匹妥布替尼在大鼠體內的代謝產物鑒定及代謝途徑分析

中圖分類號R969.1;R917 文獻標志碼A 文章編號1001-0408（2025）09-1076-06

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2025.09.10

ABSTRACTOBJECTIVEToanalyzeandidentifythemetabolitesof pirtobrutinib（PTN）inrats，andclarifythe posible metabolic pathways of PTN in rats.METHODS Six rats were intragastrically administered with 1 0 m g / k g PTN suspension. Blood sampleswerecollctedfromtherats30minutesbeforeadministrationandat0.25，0.5，1，2，4，6，8，12，24hoursafter administration.Urineandfecessampleswerecolected12 hours beforeadministrationand24hoursafteradministration.UHPLOrbitrapExploris240systemcombined withCompoundDiscoverer3.0andXcalibur2.Osoftwarewereadoptedforstructural identificationandmetabolicpathwayanalysisofPTNmetabolitesinratplasma，urine，andfeces.RESULTSAtotalof29PTN metaboliteswereidentified，ncluding17，19and22metabolites inplasma，urineandfeces，respectively.Themetabolicpathways of PTNmainlyincludedoxidation，sulfation，gluuronidation，etc.，andits metaboliteswere mostlycombinationproductsof two ormorediferentmetabolicforms.Indetail，atotalof26metaboliteswereasociatedwithphaseImetabolicreactions（14 oxidationmetabolites，9reduction/dehydrogenationmetabolites，8demethylationmetabolites，and5hydrolysismetabolites）. Meanwhile，atotalof 20products were involved in phaseI metabolites （14 sulfation metabolitesand8glucuronic acid binding metabolites）.CONCLUSIONSPTNexhibitsadiverserangeof metabolites inratfecalsamples，withtheprimarymetabolic pathways being oxidation，sulfation，glucuronidation，and others.

KEYWORDS pirtobrutinib；metabolites；metabolic pathway

匹妥布替尼（pirtobrutinib，PTN）是一種新型的具有高選擇性、可逆性特點的非共價布魯頓氏酪氨酸激酶（Bruton'styrosinekinase，BTK）抑制劑[]。研究表明，PTN治療慢性淋巴細胞白血病或小淋巴細胞淋巴瘤安全有效，并且在存在C481獲得性抗性突變的情況下也可充分抑制BTK的活性2]。PTN作為第一個獲批上市的第三代非共價BTK抑制劑[3-4，在我國被批準用于既往接受過BTK抑制劑治療的復發或難治性套細胞淋巴瘤成人患者。

PTN雖然在淋巴細胞惡性腫瘤治療領域具有廣闊的應用前景，但目前其在體內的代謝產物及代謝途徑尚不十分清楚。而開展藥物的體內代謝產物和代謝途徑研究對于探索藥物作用機制以及指導臨床應用具有重要意義[6-]。高分辨質譜是一種用于未知化合物結構鑒定的有效工具，在藥物代謝產物鑒定領域得到了廣泛應用[8-9]。鑒于此，本研究采用UHPLC-OrbitrapExploris240系統，結合質譜解析軟件及未知化合物結構鑒定策略，對大鼠血漿、尿液和糞便中PTN代謝產物進行分析與鑒定，并推測其在大鼠體內的代謝途徑，以期為PTN的體內代謝和藥效物質基礎研究提供有效參考。

1材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有：Vanquish型超高效液相色譜儀、OrbitrapExploris240高分辨質譜儀（美國ThermoFisherScientific公司），XPE205DR型十萬分之一天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用的主要藥品與試劑有：PTN對照品（上海東蒼生物科技有限公司，批號DC500200，純度 gt; 9 8 % ），二甲基亞砜（北京百靈威科技有限公司，批號LO50V115，純度 9 9 . 8 % ，羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，國藥集團化學試劑有限公司，批號20210402），甲醇、乙腈（美國ThermoFisherScientific公司，色譜級）。

