基于SLAF-seq的廣西八角種質資源遺傳多樣性分析

中圖分類號：Q949.9 文獻標識碼：A 文章編號：1000-3142（2025）04-0730-11

Genetic diversity analysis of Ilicium verum germplasm resources in Guangxi based on SLAF-seq

LI Jinmei ， ZHONG Yu’，CHEN Jianhua'2，MING Ruhong ， YAO Shaochang LI Liangbo ， TAN Yong12， HUANG Rongshao1，2， YAO Chun1，HUANG Ding （1.CollegeofPharmacy，Guangxi UniversityofChineseMedicine，Nanning53O2Oo，China；2.GuangxiKeyLaboratoryofZhuangand Yao Ethnic Medicine，Guangxi University ofChinese Medicine，Nanning 5302Oo，China）

Abstract：As one of the significant characteristic economic forestry species in Guangxi，star anise （Ilicium verum） exihibitsarich genetic diversity.Inorder touncoverthe genetic diversityof staranisegermplasm resources in Guangxi， the specific locusamplified fragmentsequencing（SLAF-seq）technology was employed.Thisenabled anin-depth investigation into the single nucleotide polymorphism（SNP）loci across 53 star anise population samples，gathered from avarietyofgeographicalterrtorieswithin Guangxi，aswellas42samplesofartificiallyselectedsuperior germplasm. Based on SNP polymorphism，population genetic structure and genetic diversity analyses were conducted on these star anise samples.The results were as follows：（1）From 95 star anise samples，atotal of1 588 Mb of sequencing data and 643 690 SLAFtags were obtained，of which 74 434 were polymorphic SLAF tags. After fltering，2 690 564 population SNPs were identified.（2）The95 star anisesamples were clasified into two fundamentalclusters：ClusterI ssimilated samples originating fromthe North Guangxi，West Guangxi，and some regionsof Central Guangxi，whereas Cluster I embraced the42samples of artificially selectedsuperior germplasm，coupled with samples from South Guangxi，EastGuangxi，and portionsof Central Guangxi.（3）Populations from North Guangxi exhibited thehighest levelof geneticdiversity，followedsequentiallbythosefromEast，Central，West，andSouthGuangxi.Incontrast，he artificiallyselected superiorgermplasmsamplesdisplayed thelowest degreeof geneticdiversity.Inconclusion，the study effctively demonstrates that SNP molecular markers，derived from SLAF-seq technology，arecapableof efficiently assessing thegeneticdiversityin samplesfrom diferentregionsof Guangxi andthesamplesof artificiallyselected superior germplasm.This information actsasa significant theoretical guide for theconservation，utilization of the star anise genetic resources in Guangxi，as well as the selection of superior germplasms.

Key words： Ilicium verum，SLAF-seq， SNP，genetic structure，genetic diversity

八角（Iliciumverum），又稱為大茴香或八角茴香，隸屬于八角科（Illiciaceae）八角屬（Illicium）。從系統發育學的角度來看，八角被劃分為被子植物門中的一個古老分支，揭示出它與木蘭目植物的密切親緣關系，代表被子植物早期演化的一部分（中國科學院中國植物志編輯委員會，2016;Chenetal.，2019）。八角科植物的特征包括具有芳香的氣味和獨特的果實結構，凸顯了其在植物分類中的特殊地位（孫雪陽等，2011；曾麗萍等，2014）。八角是一種重要的香料和藥材資源，在經濟和藥用方面具有不可忽視的價值（Wangetal.，2011）。八角的干燥成熟果實富含高濃度的芳香油，是食品工業中極為重要的香料成分。八角芳香油具有獨特的甜香和辛辣風味，因此在烘烤食品、酒類、飲料、糖果等食品領域中得到廣泛應用（Heetal.，2024）。在中醫領域，八角因其具有溫陽散寒、理氣止痛的特性而被廣泛用于治療寒疝腹痛、腰膝冷痛等病癥（國家藥典委員會，2020）。廣西是我國最大的八角原產地和主產區，種植面積和產量占比均超過全國總量的8 5 % （Liaoetal.，2023），2023年八角種植產業年產值達40億元，作為“桂十味”藥材之一，其發展前景備受期待（Zouetal.，2023）。

