瑪卡總皂苷促人視網膜母細胞瘤Y79細胞凋亡作用研究

中圖分類號 R285.5 文獻標識碼A 文章編號 1007-7731（2025）09-0111-05

DOI號 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2025.09.024

AbstractTo investigate the effct and mechanism of Lepidium meyenii Walp.saponin （LMS） in promoting apoptosis ofhumanretinoblastoma Y79cels，Lepidium meyenii Walp.wasusedas theexperimentalmaterial to extract its saponins.Y79 cells were treated with different concentrations of LMS （O，10O，2OO，400，and 8 0 0 μ g / m L ），and the effcts ofLMSonY79cellproliferationandapoptosisatdiffrent treatmenttimes （24，48，and72h）weredetected.The expression levels of pro-apoptotic factors， including Caspase ， Caspase-8， and Caspase genes and proteins， were measured.The results showed that 2.58 g of total saponins were extracted from 5O g of maca dry powder，with an extraction yield of 5 . 1 6 % . LMS treatment inhibited the proliferation of Y79 cells and induced their apoptosis，with the optimal effect observed at 4 0 0 μ g / m L for 48 h，resulting in a cell viability rate of 5 4 . 0 5 % and an apoptosis rate of 2 1 . 8 7 % .Under these conditions，LMS promoted the expression of Caspase-3，Caspase ，and Caspase-9 genes and upregulated the expression of Cleaved caspase ， Cleaved caspase-8，and Cleaved caspase proteins.In conclusion， LMS can inhibit theproliferation of Y79cellsand induce their apoptosis，and its mechanism maybe related to the upregulation of pro-apoptotic factors Caspase ，Caspase-8， and Caspase

Keywords retinoblastoma; Lepidium meyenii Walp.saponin; cell proliferation; cell apoptosis

視網膜母細胞瘤也稱視網膜惡性膠質瘤（Retinoblastoma，RB），是由于抑癌基因RB1突變或缺少引發的嬰幼兒眼內惡性腫瘤之一[]。視網膜母細胞瘤隨著病情的惡化，可能會導致失明，甚至危及生命[2-3]。瑪卡（LepidiummeyeniiWalp.）是一種十字花科一年生草本藥食同源植物，其具有緩解疲勞、抗氧化、抗衰老等多種作用[4-5]。楊采霞等研究表明，瑪卡復方提取物不會損傷小鼠的肝腎組織且對游泳力竭小鼠具有抗疲勞作用。史俊友等從瑪卡中提取出了較多的抗氧化成分。

皂昔作為一種天然活性成分，具有免疫調節等多種生物學活性。祝明濤等研究指出，植物皂苷具抗腫瘤活性。李月等利用乙醇回流法成功提取了瑪卡總皂苷（LepidiummeyeniiWalp.saponin，LMS）。目前，關于LMS抗腫瘤活性的研究有待深入，本研究以LMS為試驗藥物，處理人視網膜母細胞瘤Y79細胞，探究LMS對其凋亡的誘導作用及分子機制，為開發皂苷類抗人視網膜母細胞瘤天然藥物提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

人視網膜母細胞瘤Y79細胞株（貨號SNL-532），購自武漢尚恩生物技術有限公司。瑪卡，購自云南省迪慶藏族自治州香格里拉縣藥材市場，經鑒定為十字花科植物瑪卡的干燥根莖。

1.2試驗試劑與儀器

人參皂苷標準品Rb1、蛋白質免疫印跡發光試劑，均購自大連美侖生物技術公司；RPMI1640培養基、胎牛血清，均購自Thermoscientific公司；增強型CCK-8試劑盒，購自碧云天生物技術公司；細胞凋亡檢測試劑盒、HiScrip ⅡIQ RT SuperMiX for qPCR逆轉錄試劑盒、ChamQTMSYBR qPCRMaster MiX試劑盒，均購自南京諾唯贊生物科技公司； β - 肌動蛋白（β-actin）單抗、裂解型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3（Cleavedcaspase ）單抗（14220S）、裂解型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-8（Cleavedcaspase-8）單抗、裂解型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-9（Cleavedcaspase-9）單抗，均購自CST公司;羊抗兔二抗，購自武漢ABclonaltechnology公司；RNA提取試劑盒，購自上海普飛生物技術公司；其他試劑均為