1.3 動物

6只8周齡SD雄性大鼠，體重 （ 2 3 0 ± 1 0 g，購自北京華阜康生物技術有限公司[生產許可證號：SCXK（京）2024-0003]。將大鼠置于代謝籠中，實驗前在SPF條件下飼養1周，飼養期間自由攝食、飲水（給藥前 1 2 h 禁食）。本研究通過首都醫科大學附屬北京友誼醫院實驗動物管理與使用倫理委員會審查批準，倫理審查號：24-1003。

2 方法

2.1 PTN混懸液的配制

先使用純凈水配制 0 . 5 % C M C - N a 溶液，磁力攪拌4 8 h 使其形成穩定的溶液，再精密稱取PTN對照品1 9 . 9 2 m g 加人溶液中，超聲混勻，配制成質量濃度為1.0m g / m L 的混懸液。

2.2 動物實驗樣本采集

6只大鼠按照 1 0 m g / k g （根據前期預實驗結果確定）灌胃PTN混懸液，灌胃體積約為 2 . 3 m L 。所有大鼠在給藥前 3 0 m i n 以及給藥后0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24h

時，分別采集血液約 0 . 2 m L 到EDTA-K2抗凝管中，離心后取上層血漿。同時，分別收集各組大鼠給藥前 以及給藥后 2 4 h 的尿液和糞便。

2.3 樣本前處理

血漿：合并后混勻各時間點每只大鼠的血漿，取2 0 0 μ L ，按照4：1的體積比加入冷甲醇（ 沉淀蛋白，以 1 4 0 0 0 r / m i n 離心 1 5 m i n 后取上清，氮氣吹干后用1 0 0 μ L 的 5 0 % 甲醇復溶。尿液：取各時間點每只大鼠的尿液 2 0 μ L ，混勻后處理方法同血漿。糞便：糞便自然干燥后研磨成粉末，取各時間點每只大鼠均質化后的糞便粉末 ，混勻后加人5倍體積的 5 0 % 甲醇，超聲3 0 m i n ，以 1 4 0 0 0 r / m i n 離心 3 0 m i n 后取上清，氮氣吹干，用 5 0 % 甲醇 1 0 0 μ L 復溶。

2.4 檢測條件

色譜條件：采用WatersXSelectHSST3（ 1 0 0 m m × 色譜柱，以水（含 0 . 1 % 甲酸）為流動相A、乙腈（含 0 . 1 % 甲酸）為流動相B進行梯度洗脫（ 0 ～ ; ， 100 % B ： ， ；柱溫為 ；流速為 0 . 5 m L / m i n ；進樣體積為 8 μ L

質譜條件：采用電噴霧離子源，在正、負離子模式下掃描；電噴霧電壓分別為 3 . 5 ， - 2 . 5 k V ；碰撞能梯度參數為 1 5 ， 2 0 ， 2 5 e V ；毛細管溫度為 ；輔助氣流速為10arb;掃描范圍為質荷比 （ m / z ） 5 0～1 0 0 0 D a（ F u l l M S）

2.5樣本檢測及數據處理

取“2.3\"項下樣本按\"2.4\"項下條件進樣分析。使用Xcalibur2.0數據處理系統采集和處理質譜數據，同時使用CompoundDiscoverer3.0軟件對實驗樣品和給藥前的血漿空白樣品進行二元比對；設置質量偏差小于5ppm，并根據同位素豐度比、氮規則解析等發現可能的代謝產物。然后根據精確分子質量、元素組成、保留時間（retentiontime，RT）等信息確定可能的潛在代謝產物，再針對性采集這些代謝產物的二級譜圖，并對其二級碎片離子進行解析，確定代謝位點。

3結果

3.1PTN的體內代謝產物分析結果

通過對大鼠給藥前后的血漿、尿液和糞便圖譜進行分析，并結合精確分子質量、RT、二級碎片離子等參數，共初步鑒定出29種代謝產物。其中，在血漿、尿液、糞便中分別檢測到17、19、22種代謝產物；僅在血漿中檢測到的代謝產物有4種，僅在糞便中檢測到的代謝產物有6種，在血漿、尿液、糞便中均檢測到的代謝產物有10種。具體質譜信息見表1，PTN代謝產物的提取離子流圖見圖1。