八角的種質資源評價及優良品系篩選是提升其經濟價值和藥用價值的關鍵環節。廣西的種植者們通過嫁接換冠技術對低產八角林進行改良，以提高其生產力。自前，八角的研究主要集中在其生物學特性、活性成分和藥理作用等方面，如陸華業等（2024）探究光氮互作對八角幼苗生長和生理特性的影響，發現光照強度對八角幼苗的生長至關重要。此外，已有研究對八角的化學成分和藥理學研究進展進行了詳細綜述，表明八角的生物活性取決于是否存在有價值的次生代謝物，如單萜類、倍半萜類、苯丙烷類和黃酮類等（Patraetal.，2020；Sharafanetal.，2022）。同時，Li等（2022）通過鑒定八角果實中的20種化合物，并評估它們的抗病毒和抗氧化活性，為開發新的天然產物提供了科學基礎。但是目前，對八角的分子遺傳學研究相對較少，直接影響了八角優良種質的篩選進程，這在一定程度上阻礙了八角產業的科學化發展。以往的研究主要依賴于八角的花色、葉形和果實外部形態等特征來劃分種質資源類型，而缺乏遺傳學的證據支持（孫雪陽等，2011;戴曉蕭和江立庚，2019）。在廣西不同地區，八角種質資源的遺傳背景尚未得到系統性的研究，各地居群及人工篩選的優良種質間的遺傳變異和群體結構問題也未被充分闡明。

SLAF-seq（specificlocus amplified fragmentsequencing）技術是一種結合了限制性酶切和PCR擴增步驟的高通量測序方法，主要用于基因組水平上的單核苷酸多態性（SNP）鑒定和遺傳變異分析（趙亞琴等，2021）。該技術能夠高效地識別植物種質資源中的遺傳變異位點，深入揭示其遺傳機制、進化歷史和種質關系，為優良種質選育提供理論依據，從而顯著縮短新品種選育的周期。SLAF-seq技術因其高效、經濟且適用于大規模研究的特點，而在植物遺傳學、作物改良和種質資源保護等領域展現出廣泛的應用前景（崔學強等， 。以菘藍為例，劉東等（2024）利用SLAF-seq技術結合葉片表觀特征分析，成功區分了25個不同生態類型的菘藍，揭示了這些生態類型之間的遺傳關系。此外，沈濤等（2023）通過SLAF-seq技術研究了分布于不同地區的19個滇龍膽居群樣本的遺傳結構和遺傳多樣性，認為環境隔離是導致滇龍膽種群分化的主要因素之一。綜上表明，SLAF-seq技術在傳統藥用植物種質資源的多樣性研究中發揮著重要作用。然而，該技術在八角種質資源的遺傳多樣性分析研究中尚未得到應用。

針對廣西八角種質資源遺傳背景缺乏系統性研究這一瓶頸問題，有學者利用第二代分子標記和DNA條形碼對八角的遺傳多樣性進行了初步分析。余興華等（2022）利用SSR分子標記技術對8種不同花色的八角種質進行了分析；王乙淋等（2023）基于ITS2和 p s b A - t r n H 序列對廣西的13個八角居群展開了八角譜系地理學研究。但是，由于前人的研究中收集到的八角種質資源數量有限，并且第二代標記的標記密度和通量低等技術缺點，因此對廣西八角遺傳多樣性的研究還不夠深入和系統。本研究收集了來自廣西多個地區居群以及經過人工篩選的八角樣本共計95份，運用SLAF-seq技術，成功獲取了豐富的SNP標記數據。借助這些分子標記，對八角樣本進行深入的系統發育分析、群體結構解析以及遺傳關系的探討，以期揭示廣西不同地區八角居群與人工篩選優良種質間的遺傳多樣性和親緣關系，為廣西八角種質資源的評估和新品種選育工作提供良好的理論基礎和科學依據。同時，本研究對于八角品種的科學分類、規范命名、種質資源的準確評價以及優良品種的選育具有極其重要的理論指導價值。

