基于環境病毒檢測儀的量子點免疫層析試紙條的研究

摘要：近年來甲型H1N1 流感、埃博拉、乙型流感、新冠病毒等突發的具有傳染性的重大疫情，給人類的健康帶來了很大影響，因此針對環境病毒的檢測和預防變得至關重要。而免疫層析試紙條技術作為一種能夠實現病毒快速檢測的新興技術，相較于酶聯免疫吸附實驗具有普適性和特異性強等優點，解決了傳統的病毒抗原檢測流程復雜、時間長等問題，同時也為環境監測提供了一種新的發展方向。然而，傳統的免疫層析試紙條存在檢測指標單一、檢測限高等缺點?；诿庖邔游鲈嚰垪l和量子點熒光納米微球，設計了一種量子點熒光免疫層析試紙條，它具有光穩定性好、亮度高和檢測限低的特點。通過儀器配套的熒光檢測模塊進行分析和檢測時，量子點熒光納米微球的激發光可快速檢測出環境中的病毒。該方法操作簡單、數據穩定，為環境病毒檢測提供了一種新思路。

關鍵詞：環境病毒檢測；免疫層析技術；量子點熒光納米微球；試紙條

中圖分類號：TB 39 文獻標志碼：A

引 言

全球自2020 年至今，確診新冠病例超過7.525 億例，其中包括680 萬例死亡病例。龐大的數字令人觸目驚心。而當前全球新冠肺炎、甲流、乙流等疫情仍處于大流行階段，每年全球范圍內約有10 億例季節性流感病例，包括300 萬～500 萬例重癥病例。季節性流感每年導致約65 萬人死亡。5 歲以下兒童中，99% 的下呼吸道感染的流感死亡病例發生在發展中國家?？梢姾粑栏腥臼亲詈唵吻腋咝У母腥痉绞?。環境空氣的安全問題已經嚴重影響到公眾健康、經濟發展和社會秩序等諸多方面。目前人類越來越需要重視生物安全，尤其是未知的病毒對人類健康安全、生態環境安全等帶來的不利影響[1-2]。

生物氣溶膠是指空氣中帶有生物性粒子的顆粒 [3-4]，這些氣溶膠大多數帶有不同種類的病毒和微生物，因此具有明顯的傳染性與致敏性。而且氣溶膠顆粒懸浮在空氣中很容易被吸入體內，通過呼吸道途徑傳播疾病，即所謂的 “病從鼻入”，對人類健康有很大影響。在對抗傳染病的斗爭中，已經證實多種傳染性疾病能夠通過氣溶膠傳播。因此針對環境中攜帶病毒微生物的生物氣溶膠的采集變得至關重要。近年來市面上涌現出越來越多的環境病毒氣溶膠富集檢測儀器[5]，給環境病毒監測領域做出了巨大的貢獻。而配套使用的各種檢測試紙條也越來越多[6-9]，原理也不盡相同。在這期間免疫熒光層析技術脫穎而出，它具有靈敏度高、特異性強等優點，能夠實現快速檢測，隨著標記固相材料技術的發展，能夠實現定量檢測、多重檢測等，具有良好的應用前景。

免疫層析技術[10] 利用免疫學原理，結合抗原抗體的特異性反應，實現目標標志物的檢測。以有固定T 線（檢測線）、C 線（控制線）的纖維膜材料層析試紙作為固定相，待檢測的混合液作為流動相，當流動的待測液流動相經過T 線時，抗原與抗體發生特異性反應，完成目標組分分離。其較低的檢測成本與快速便攜的特點，使得面向家庭的檢測成為可能。此外量子點熒光納米微球[11-12] 作為熒光探針標記病毒標志物，由于其熒光波長可調、激發光譜寬、量子產率高、發射強度高且穩定等優點，在過去的幾十年中已逐漸成為生物領域重要的熒光標記材料，其優異的發光性能和獨特的光穩定性可以賦予檢測結果高精準性和靈敏度。