3.1.1 代謝產物M1、M2、M14、M17

M17（ 的準分子離子峰 為 m / z 558.1094，推測其分子式為 。該代謝產物較PTN的分子量增加了 ，并且其二級質譜圖中也有 的特征碎片離子峰 m / z 7 9 . 9 5 7 5 ，并且有準分子離子峰失去1個酰胺基生成的特征碎片離子峰 m / z 515.1028和丟失1個— 個一HF后生成的特征碎片離子峰 m / z 4 3 8 . 1 3 9 2 ，故筆者推斷其為PTN原型藥物的硫酸化代謝產物。M2 （ R T = 6 . 2 8 m i n 的準分子離子峰 為 m / z 4 0 5 . 0 4 9 4 ，分子式為 ，推斷其為M17酰胺鍵發生水解斷裂后產生。在其質譜圖中，可見M17失去1個酰胺基生成的碎片離子峰 m / z 362.0415，同時存在準分子離子峰丟失1個一 和1個一HF產生的特征碎片離子峰 m / z 3 0 5 . 0 8 0 5 和丟失1個—SO3和2個—HF后產生的特征碎片離子峰

M1（ 的準分子離子峰 為 m / z 407.0653，分子式為 ，比M2的分子量增加了 2 D a ，推測其是由M2進一步發生還原反應后產生。M14（ 的準分子離子峰 為 m / z 515.1033，推測其分子式為 ；其分子量比M17少了 4 3 D a ，且其二級質譜中同樣存在較高的一 特征碎片離子峰 m / z 7 9 . 9 5 7 5 . 準分子離子峰丟失1個一HF后產生的特征碎片離子峰 m / z 4 9 5 . 0 9 7 2 以及酰胺鍵斷裂形成的特征碎片離子峰 ，故筆者推斷其為M17脫去吡唑環上的酰胺基后形成的產物，即為原型藥物發生水解脫酰胺基團及硫酸化后生成。

3.1.2 代謝產物M4、M5、M7、M19

M4（ ）、M5（RT=6.95min）、M7（ R T = 和M19（ R T=7 . 8 3 m i n 的準分子離子峰 [ M- 均為 ，分子式均為 ，比原型藥物分子量多出 9 6 D a （1個一 ），故筆者推斷上述化合物均為原型藥物發生氧化和硫酸化后生成，且互為同分異構體。具體來看，M7首先失去了1個一 個一NH3后生成特征碎片離子峰 m / z 4 7 9 . 1 3 3 4 ，該離子碎片會進一步斷裂形成特征離子碎片峰 、m / z 1 6 9 . 0 2 9 2 ，證明其氧化位置在甲氧基苯基一側；而對于M4、M5和M19，則無法明確其具體取代位置

3.1.3 代謝產物M6、M9

M6（ 和M 的準分子離子峰 均為 ，推測其分子式均為 ，兩者為同分異構體。其質譜圖中均存在準分子離子峰丟失1個一 生成的特征碎片離子峰 、丟失1個一GluA生成的特征碎片離子峰 ，同時存在準分子離子峰丟失1個一 和1個一GluA生成的特征碎片離子峰 m / z 4 7 8 . 1 5 1 4 ，故可推斷其為原型藥物發生硫酸化與葡萄糖醛酸化后形成的產物。