1材料與方法

1.1實驗材料

對廣西八角主要分布區域的八角材料進行采集，共收集到95份八角材料。這些材料中共有53份來自不同地區的居群樣本（表1），包含桂南（GS）地區居群樣本17份，其中7份來自欽州浦北（PB），10份來自防城港（FCG）；桂中部（GM）地區居群樣本8份，均來自南寧上林（SL）；桂西（GW）地區居群樣本16份，其中8份來自河池鳳山（FS），8份來自百色（BS）;桂北（GN）地區居群樣本6份，均來自桂林（GL）；桂東（GE）地區居群樣本6份，均來自梧州藤縣（TX），以上提及的地方居群樣本均為當地種子苗種植的成年樹，種植時間超過10年。為避免同一克隆個體的重復采集，在樣地調查的基礎上，各居群采集相隔距離大于 5 0 m 的八角單株。其余材料為目前八角嫁接換種時作為接穗的優良種質（GV），包括TM、CP、LM、MW、DR、EN、SS、GJ、ME、HY等種質各3份，以及HZ、BH、HZ-1、RG、FJJ、SJ等種質各2份，共計42份。這些種質均來自梧州藤縣，并經過人工篩選，是目前較為常用的八角優良接穗種質。以上95份材料經廣西中醫藥大學黃榮韶教授鑒定為八角（Illiciumverum）。采集其幼嫩的葉片并記錄經緯度，將采集的95份種質的嫩葉液氮速凍 保存備用。

1.2八角基因組DNA的制備

本研究采用CTAB法提取95份八角的總DNA。通過電泳檢測方法對所提取的八角DNA進行質量檢測，并使用NanoDrop分光光度計對八角DNA濃度和純度進行檢測，檢測合格后用于后續SLAF-seq建庫測序。

1.3高通量測序

選擇八角近緣物種鵝掌楸基因組作為參考進行電子酶切預測，確定適用的酶切組合，確保這些組合能夠產生在基因組上隨機分布且含有較低比例重復序列的片段標記。本研究中，遵循上述規則并采用的內切酶組合為HaeII和HinCⅡI，利用上述酶切組合處理測序樣品的基因組DNA，構建SLAF測序文庫，并在IlluminaHiSeq系統上進行PE150測序。

1.4數據處理和變異檢測

為獲取有效數據，刪除接頭污染、低質量Reads污染和引物污染的序列。使用LAST（lastal759）對高質量Reads進行聚類，得到SLAF標簽，構建“假”參考基因組。參考序列根據相應SLAF標記的最大測序深度選擇每個位點。將高質量的測序Reads利用bwa軟件比對到參考基因上，利用

表153份八角地方居群樣本基本信息

GATK軟件進行局部重比對。為確保變異檢測結果準確，使用samtools和GATK進行檢測，獲取一致性SNP位點（完整性 gt; 0 . 8 和 M A Fgt;0 . 0 5 ）進行后續分析。

1.5數據分析

通過數據挖掘和SNP檢出后，將SNPs信息用于遺傳進化分析。使用MEGAX軟件和鄰接算法（Kimura2-parameter模型，1O00 次bootstrap重復）構建系統發育樹。基于最大似然法和 K 值范圍為1～10，使用Admixture軟件進行群體結構分析，并分析 K 值的交叉驗證誤差率。使用聚類軟件EIGENSOFT對95份八角材料進行主成分分析（principalcomponentanalysis，PCA）。遺傳多樣性分析根據每個居群的SNP信息，利用百邁客生物科技有限公司編寫好的perl腳本進行計算。