本文設計了一種量子點熒光納米微球免疫層析試紙條，其中包括：底板，以及依次設置在底板上的樣品墊、復合型結合墊、反應墊以及吸水墊，其中樣品墊用于加載樣本，復合型結合墊設有量子點熒光納米微球標記的病毒檢測克隆抗體。通過環境病毒檢測儀器將空氣中的病毒目標物富集到樣品溶液中并加載到試紙條上進行檢測，最終分析出對應的不同病毒目標物。本研究選取了3 種病毒作為檢測目標： 新冠病毒（COVID-19）、甲型流感病毒（Influenza A Virus）和乙型流感病毒（Influenza B Virus）。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

N?羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽（磺基?NHS）購置于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。量子點熒光納米微球?625 由珈源量子點提供。磷酸鹽緩沖溶液（peptone buffered solution ， PBS）購于武漢賽維爾生物科技有限公司。樣品墊與結合墊購于上海杰一生物技術有限公司，吸水墊與PVC 底板由南京微測生物科技有限公司提供，硝酸纖維素膜購于上海賽多利斯公司。實驗過程中所用到的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）從中國索萊寶公司購買。

實驗中所用的主要儀器有環境病毒檢測儀（自研）、Millipore 超純系統（德國），BeckmanCoulter 高速冷凍離心機（美國），超聲波儀器（中國），Tecan Spark 多功能酶標儀（瑞士）。

1.2 樣品的梯度稀釋

首先，使用蒸餾水或去離子水對樣品稀釋液進行1∶10 倍的稀釋；接著，用樣品稀釋液將樣品做1∶5 倍的稀釋；然后制備標準液：提前準備好8 個1.5 mL 離心管，第1 管中加入900 μL樣品稀釋液，第2 至第8 管中加入同體積的樣品稀釋液500 μL。將2 000 ng/mL的100 μL 樣品溶液加入第1 管中，在并在漩渦混合器上充分混合，然后用移液槍吸取500 μL加入第2 管中。重復此操作以作對半稀釋，在第7 管中吸出500 μL 并丟棄至廢液缸內，第8 管則為空白對照，并在37 ℃ 的黑暗處放置15 min。最后向每個試紙條的樣品孔加入100～200 μL 的被梯度稀釋的樣品溶液，并充分反應。最后，使用成像系統對條帶進行曝光以進行顯色，并觀察條帶的C 線和T 線。

1.3 量子點熒光納米微球標記檢測抗體

首先將10 μL 量子點熒光納米微球分散至MES（ 2-Morpholinoethanesulphonic acid） 溶液中并離心。離心后分離上層清液再將其重新加入MES 溶液中并進行超聲分散。之后分別配置10 mg/mL 的EDC 溶液與NHS 溶液， 加入至MES 溶液中，充分混合后離心。離心結束后分離上層清液并加入1 mL 抗體稀釋液，與目標檢測抗體溶液混合后孵育1.5 h。孵育完成后加入20% BSA 溶液封閉，再次離心后分離量子點熒光納米微球，并復溶于含有10% 蔗糖，5% 海藻糖與1% BSA 的混合液中，在4 ℃ 下保存備用，如圖1 所示。

1.4 免疫層析試紙條的制備

免疫層析試紙條由樣品墊、結合墊、吸水墊、硝酸纖維素膜（反應墊）與PVC 底板構成。首先在PVC 底板上粘貼硝酸纖維素膜，在一端粘貼樣品墊與結合墊，另一端粘貼樣品墊。預先配置好由含有0.1% 蔗糖的PBS 緩沖液稀釋的山羊抗小鼠IgG 溶液，使用劃膜噴金儀將上述溶液均勻預置在硝酸纖維素膜上形成C 線，以同樣過程處理新冠病毒COVID-19（其余病毒的捕獲抗體均采取本方法）捕獲抗體溶液形成T 線[ 如圖2（a）所示]。將其置于37 ℃ 干燥箱中干燥后裁切為寬度均勻的免疫層析試紙條以備使用。制作好的量子點熒光納米微球免疫層析試紙條配套環境病毒分析儀使用，試紙條由轉盤裝置精準運送到熒光檢測裝置下方，由該裝置進行熒光讀取，由分析裝置分析熒光值并辨別病毒類別[ 見圖2（b）]。

2 結果與討論

2.1 熒光強度與樣品質量濃度的關系

為檢測所設計研發的試紙條在不同的樣品濃度下熒光強度的變化情況，選取了COVID-19 重組N 蛋白作為檢測熒光強度變化的樣品，初始質量濃度為2 μg/mL。梯度稀釋完成后將稀釋樣品逐個加載到試紙條上，待完全反應后記錄試紙條的熒光強度。如圖3 所示，可明顯觀察到不同樣品質量濃度下的熒光強度變化。