3.1.4代謝產物 M1 2 ， M1 8 ， M1 1 ， M1 5 ， M2 0

M12（ 的準分子離子峰 為 m / z 656.1976，推測其分子式為 。與原型藥物相比，M12的分子量增加了 1 7 6 D a ，推測其為原型藥物發生葡萄糖醛酸化后形成的產物；同時，其色譜圖中存在特征碎片離子峰 m / z 4 8 0 . 1 6 5 1 ，推測是準分子離子峰丟失了1個-GluA。M18（ R T=7 . 7 9 m i n 的準分子離子峰 為 m / z 4 9 6 . 1 6 0 3 ，推測其分子式為 。M18的分子量比原型藥物多了 ，且其在 m / z 294.0847處有特征碎片離子峰，故筆者推斷其氧化位置在甲氧基苯基一側。M11（ ）和M15（ R T= 的準分子離子峰 均為 ，推測其分子式均為 ，兩者互為同分異構體。其分子量比M12多了 1 6 D a ，比M18多了 1 7 6 D a ，故可推斷其為在M12的基礎上發生氧化或者在M18的基礎上發生葡萄糖醛酸化后形成的產物。M11的離子碎片特征與M7相似，在 處有特征碎片離子峰，故筆者推斷其氧化位置在甲氧基苯基一側;而M15在m / z 3 0 9 . 0 9 5 5 . m / z 1 5 3 . 0 3 4 4 處有特征碎片離子峰，推斷其氧化位置在苯并吡唑基團一側。M 0的準分子離子峰 為 m / z 6 2 9 . 1 8 6 5 ，推測其分子式為 ，分子質量比M12少了 ，故筆者推測其是在M12的基礎上發生脫酰胺基團后形成的產物。

3.1.5 代謝產物M13、M25、M3、M8、M21、M10、M29、M22

M13（ 的準分子離子峰 為 m / z 584.1586，推測其分子式為 。二級質譜圖顯示，其在 m / z 5 6 7 . 1 3 1 0 和 處有特征碎片離子峰，故筆者推測其是由原型藥物酰胺基上的氨基發生水解、半胱氨酸基團取代接著又失去1分子 后得到。M2 5 （ R T = 8 . 8 4 m i n ）的準分子離子峰 為 m / z 466.1496，推測其分子式為 。M25的分子量比原型藥物少了 1 4 D a ，且在 m / z 4 4 9 . 1 2 2 5 . m / z 3 1 1 . 1 1 1 1 . 處有特征碎片離子峰，故筆者推斷其為原型藥物苯環上甲氧基脫甲基后形成的產物。M3（ RT= 的準分子離子峰 為 ，推測其分子式為 ，可能是由M25發生葡萄糖醛酸化后得到。M8（ 和M21（ R T= 7 . 9 1 的準分子離子峰 均為 m / z 5 4 4 . 0 9 3 6 ，推測其分子式均為 ，二者同為M25發生硫酸化后形成的產物。M10 （ R T=7 . 2 1 m i n 的準分子離子峰 為 m / z 7 2 0 . 1 2 5 9 ，推測其分子式為 ，為M25同時發生葡萄糖醛酸化和硫酸化后生成。M29 ）的準分子離子峰[M一H]為 m / z 4 6 2 . 1 2 0 5 ，推測其分子式為 ，為M25脫去2個氫原子后生成。M22 ）的準分子離子峰 為m / z 5 5 8 . 0 7 2 6 ，推測其分子式為 ，為M29進一步發生氧化和硫酸化后生成。

3.1.6 代謝產物 M2 7 Ω. M2 3 Ω. M2 4 Ω. M2 6 Ω. M2 8 Ω. M1 6

M27（ 的準分子離子峰 為 m / z 478.1502，推測其分子式為 。其分子量比原型藥物少了 2 D a ，且在 m / z 4 6 1 . 1 2 3 7 . m / z 3 0 9 . 0 9 6 2 . m / z 153.0348處有特征碎片離子峰，故筆者推斷其為原型藥物苯基吡唑一側脫2分子氫后形成的產物。M23（ R T= 8 . 3 5 m i n 的準分子離子峰 為 m / z 4 9 4 . 1 4 4 3 ，推測其分子式為 ;M24（ ）的準分子離子峰 為 ，推測其分子式為 ，二者均為M27發生氧化后形成的產物。其中，M23在 處有特征碎片離子峰，推斷其氧化位置也在苯基吡唑一側。M26（ R T= 的準分子離子峰 為 m / z 4 7 8 . 1 1 5 9 ，推測其分子式為 ，為M23（或M24脫甲基后形成的產物。M28（ R T=9 . 7 2 1 min）的準分子離子峰 為 m / z 5 1 0 . 1 3 9 8 ，推測其分子式為 ，為M23（或M24）發生氧化后形成的產物。M16（ R T=7 . 7 3 m i n 的準分子離子峰 為 ，推測其分子式為 。其準分子離子峰失去1分子 后產生特征碎片離子峰 ，且其在 、m / z 1 8 6 . 0 2 7 8 處有特征碎片離子峰，故筆者推測其為原型藥物的酰胺鍵發生水解斷裂，脫掉2個胺基后發生氧化生成的產物。