2 結果與分析

2.1酶切方案評估和測序結果

鑒于目前尚無八角的參考基因組，本研究選擇了與八角親緣關系較近的鵝掌楸基因組（Chenetal.，2019）作為參考。根據電子酶切預測，選擇了限制性內切酶HaeI和HinCⅡI，并確定酶切片段的長度為 3 6 4 ～ 4 6 4 b p ，以此作為SLAF標簽。為了評估測序數據的質量，將95個八角個體的測序數據（Reads數量、GC含量和 ）進行統計。統計結果顯示，從95份測序樣品中共獲得1588MbReads數據，測序 范圍為 8 8 . 9 7 % ～ 9 6 . 6 2 % ，平均 為 9 2 . 8 8 % ，GC 范圍為 4 3 . 2 2 % ～ 4 5 . 6 1 % ，平均GC含量為 4 4 . 2 9 % 。綜上表明，本研究獲得的測序數據測序質量高，測序結果可靠，滿足后續分析需要。

2.2SLAF標簽和SNP統計

通過生物信息學分析，從95份八角種質資源中獲得了643690個SLAF標簽（平均測序深度為9.71X），其中有74434個為多態性SLAF標簽，產生了2690564個群體 。這些SNP的完整度最高為 4 7 . 6 7 % ，最低為 1 4 . 3 3 % ，平均完整度為2 9 . 3 5 % ；雜合率最高為 7 . 7 8 % ，最低為 2 . 0 6 % ，平均雜合率為 4 . 4 6 % （表2）。為研究不同八角種質間遺傳關系，基于上述群體SNP結果，篩選出了229017個高質量SNP標記。

2.3主成分分析和系統發育分析

為明確廣西不同地區八角居群樣本以及經過人工篩選的優良種質之間的親緣進化關系，本研究基于篩選出的高度一致性的有效SNP變異位點，對95份八角種質進行了主成分分析（PCA）和系統發育分析。如圖1所示，PCA分析將95份八角種質分為2個類群（類群I和類群ⅡI），PC1和PC2的積累方差貢獻率為 8 . 4 9 % 。類群I中的樣本材料為桂北、桂西及部分桂中部地區八角居群樣本，分布于主成分坐標軸的右側，并且這些樣本的分布較為聚攏；類群Ⅱ中的樣本材料為桂南、桂東和部分桂中部地區八角居群樣本，以及42份經過人工篩選的優良種質，分布于主成分坐標軸的左側。相較于類群I，類群Ⅱ的樣本在PCA分布空間上表現出較為分離的趨勢，表明該類群八角種質來源多樣，遺傳多樣性較高。

與PCA分析結果類似，系統進化樹（圖2）分析將95份八角種質分成2大類群：類群I為來源于桂北、桂西和3份桂中部地區的居群樣本（NNSL3、NNSL4、NNSL5）；類群II為桂東、桂南和余下的桂中部地區八角居群樣本及42份經過人工篩選的優良種質材料（圖2）。根據系統發育樹結構進一步分析，可以將大類群Ⅱ樣本細分為3個亞類群，其中大部分桂南、桂東、桂中部地區的八角居群樣本各自聚為1個亞類群（Ⅱ-1、ⅡI-2、II-3），42份經過人工篩選的優良種質材料則穿插分布于3個亞類群中。具體而言，有14份人工篩選優良種質（HZ1、HZ2、HZ-1、HZ-2、EN2、EN3、SJ1、SJ2、FJJ1、FJJ2、RG1、RG2、BH1、BH2）與桂南地區八角居群樣本聚合為Ⅱ-1亞類群；21份人工篩選優良種質（LM1、LM2、LM3、ME1、ME2、ME3、HY1、HY2、HY3、CP1、CP3、GJ1、GJ3、MW1、MW2、MW3、SS1、SS2、SS3、MT1、MT2）與桂東地區八角居群樣本聚為Ⅱ-2亞類群;7份人工篩選優良種質（CP2、MT3、EN1、GJ2、DR1、DR2、DR3）則與桂中部地區八角居群樣本聚為Ⅱ-3亞類群。以上分析結果表明，不同地區八角居群樣本的遺傳結構在地理分布上具有明顯的地域特征;此外，人工篩選的優良種質材料與桂南、桂東和桂中地區的八角居群樣本之間的親緣關系更為接近。

