明顯。另外6個LOX基因在貯藏期間表達增加，其中2個LOX基因的初始（Od）表達量較高，且在鮮切后和低溫貯藏期間急劇增加。這兩個基因分別被注釋為LOX3（Taro_029076）和LOX6（Taro_032526），暗示LOX3和LOX6在鮮切芋頭褐變中具有重要作用。在6d和12d時，LOX3的表達量是0d時的6.88倍和6.80倍。

2.3芋頭LOX3基因全長克隆

由于LOX3和LOX6表達在鮮切處理后顯著增加，且LOX3表達量的增加幅度明顯高于LOX6 ，為此本研究重點探討 LOX3 在鮮切芋頭褐變中的作用。LOX3 基因CDS 長 DNA瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，以cDNA為模板擴增到1條大于2000bp的DNA片段（圖3-A）。將該DNA片段切膠回收，連接至pUCm-T克隆載體上，轉化 DH5α 感受態細胞擴繁重組質粒。如圖3-B所示，以重組質粒為模板擴增到1條約 3 000bp 大小的DNA條帶，說明克隆產物已成功連接至pUCm-T載體，挑選單克隆陽性菌落測序鑒定。

2.4芋頭LOX3蛋白序列特性分析

芋頭LOX3分子質量為 110. 31ku ，理論等電點為6.36。序列中有116個氨基酸帶正電荷，124個氨基酸帶負電荷。蛋白不穩定指數為52.77，是一個不穩定蛋白。脂肪指數為77.80，親水性平均值為一0.34。芋頭LOX3蛋白定位在細胞質，說明其可能在細胞質中發揮作用。

芋頭LOX3蛋白序列中含有一個脂氧合酶（lipoxygenase）保守域（圖4-A），表明芋頭LOX3屬于脂氧合酶大家族。序列一致性分析結果顯示（表2），芋頭LOX3蛋白與同屬于天南星科的浮萍（Spirodelaintermedia）SiLOX3的序列一致性最高 75.73% 。與擬南芥、煙草和番茄LOX3的氨基酸序列一致性也較高，相似性為 63.23% ＼～65.28% （表2）。盡管芋頭LOX3與其他植物LOX3

A. 20°C 貯藏期間的外觀變化；B.4℃貯藏期間的外觀變化； C.20^°C 和 4^°C 期間 b^* 值的變化趨勢 A. Appearance changes during storage at 20^°C ; B. Appearance changes during storage at 4°C ; C. Trends in b^* values during storage at and 4^°C （204

A.以芋頭cDNA為模板擴增的PCR 產物電泳圖;B.以重組質粒為模板擴增的PCR產物電泳圖；M.DNA marker; 1～5 .PCR擴增 產物；黑色箭頭指示LOX3產物位置 A.ElectrophoreticmapofPCRproductsamplifiedusingtarocDNAasatemplate；B.Electrophoresis mapofPCR productsamplified using recombinant plasmids as templates；M.DNA marker; 1-5 PCR amplification products；The black arrow indicates the position of LOX3 products

Fig.3Electrophoresisi map of full length of taro LOX3 gene from taro amplified by PCR

Fig.4Conserved domain and multiple sequence alignment of taro LOX3 protein蛋白序列的相似性較高，但芋頭LOX3序列的N端比其他植物多74個氨基酸殘基（圖4-B），暗示芋頭LOX3除脂氧合酶保守功能外可能還具有其他方面的功能。

為從系統發育角度分析芋頭LOX3的潛在功能，構建了芋頭LOX3與擬南芥LOX家族的系統發育樹。擬南芥LOX家族共包含6個成員[26]，且親緣關系均較近。其中，芋頭LOX3與擬南芥LOX3和LOX4聚在同一分支，親緣關系最近（圖5）。

2.5LOX3表達與鮮切芋頭褐變的相關性

在4 °C 貯藏期間，鮮切芋頭褐變指數（browningindex，BI）逐漸增加。與Od相比，經過 12d 貯藏BI增加 66.47% （圖6-A）。 LOX3 表達量在0d到3d時急劇增加，表明切分處理誘導其表達。與0d相比，12d的 LOX3 表達量增加10.41倍（圖6-B）。相關性分析結果顯示（圖6-C， LOX3 表達與BI具有明顯正相關關系，相關系數為0.73。

與BI增加趨勢相似，LOX活性也在低溫貯藏期間逐漸增加，從。d的 207.64U/kg 增加到12d的 314. 58U/kg ，增加 51.51% （圖6-D）。LOX活性與LOX3表達的相關性系數為0.73（圖6-E），說明 LOX3 表達可能是引起LOX活性增加的重要原因。MDA含量從0d的47.95μmol/kg 增加到12d的 92. 64μmol/kg ，增加93.21% （圖6-F），表明在褐變期間鮮切芋頭的膜脂過氧化程度不斷加重。