國產分析純。

GelDocXR型凝膠成像系統（Bio-Rad）;Trans-BlotSDcellWestern轉膜儀（Bio-Rad）;MB-530型酶標儀（深圳匯松科技公司）;SW-CJ-2F型潔凈操作臺（蘇州安泰空氣技術公司）；HF212型細胞培養箱（上海申力儀器公司）；CKX53型顯微鏡（OlympusCorporation）；ND2000微量分光光度儀（ThermoFisher）；Stepone Real-Time PCR System（ThermoFisher）;MiniChemiK4型化學發光儀（北京賽智科技公司）；ACEA NotoCyteTM Flow cytometer（ACEABiosciences Inc.）。

1.3實驗方法

1.3.1LMS的提取 參照文獻[9]的方法提取LMS，取一定質量的瑪卡粉末（80目），3倍體積石油醚脫脂，離心，濾渣4 0℃烘干，采用 5 0 % 乙醇，料液比 ）， ，提取 ，離心收集上清液，旋蒸濃縮，冷凍真空干燥，得LMS。采用人參皂苷Rb1作為標準品，以吸光度為 x ，總皂苷質量濃度為 y ，參考文獻[10]繪制標準曲線。同法制作LMS檢測液，以去離子水作參照，測定 5 5 0 n m 波長處LMS的吸光度值，代入人參皂苷Rb1標準曲線，計算LMS質量濃度 （ ρ ） ，LMS的得率 （ Y ） 計算如式（1）。

式（1）中， Y 為LMS得率， %：ρ 為LMS質量濃度， 0 V 為LMS提取液總體積， m L; m 為瑪卡原料質量， g; N 為LMS的稀釋倍數。

1.3.2細胞培養及LMS溶液配制 采用RPMI1640完全培養基， 培養Y79細胞，細胞密度 8 0 % 左右進行傳代及實驗。采用RPMI1640完全培養基作為溶劑，配制初始濃度為 8 0 0 μ g / m L 的LMS溶液，除菌過濾后備用。

1.3.3細胞增殖檢測 將 1 0 0 μ L 的 個 / m L Y79細胞懸液接種于96孔板內，采用細胞存活率反映LMS（LMS）對Y79細胞增殖的影響。試驗分為正常培養的Y79細胞組（對照組），不同濃度LMS試驗組，以及只有完全培養基的空白組，每組設置3個復孔。對照組每孔加入 9 0 μ L RPMI1640完全培養基，試驗組每孔加入 9 0 μ L LMS溶液，濃度分別為

1 0 0 ， 2 0 0 ， 4 0 0 ， 8 0 0 μ g / m L ，分別培養24、48、72h后，每孔加入 CCK-8試劑，于 （2 培養箱中孵育 ，冷卻至室溫后，酶標儀檢測 波長處的吸光度值。細胞存活率 R 計算如式（2）。

式（2）中， R 為細胞存活率， 為實驗組吸光度值； 為對照組吸光度值； 為空白組吸光度值。1.3.4細胞凋亡率檢測 取六孔板，每孔接入 1 × 個Y79細胞，培養 ，棄培養液。試驗組加入LMS培養液，對照組加入等體積的RPMI1640完全培養基。培養分別培養 $2 4 、 4 8 、 7 2 h ， 1" 0 0 0m i n 離心 5 m i n 收集細胞，PBS洗滌兩次，每孔加入

1 0 0 μ L 1 × Bindingbuffer重懸細胞，加人 AnnexinV-FITC和PI混勻，避光室溫反應 1 0 m i n ，加入 4 0 0 μ L 1 × Bindingbuffer混勻，上機檢測。

1.3.5基因表達量檢測 取六孔板，每孔接入 1 × 個Y79細胞，培養 離心 5 m i n 收集細胞，按照RNA提取試劑盒說明書和逆轉錄試劑盒說明書的操作方法提取RNA和合成cDNA。選取β -actin基因作為內參，采用熒光定量PCR檢測基因相對表達量，PCR反應程序：95℃預變性 5 m i n ；隨后進行30個循環的擴增（95℃變性 退火 1 5 s 延伸60s；反應結束后采集各樣本的Ct值。 計算基因相對表達量。采用NCBIPrimer-BLAST工具進行引物設計，各基因引物序列見表1。

1.3.6蛋白表達量檢測 取六孔板，每孔接入 1 × 個Y79細胞，培養 后，每孔加入適量的蛋白裂解液， 裂解 3 0 m i n ， 離心1 0 m i n ，收集上清，BCA法檢測蛋白質濃度。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質，將凝膠中的蛋白質電轉移至PVDF膜， 5 % 脫脂牛奶封閉PVDF膜2小時， 一抗 孵育過夜，TBST（Tris-borate-sodiumtween-20）緩沖液洗PVDF膜3次，每次 3 m i n 1：2000二抗室溫孵育 ，置于化學發光儀中進行蛋白質免疫化學發光顯影。