2.4群體遺傳結構

為進一步了解廣西八角的遺傳背景關系，本研究利用上述具有高度一致性SNP分子標記，通過Admixture分析95份八角種質的群體遺傳結構（圖3）。交叉驗證聚類結果顯示，當 K = 2 時，交叉驗證錯誤率與 K = 1 時幾乎相近，表明這些樣本分成1個類群或者2個類群均是比較合理的。當K = 2 時，95份八角樣本劃分成2個不同的群體（圖3：A），與PCA和系統發育樹分類結果高度一致。因此，本文認為 K = 2 相比于 K = 1 是更為合理的分群方法?；?K = 2 的分組結果（圖3：B），類群I基本為藍色基因型樣本，少部分樣本混雜了部分紅色基因型；類群Ⅱ的樣本中以紅色基因型為主導，其中亞類群ⅡI-1、I-2中部分人工篩選優良種質有近一半為藍色基因型，表明這些樣本與類群Ⅰ樣本之間存在一定的基因交流。

2.5遺傳多樣性分析

通過分析遺傳多樣性可以揭示不同地方居群之間的基因流動和遺傳變異，有助于解析地理隔離和環境因素對物種遺傳結構的影響（吳敏等，2024）。在本研究中，我們對廣西5個地區八角居群樣本及人工篩選的優良種質材料進行了遺傳多樣性指數的計算，發現八角各居群的觀測雜合度（204號 ）介于0.130至0.318之間，平均為0.231；期望雜合度（ ）則在0.262至0.364之間變動，平均值為0.320（表3）。值得注意的是，所有樣本的觀測雜合度均低于期望雜合度，表明群體內部可能存在自交現象。在居群層面，次要等位基因頻率（minorallele frequency，MAF）為 0 . 1 8 ～ 0 . 2 7 ，平均值為0.23；Nei多樣性指數 （ H ） 為 0 . 2 6 8 ～ 0 . 4 1 1 ，平均值為0.350;香農維納指數 （ I ） 為 0 . 4 1 7 ～ 0 . 5 4 3 ，平均值為0.489。多態性信息含量（polymorphisminformation content，PIC）為 0 . 2 1 9 ～ 0 . 2 9 1 ，平均值為0.260，顯示所有6個居群均展現出中度多態性（PIC值為 0 . 2 5 ～ 0 . 5 ），表明群體中存在一定的遺傳結構，如群體內部可能存在亞群結構，或者群體可能受到一些遺傳漂變的影響。此外，桂北地區的八角居群在MAF . H ， I 和PIC上均最高，其次是桂東、桂中、桂西和桂南地區的八角居群，而人工篩選的優良種質群體的遺傳多樣性評估值最低。這些結果表明，在95份樣本中，不同地區八角居群的遺傳多樣性存在顯著性差異，其中桂北地區的八角居群表現出最高的遺傳多樣性，而人工篩選的優良種質群體則顯示出最低的遺傳多樣性。

3 討論與結論

3.1SLAF-seq在遺傳多樣性分析上的優勢

廣西八角種植歷史悠久，其種質資源豐富且表型多樣，這些表型差異表現在外觀性狀和內在品質等方面（潘曉芳等，2007）。表型多樣性是遺傳多樣性與環境適應相互作用的產物，它既具有穩定性，也展現出一定的變異性（Lietal.，2018）。盡管基于表型的分類方法具有直觀性，但該方法的主要局限性在于其難以剔除環境因素對生物形態特征的影響。例如，八角花中的花青素含量受到光照、溫度等多種環境因素的影響，這些因素顯著地調節著其顏色的表現（曾祥艷等，2024）。因此，揭示廣西八角不同種質資源的遺傳多樣性，對于八角種質資源的分類、優良種質篩選、開發與保護具有重要理論指導意義。與傳統的分子標記技術相比，SLAF-seq技術能夠提供更多的遺傳標記且不受參考基因組的限制，可用于藥用植物種質資源評價鑒定、遺傳圖譜構建、親緣關系分析等研究（崔學強等，2023a，b）。本研究利用SLAF-seq技術對來源于廣西的5個地區53份八角居群樣本和42份經過人工篩選的優良種質進行高通量測序，標簽的平均測序深度為9.71X，測序平均 為9 2 . 8 8 % 。本研究共得到1588MbReads，獲得SLAF標簽643690個，其中多態性SLAF標簽74434個。群體SNP2690564個，獲得高度一致性SNP位點229017個。因此，基于本研究獲得的高通量SNP對95份八角樣本進行遺傳多樣性分析，相比于前人的研究將會大幅度提高分析結果的分辨率與準確度。