3.2 PTN的體內代謝途徑分析

PTN在血漿、尿液和糞便中主要涉及的代謝途徑包括氧化、硫酸化、葡萄糖醛酸化、水解、脫甲基、脫氫、還原、脫胺以及上述反應的組合。涉及I相代謝反應的產物共計26個（氧化14個、還原/脫氫9個、脫甲基8個、水解5個）涉及Ⅱ相代謝反應的產物共計20個（硫酸化14個、葡萄糖醛酸化8個）；半胱氨酸偶聯產物只在尿液和糞便中檢測到，脫胺產物只在血漿和糞便中檢測到。推測的PTN相關代謝途徑見圖2。

4討論

本研究采用UHPLC-OrbitrapExploris240系統聯合CompoundDiscoverer3.0和Xcalibur2.0數據分析軟件，對PTN在大鼠血漿、尿液和糞便中的代謝產物進行結構鑒定與代謝途徑分析。由于PTN在大鼠體內的半衰期數據未見報道，本研究為了在實驗過程中收集到更多的代謝產物，所以將血液樣品的采集時間設定為給藥后0 . 2 5 、 0 . 5 、 1 、 2 、 4 、 6 、 8 、 1 2 、 2 4 h ，尿液和糞便的采集時間設定為給藥后 2 4 h 。美國FDA公布的PTN的藥品說明書內容顯示：PTN在體外主要通過細胞色素P450代謝，并通過尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶（uridine diphosphateglucuronosyltransferase，UGT）（如UGT1A8和UGT1B9）直接糖基化。人體試驗中單次口服 PTN后，其絕對生物利用度為 7 5 . 9 % ～ 9 0 . 9 % ，中位數為 8 5 . 5 % ；血藥濃度達峰時間為 0 . 8 3 3～4 . 1 5 0 h ，中位數為 2 . 0 0 0 h ；其在人體內 3 7 % 的劑量通過糞便排泄（ 1 8 % 為原型藥物）、5 7 % 的劑量通過尿液排泄（ 10 % 為原型藥物）。本研究發現，PTN在大鼠體內的代謝產物多為2種及以上不同代謝形式的組合產物，代謝形式主要涉及氧化、還原、脫甲基、水解等I相代謝反應；代謝形式涉及Ⅱ相代謝結合反應的代謝產物有20個，主要包括葡萄糖醛酸化代謝產物以及硫酸化代謝產物。

本研究發現，有4種PTN代謝產物僅可在血漿樣本中檢出，這可能由于其未被轉化生成極性更大、更容易被排泄出體外的代謝產物，或是由于其在尿液或糞便中的含量太低而未被檢出；有6種代謝產物僅可在糞便中檢出，均為發生硫酸化和葡萄糖醛酸化反應后形成的代謝產物，說明此類通過Ⅱ相代謝反應后得到的代謝產物可以快速從血液排泄到糞便[0]

目前，筆者尚未檢索到關于PTN在體內的代謝產物結構或代謝途徑的文獻報道。在本研究中，筆者根據質譜裂解信息及RT等信息對PTN代謝產物的取代基位置進行了推斷。筆者參考文獻報道的方法[11-12]，利用Com-poundDiscoverer3.0軟件對質譜數據進行解卷積并提取響應較大的峰，獲得每個峰的 m / z 、RT和信號強度等信息，再對列表中化合物的二級質譜信息進行有針對性的分析和結構鑒定。值得注意的是，由于藥物代謝存在種屬差異[13]，大鼠體內PTN的代謝數據不能完全反映其在人體內的代謝過程。

綜上所述，本研究利用UHPLC-OrbitrapExploris240系統，在大鼠生物樣本中共鑒定出29種PTN的代謝產物（在血漿、尿液和糞便中分別鑒定出17、19和22種），其主要代謝途徑為氧化、硫酸化、葡萄糖醛酸化等。

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（編輯：林靜）