2.6對LOX3表達和LOX活性的影響

外源CA和VA處理可有效抑制鮮切芋頭褐變[22]。為進一步明確LOX3 表達與鮮切芋頭褐變的相關性，分析了CA和VA處理對LOX3表達、LOX活性和MDA含量的影響。如圖7所示，外源CA和VA處理顯著下調LOX3表達，降低LOX活性和MDA含量。表明抑制LOX3表達可降低LOX活性，緩解鮮切芋頭膜脂過氧化。

2.7芋頭LOX3基因啟動子分析

啟動子是直接調控靶基因表達的重要調控元件，能通過識別環境信號因子激活或抑制靶基因表達[25]。去皮、鮮切等切分處理屬于機械損傷，由于 LOX3 表達量在鮮切后顯著增加，推測其可能通過啟動子中的順式作用元件響應機械傷信號。因此，分析了LOX3啟動子序列中的順式作用元件。

結果顯示（表3），LOX3啟動子序列中含有CAAT-box和TATA-box等核心元件，證明該序列符合啟動子基本特性。LOX3啟動子中含有2個傷信號響應元件（WUN），還含有許多激素響應元件（圖8），比如3個脫落酸（abscisicacid，

ABA）響應元件（ABRE）、3個茉莉酸甲酯（Me-JA）響應元件（CGTCA-motif）和1個生長素（auxin，AUX）響應元件（TGA），表明LOX3表達可能受植物激素調控。含有3個厭氧誘導元件（ARE）和大量的光響應元件（表3）。除上述元件外，在LOX3啟動子中還發現多個轉錄因子結合元件，如3個MYC和2個WRKY位點，說明LOX3 表達受MYC等轉錄因子的調控（圖8）。

3討論

本研究的結果顯示，貯藏溫度越低，鮮切芋頭的褐變進程越慢，說明低溫貯藏能有效延緩鮮切芋頭褐變。但即使貯藏在 4^°C 的低溫條件下，褐變仍會發展。因此，探討低溫貯藏條件下的褐變發生機制，對安全高效的抗褐變保鮮技術研發具有重要意義。近幾年的研究表明，細胞膜脂過氧化是加速鮮切果蔬褐變的重要原因，LOX能與細胞膜中的不飽和脂肪酸發生加氧反應，形成氫過氧化物，導致膜脂過氧化[26-27]。MDA是反映膜脂過氧化程度的重要指標，MDA含量通常與細胞膜脂過氧化程度正相關[28]。本研究中，LOX活性和MDA含量隨BI增加而增加，CA和VA處理顯著抑制LOX活性增加，降低MDA含量和BI，表明細胞膜脂過氧化是促進鮮切芋頭褐變的重要原因。

為鑒定促進鮮切芋頭褐變的主效LOX基因，利用轉錄組測序數據分析了芋頭LOX家族基因在褐變過程中的表達模式。結果發現，LOX3 和LOX6的表達在鮮切芋頭褐變過程中顯著增加，前期已證明LOX6表達與鮮切芋頭褐變密切相關[29]。為此，本研究重點探究LOX3 在鮮切芋頭褐變中的作用。芋頭LOX3氨基酸序列中含有脂氧合酶保守結構域，表明芋頭LOX3屬于脂氧合酶家族。擬南芥AtLOX1參與脂質氧化代謝，沉默AtLOX1能降低擬南芥的單線態氧（204號 （¹O₂"）含量[30]。在4個擬南芥LOX基因（AtLOX2、AtLOX3、AtLOX4和 AtLOX6 ）中，AtLOX4 對 a -亞麻酸的氧化作用最強[31]。芋頭LOX3與AtLOX4蛋白聚在同一分支，與擬南芥LOX家族其他成員的親緣關系也很近，與模式植物LOX3的序列一致性很高，表明植物LOX3催化脂肪酸氧化的功能高度保守。芋頭LOX3表達隨褐變增加，表達模式與褐變進程具有明顯正相關性，CA和VA處理顯著下調 LOX3 表達，表明 LOX3 表達上調可能是引起鮮切芋頭褐變的重要原因。

Fig.8Distribution of stress response elements in promoter of taro LOX3 gene

LOX表達上調是植物響應非生物脅迫的重要機制，逆境脅迫尤其機械傷脅迫通常會誘導植物LOX家族基因的表達[14]。采后黃瓜中機械損傷會顯著誘導LOXmRNAs積累，并伴隨LOX活性增加[32]。在受到機械損傷影響的水稻 （Ory^- za sativa）葉片中， LOX 表達和酶活性明顯高于正常葉片，LOX活性增加會激活膜脂過氧化反應[33]。在馬鈴薯中，機械傷處理后觀察到許多LOX基因及同源基因表達上調[33]。同時，LOX還是催化合成JA的關鍵酶，JA信號對LOX表達具有反饋調節作用[15，34]。本研究中，芋頭LOX3表達在鮮切處理后顯著上調，且啟動子序列中含有傷信號、ABA和JA響應元件，表明LOX3 通過啟動子中的響應元件識別切分處理產生的傷信號，進而誘導其表達。LOX催化合成的JA反過來能通過JA響應元件增強其表達，這可能是 基因在整個低溫貯藏期間持續表達的重要原因。此外，芋頭LOX3啟動子中有多個MYB、MYC和WRKY轉錄因子結合位點。在草莓成熟過程中，FaMYB11可直接與FaLOX5啟動子結合激活其表達，從而促進脂基揮發性化合物的合成[35]。翻譯后激活和染色質免疫沉淀分析結果顯示，煙草NtMYB12a能直接促進Nt-LOX6 和NtLOX5的表達[36]。這些結果說明芋頭LOX3表達可能還受MYB等轉錄因子的調控，但具體哪些轉錄因子調控LOX3表達，值得深人研究。

