藥用植物曲莖石斛組織培養無菌體系建立和腋芽誘導研究

曲莖石斛（Dendrobiumflexicaule）為多年生蘭科（Orchidaceae）石斛屬（DendrobiumSw.）植物，是我國1986年在伏牛山新發現的物種[，秦巴山區稱之為“金釵石斛\"2。曲莖石斛為藥食同源植物，以莖入藥，具有抗腫瘤、活血化瘀、治療糖尿病、降血壓、降血糖、抗衰老、提高免疫力等功能[3-8。野生曲莖石斛喜溫濕，多生于海拔較高的陰坡、半陰坡山溝和溪流的巖石或懸崖石壁上，數量稀少。加之多年來人為采掘嚴重，自然繁殖率低，野生資源瀕危滅絕[9-10]。2021年，國家林業和草原局頒布的《國家重點保護野生植物名錄》將曲莖石斛列為一級保護野生植物。曲莖石斛還被《中國物種紅色名錄》和《世界自然保護聯盟瀕危物種紅色名錄》列為極危物種，是瀕于滅絕的中草藥植物[11-12]

目前，國內外對于曲莖石斛的研究多為其藥用價值方面，在組織培養研究中對曲莖石斛涉及較少，多為鐵皮石斛及其他石斛品種。本研究以曲莖石斛具節莖段為材料，通過建立曲莖石斛組織培養無菌體系探究適宜的外植體消毒方法，并篩選曲莖石斛具節莖段腋芽誘導的最適培養基配方，為曲莖石斛離體組織培養、快速繁育以及種質資源保護提供依據。

1材料與方法

1.1試驗材料采自河南省南陽市農業科技示范園區溫室栽培的曲莖石斛壯苗。

1.2 試驗方法

1.2.1外植體材料預處理選取長勢健壯的曲莖石 斛新鮮莖段，去掉莖段節處葉片，用鑷子輕輕將膜質 葉鞘剝去，剪成約 10cm 的具節莖段[13]

1.2.2外植體消毒將預處理好的曲莖石斛外植體莖段放在燒杯中，用薄紗布封口在流水下沖洗30min ，再將外植體莖段放于 200mL 小燒杯中，用洗潔精水浸泡 30min ，然后用蒸餾水沖洗干凈轉移至超凈工作臺待用。外植體莖段的消毒方法如下：

方法一：用 75% 酒精浸泡 30s ，蒸餾水沖洗3次，然后用 0.1%HgCl₂ 浸泡 4.7，10，13min ，蒸餾水沖洗5次。

方法二：用 75% 酒精浸泡 30s ，蒸餾水沖洗3次，然后用 1% NaClO浸泡 12，16，20min ，蒸餾水沖洗5次。

方法三：用 75% 酒精浸泡 30s ，蒸餾水沖洗3次，然后用必潔仕牌二氧化氯消毒劑（原液）浸泡4、7.10min ，蒸餾水沖洗5次。

1.2.3外植體接種用剪刀將消毒處理過的曲莖石斛莖段剪成長約 2cm 的具節莖段，在酒精燈火焰附近打開培養基蓋子，將瓶口傾斜接近水平方向并不斷轉動用火焰灼燒瓶口，用鑷子夾取外植體莖段，將其形態學下端接種到培養基上，深度約 0.5cm 培養基配方為 玉米素 +3% 蔗糖 +0.8% 瓊脂，每瓶接種2個外植體，每個消毒時間接種12瓶，重復2次。接種好的材料轉移到培養室培養兩周。

1.2.4腋芽誘導培養腋芽誘導培養以MS為基本培養基，設置4種腋芽誘導培養基配方，一組空白對照（表1）。曲莖石斛無菌莖段培養兩周后，選取生長良好的初始無菌培養物為外植體，轉接到腋芽誘導培養基上，每個處理接種11瓶，每瓶接種1個外植體，2個重復。將材料放到無菌室培養，溫度 25^°C ，光照時間 10h/d ，光照強度為 1500～2000lx ，培養1個月。

1.2.5數據分析消毒的曲莖石斛外植體培養兩周后統計消毒效果數據，包括污染率、成活率以及污染菌源類型；無菌培養物轉接到腋芽誘導培養基上培養30d后，統計不同培養基培養的曲莖石斛莖段腋芽誘導情況，包括腋芽誘導率、污染莖段數、褐化莖段數以及腋芽生長情況。所有數據用Excel軟件分析處理，采用SPSS26.0方差分析，應用Duncan法進行多重比較，用標記字母法進行差異顯著性分析。