1.4數據處理

采用SPSS21.0軟件對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 LMS的提取得率

按照參考文獻[10]繪制人參皂苷Rb1標準曲線，得線性回歸方程 表明在 范圍內，人參皂苷Rb1質量濃度與吸光度值呈線性關系。準確稱取 瑪卡干粉，按照試驗方法提取LMS，可獲得 精制LMS，提取得率為 5 . 1 6 % 。

2.2LMS對Y79細胞增殖的影響

由表2可知，LMS處理Y79細胞 2 4 h 后，100、2 0 0 μ g / m L 組的細胞存活率分別為 9 3 . 3 7 % . 8 9 . 1 3 % ，與對照組相比 （ 0 μ g / m L） ，差異無統計學意義（ P gt; 0.05）; 4 0 0 ， 8 0 0 μ g / m L 組的細胞存活率分別為7 8 . 2 7 % . 3 1 . 9 3 % ，明顯低于對照，且差異具有統計學意義 ）。LMS處理Y79細胞48和 后，不同濃度LMS均能降低Y79細胞的存活率，且與對照差異具有統計學意義（ ，以 4 0 0 ， 8 0 0 μ g / m L 的降低作用更明顯（ P lt; 0 . 0 1 ）。綜合考慮，后續選取濃度 4 0 0 μ g / m L 的LMS開展試驗。

2.3LMS對Y79細胞凋亡的影響

由圖1可知， 4 0 0 μ g / m L 的LMS處理Y79細胞，與對照組相比，LMS組細胞的凋亡、壞死明顯增多。隨著LMS干預時間的增加，細胞凋亡率逐漸增加。由表3可知， 4 0 0 μ g / m L 的LMS處理Y79細胞24、48和 后，細胞凋亡率分別為 1 5 . 5 9 % . 2 1 . 8 7 % 和2 9 . 0 0 % ，與對照差異均具有統計學意義（ （ P lt; 0 . 0 1 ） 。表明LMS可促進Y79細胞凋亡。

2.4LMS對Y79細胞基因表達量的影響

由圖2可知， 4 0 0 μ g / m L 的LMS處理Y79細胞 后，LMS組細胞的Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9基因的相對表達量明顯高于對照組，且差異具有統計學意義（ Plt;0 . 0 5 ） 。表明LMS可上調Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9基因的表達。

2.5LMS對Y79細胞蛋白表達的影響

由圖3可知， 4 0 0 μ g / m L 的LMS處理Y79細胞 后，LMS組Y79細胞Cleavedcaspase 、Cleavedcaspase 和Cleavedcaspase 蛋白的表達量高于對照組，且差異具有統計學意義 （ P lt; 0 . 0 5 ） 。該結果與熒光定量PCR結果相符，表明LMS可能通過上調促凋亡蛋白Caspase-3、Caspase 和Caspase-9的表達，誘導Y79細胞凋亡。

3結論與討論

目前對RB的治療主要采用激光光凝術及眼動脈化療、玻璃體腔內化療等]。大多化療藥物具有較大的副作用，中藥治療具有療效好、副作用小和價廉等優點[12]。本研究探討了LMS對人視網膜母細胞瘤Y79細胞凋亡的影響，發現LMS可抑制Y79細胞增殖，誘導其凋亡，表明LMS可能具有開發抗RB治療藥物的潛力。半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族是誘導細胞凋亡的重要家族之一[13]，其中Caspase-8是啟動凋亡的重要因子，活化的Caspase-8（Cleavedcaspase-8）可引起Caspase成員的凋亡級聯反應，破壞細胞內的死亡結構蛋白及相關功能蛋白，從而引起細胞發生凋亡[4]。活化的Caspase-9（Cleavedcaspase-9）可裂解細胞生長蛋白，從而促進細胞凋亡[15]。Caspase-3幾乎參與了所有的調亡過程，活化的Caspase-8 和Caspase-9 能夠激活Caspase-3（Cleaved caspase ）從而加速細胞凋亡[]。本研究結果顯示，LMS可促進Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9基因的表達，上調Cleavedcaspase-3、Cleavedcaspase-8和Cleavedcaspase-9蛋白的表達，表明LMS可能通過促進相關細胞凋亡因子的表達，從而誘導Y79細胞凋亡。

綜上，本研究探討了LMS對人視網膜母細胞瘤Y79細胞凋亡的影響，結果表明，LMS可抑制Y79細胞增殖，誘導Y79細胞凋亡，其作用機制可能與Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9基因和蛋白表達量上調有關。研究結果為LMS作為臨床上治療RB的新型藥物的開發提供參考。

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（責任編輯.坦立菜）