4結論

本研究在轉錄組測序的基礎上，從鮮切芋頭中克隆LOX3全長序列，探究其表達與鮮切芋頭褐變的相關性。芋頭LOX3蛋白序列中含有脂氧合酶保守域，與其他植物LOX的親緣關系和序列一致性較高，表明植物LOX3具有相對保守的生物學功能。 LOX3 啟動子中含有傷信號元件和多個逆境相關元件，表明切分處理能通過逆境響應元件激活其表達。LOX3表達與LOX活性和BI間具有明顯正相關性，CA和VA處理顯著抑制 LOX3 表達，降低LOX活性和MDA含量，表明LOX3表達可能是引起鮮切芋頭褐變的重要原因。總之，本研究明確了LOX3表達與鮮切芋頭褐變的相關性，為芋頭新品種創制提供了重要候選基因。

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Cloning of LOX3 Gene Encoding Lipoxygenase and Its Potential Roles in Browning of Fresh-cut Taro

LIN Wei1 ，WANG Bin1'2，XIE Jing1and LUO Tao3

（1.Guangdong ProvincialKeyLaboratoryof UtilizationandConservationofFoodand Medicinal Resources in Northern

Region/Collge of Biology and Agriculture，Shaoguan University，Shaoguan Guangdong5120o5，China;2.Guangdong

Provincial Engineering and TechnologyResearchCenterof SpecialFruitandVegetablesinNorthernRegion/Engineering and Technology Research Centerof Shaoguan Horticulture，Shaoguan University，Shaoguan Guangdong512005， China；3.Guangdong Province Key Laboratory of Postharvest Science of Fruitsand Vegetables/Collge of Horticulture，South China Agricultural University，Guangzhou51o642，China）

Abstract To identify the key LOX genes regulating the browning of fresh-cut taro，this study compared the effects of storage temperatures on the browning of fresh-cut taro and analyzed the expression patterns of LOX family genes during the browning based on transcriptomic data. The results showed that the b^* values on the cut-surface of fresh-cut taro rapidly increased during storage at 20 ^°C .After 24 hours of storage at ，the commercial values of fresh-cut taro were almost lost.Cold storage at 4^°C could effectively delay the increase in b^* values，but the browning of fresh-cut taro continued to develope. Based on transcriptomic data，a total of 17 gene members from taro LOX family were identified in fresh-cut taro，with the expression level of LOX3 significantly increased after cutting as well as during cold storage. These results suggested that the upregulated LOX3 expression might be closely related to taro browning. Therefore，the coding sequence （CDS） of LOX3 gene was cloned from fresh-cut taro through the RT-PCR method. The CDS of taro LOX3 was 2958bp ，encoding a protein containing 985 amino acid residues. The LOX3 promoter sequence contained two wound signaling elements and abundant stress related elements.Moreover，the LOX activity and malondialdehyde （MDA）content significantly increased as the browning index （BI） increased. There was a positive correlation between LOX3 expression and LOX activity as well as BI. In addition，exogenous cinnamic acid and vanillic acid treatments significantly downregulated LOX3 expression，delayed the increase in LOX activity and MDA contents.In summary，the expression of LOX3 is closely related to the browning of fresh-cut taro，and the upregulated expresson induced by cutting may be an important reason for browning occurrence of fresh-cut taro under cold conditions.

Key wordsFresh-cut taro; Postharvest storage; Cut-surface browning;Lipoxygenase; Gene cloning

Received 2024-06-12 Returned 2024-09-11

Foundation item Guangdong Provincial Key Laboratory of Utilization and Conservation of Food and Medicinal Resources in Northern Region （No. FMR2023004M） and Guangdong Provincial Department of Education’s Provincial University Student Innovation and Entrepreneurship Training Program （No.S202410576028）.

First authorLIN Wei，female，undergraduate. Research area： storage and freshness preservation of postharvest fruit and vegetables. E-mail：1448053435@qq. com

Corresponding authorWANG Bin，male，Ph.D，associate professor. Research area：biology of postharvest fruit and vegetables. E-mail：b_wang@sgu. edu. cn

LUO Tao，male，Ph.D，associate professor. Research area： molecular biology of postharvest fruit and vegetables. E-mail：luotao0502@scau. edu. cn

（責任編輯：顧玉蘭 Responsibleeditor：GUYulan）