污染率 ?= （污染外植體莖段數/接種外植體莖段總數 1×100%

成活率 ?= （成活外植體莖段數/接種外植體莖段總數 1×100%

腋芽誘導率 ?= （誘導出芽的外植體莖段數/接種外植體莖段總數 1×100%

2結果與分析

2.1曲莖石斛無菌體系建立由表2可知，3種消毒處理方法差異顯著， 0.1%HgCl₂ 處理組整體表現佳。在 0.1%HgCl₂ 處理中， 7.13min 處理污染外植體數只有8個，污染率為 16.67% ，最低，但處理13min 有兩個莖段死亡，表明 0.1%HgCl₂ 消毒時間過長可能會對外植體莖段產生毒害作用；處理10min 污染莖段數10個，污染率為 20.83% ，理論上， 0.1%HgCl₂ 消毒 10min 污染率應低于 7min 的，但實際結果與之相反，可能是操作誤差導致。其次是1% NaClO組， 12，16，20min 消毒處理污染率都在90% 以上，消毒效果較差。二氧化氯消毒劑外植體莖段污染率隨著處理時間的延長逐漸降低，但消毒效果明顯低于 HgCl₂ 處理組。

如圖1所示，不同消毒試劑處理曲莖石斛外植體莖段污染效果有所不同， 0.1%HgCl₂ 處理的外植體污染程度較輕，多為真菌性污染（圖1A），同樣消毒時間處理下二氧化氯消毒劑處理污染程度較重（圖1B）。使用 0.1%HgCl₂ 消毒處理 7min ，材料污染率最低，為最適外植體消毒方案。

2.2曲莖石斛腋芽誘導研究不同激素濃度及配比對曲莖石斛腋芽誘導影響結果如表3所示，與CK相比，不同處理均有利于曲莖石斛腋芽誘導。由圖2可以看出，培養基配方A和C組中健壯腋芽數比配方B和D高，說明NAA濃度 0.3mg/L 比 0.6mg/L 處理效果好，當6-BA濃度一定時，較高濃度的NAA會抑制腋芽誘導效果；A比C腋芽長勢好且健壯腋芽數多，B比D腋芽長勢好，說明當NAA濃度一定時，較高濃度的6-BA會抑制腋芽誘導效果。 C，D ）CK組分別有1個外植體污染，轉移的外植體為無菌莖段，少數的污染可能是由于操作失誤。對照組誘導出33個腋芽，長勢較弱小，近半數外植體僅誘導出約 0.5cm 的芽尖，且外植體長出大量不定根（圖3）。綜合結果表明，A配方即 1mg/L 6-BA 和 0.3mg/L NAA激素濃度配比效果最佳，腋芽誘導率達到了100% ，且腋芽生長健壯。

3討論

探究了曲莖石斛的外植體消毒方法和芽誘導的培養基配方。外植體消毒選擇使用 0.1%HgCl₂ ，1% NaClO、二氧化氯3種消毒劑[14-16，通過設置不同的時間梯度，增加消毒劑類型，便于對比分析以篩選最適外植體消毒方案。研究發現，使用 消毒劑處理曲莖石斛外植體莖段的消毒效果不好，可在后續研究中提高消毒劑含量和消毒時間以優化消毒方案。植物生長調節劑濃度及配比對腋芽誘導起重要作用，高濃度的細胞分裂素和低濃度的生長素配合有利于腋芽誘導[7。本研究通過添加6-BA、玉來素和NAA以探究不同植物激素組合與含量水平對曲莖石斛外植體莖段的腋芽誘導效果，發現 1mg/L 6-BA+0.3mg/LNAA+0.2mg/L 玉米素的誘導效果最佳，表明低濃度的6-BA和NAA有利于曲莖石斛腋芽發生，誘導效果較好，可以作為曲莖石斛莖段腋芽誘導的適宜培養基配方。本研究結果可為曲莖石斛的離體組織培養和快繁提供參考依據。

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【基金項目】：河南省科技攻關計劃項目（232102310336）；南陽師范學院實驗室開放項目（SYKF2023063）。

郭國業，何瀟宇，王夢，劉怡辰，景小藝，蘇曼玉，賀秀芬，吳佳瑩，丁宇煊，南陽師范學院，郵編473061（河南）；尹英英，國有南陽市黃石庵林場。