3.2廣西八角的遺傳結構分析

種質資源是開展遺傳育種工作的基礎，群體遺傳學分析可以幫助我們了解物種內部的遺傳多樣性和遺傳結構，從而指導種質資源的保護和利用，并為優良種質選育和遺傳改良提供重要的信息（閆平玉等，2024）。在本研究中，PCA分析、系統發育分析和群體結構分析結果一致表明，廣西不同地區的八角居群樣本可以分為2個類群，這2個類群有較為明顯的地域差異特征。地理分布是影響種群的遺傳結構的一個重要因素（李旭民等，2022）。本研究中，桂西、桂北居群樣本與桂東、桂南居群樣本分別聚為2大類群，這可能是由于引種地區環境、氣候差異較大條件下，八角在長期適應過程中逐漸產生了可遺傳的地理變異，最終分化為2大類群，使得廣西八角遺傳結構具備明顯的區域特征（黃卓民，1994）。桂中部地區八角種質在2大類群中均有分布，推測可能是由于南寧作為環北部灣沿岸重要的經濟中心和交通樞紐而給該地區八角引種栽培帶來了極大的便利，增加了其基因流動性。此外，本研究收集的八角優良種質的遺傳背景更接近于桂南、桂東地區八角居群，表明目前市場上主要流通的各種八角優良種質主要從桂南、桂東地區八角種植產地篩選而來。

表3八角群體遺傳多樣性指數

3.3廣西八角的遺傳多樣性分析

本研究中，我們還評估了不同地方居群樣本以及人工篩選的優良種質的群體遺傳多樣性，研究結果顯示桂北地區八角群體的遺傳多樣性最高，而桂南地方居群樣本的遺傳多樣性最低。究其原因，一是桂北地區并非八角的適宜種植地區，較高的遺傳多樣性有助于植物種群適應生態環境的變化；二是該地區八角種植引種時間相對較短，導致該地區的八角基本沒有經歷過人工選擇。此外，地理隔離的因素也可能是導致桂北地區八角遺傳多樣性高的原因之一（黃卓民，1994）。相比之下，其他地區尤其是桂南地區（防城港）的八角種植歷史相對悠久，可能因經歷過較長時間的人工選擇過程而導致遺傳多樣性有所降低。人工篩選的優良種質的遺傳多樣性均低于各地區居群樣本，進一步佐證了以上推測。此外，期望雜合度是衡量種群遺傳多樣性的關鍵指標。本研究中，所有八角群體樣本的觀測雜合度低于期望雜合度，這可能由以下3個因素引起：（1）基因流可能帶來外來基因，從而影響原有的遺傳多樣性；（2）近親繁殖可能增加純合子頻率，減少雜合子頻率；（3）自然選擇可能傾向于某些等位基因，增加特定純合基因型的比例。結合廣西八角的實際情況，我們認為近親繁殖（自交）可能是導致觀測雜合度低于期望值的主要因素，這與陳昌婕等（2024）對蘄艾遺傳多樣性的研究結果相類似。并且，王乙淋等（2023）關于廣西八角居群間基因交流頻繁的研究結果也支持這一觀點。

綜上所述，本研究利用SLAF-seq技術詳細分析了廣西不同地方居群樣本以及經過人工篩選的優質種質間的遺傳結構和遺傳多樣性，不僅為這些經過人工篩選的八角優良種質遺傳背景的認定及科學系統的劃分提供了理論參考，也為推進廣西八角品種的鑒定、種質分類和分子輔助育種工作的開展提供了科學的研究基礎。

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（責任編輯 李 莉王登惠）