2.2 最小檢測時間

為了檢測試紙條對不同病毒樣本檢測的反應速度，本研究選取能夠覆蓋不同檢測質量濃度水平（pg 級到mg 級）以及檢測范圍較寬的檢測項目，如：COVID-19 重組N 蛋白、甲型流感抗原、乙型流感抗原。這些選擇的檢測項目涵蓋了當前熱點病毒，跨越了不同濃度水平和檢測范圍。

使用上述3 種標準品作為環境病毒氣溶膠樣品，并用樣品稀釋液將生物氣溶膠標準品進行適當稀釋，最終得到1 000 倍稀釋的樣本。隨后取100 μL 樣本溶液滴入到試紙條中并由環境病毒檢測儀讀取數值。每隔5 min 檢測一次，并持續記錄3 h 內所測的樣本數值。通過分析得出數值穩定后的最小時間作為測試的時間，從而確保在不同質量濃度水平的準確檢測，以及找到恰當的檢測時間窗口。表1、2、3 是測得的時間與質量濃度的數據表，從表中可知1 000 倍稀釋的樣本20 min 后樣本數值達到最大值且數值趨于穩定，時間曲線如圖4 所示。

2.3 重復性檢測

為了驗證試紙條的可靠性和穩定性，本研究進行了重復性測試。使用樣品稀釋液將3 種環境病毒氣溶膠標準品進行1∶100 稀釋，并將標準品溶液滴到試紙條中，待20 min 后使用環境病毒檢測儀檢測20 次，輸出讀取的數值。圖5 是COVID-19 重組N 蛋白、乙型流感抗原和甲型流感抗原3 種病毒樣品的重復性測試結果統計圖，結果顯示重復20 次的結果基本趨于平穩。

2.4 時間穩定性檢測

為了驗證試紙條的時間穩定性，選取了3 個不同病毒樣品的1∶100 稀釋濃度樣品溶液進行測試，將溶液分別加載到試紙條上并充分反應。待其處于穩定狀態后，重復測試并記錄各試紙條的熒光強度讀取數值。在3 h 內重復測試各樣品10 次，以第1 輪的測定結果作為基準值。如圖6 所示，（a）、（b）、（c）分別是COVID-19 重組N 蛋白、乙型流感抗原、甲型流感抗原在1∶100 的稀釋濃度下的時間穩定性圖。由圖6可見，20 min 后的測量熒光強度數值與20 min時測得的熒光強度數值波動范圍并不劇烈，3 種標準品均有良好的時間穩定性，偏差最大的是乙型流感抗原，在180 min 時的偏差是0.05%，綜合可見穩定性良好。

3 結 論

本研究利用免疫層析試技術，采用量子點熒光納米微球作為新型標記物，設計了一種新型的免疫層析試紙條，并開發出一種環境病原體檢測技術。這項技術的核心是利用不同顏色的量子點熒光納米微球，每種量子點熒光納米微球都標記有特定的抗體，能夠針對不同的病原體進行檢測。通過與環境病毒檢測儀器的紫外熒光分析模塊配合使用，可以快速、準確地檢測出目標病原體。選取了3 種常見的病原體作為目標物：新冠病毒COVID-19、乙型流感和甲型流感。針對試紙條的熒光強度、最小檢測時間、可重復性以及時間穩定性進行了深入的驗證。實驗結果表明，該試紙條具有較小的檢測時間，可在不同場所下應對各種突發情況，能夠提供最大可能性的準確檢測結果。由于量子點熒光納米微球標記的抗體種類可以根據實際需要進行選擇和更換，因此適用于不同的病原體檢測。此外，量子點熒光納米微球具有較強的光穩定性和化學穩定性，試紙條具有較長的保存期限。當前，環境中的病原體已經成為一項全球性的公共衛生問題。本研究所開發的量子點熒光納米微球免疫層析試紙條具有廣闊的應用前景。它可以被廣泛應用于醫療、環境衛生、食品安全等領域的病原體檢測中。在未來，將繼續對該技術進行改進和優化，為保護人民健康和安全做出更大的貢獻。